全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 416−423 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技支撑计划项目(2010BAD01B10), 国家自然科学基金项目(31301357), 江苏省自然科学基金项目(BK20130719)和江
苏省农业科技自主创新资金项目(CX(13)5009)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张洁夫, E-mail: jiefu_z@163.com, Tel: 025-84390657
第一作者联系方式: E-mail: matian29@126.com (马田田); p3072001@aliyun.com (彭琦) **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-07-02; Accepted(接受日期): 2013-10-28; Published online(网络出版日期): 2014-01-17.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140117.1627.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00416
核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析
马田田 1,** 彭 琦 2,** 陈 松 2 张洁夫 2,*
1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095; 2江苏省农业科学院经济作物研究所 / 农业部长江下游棉花
与油菜重点实验室, 江苏南京 210014
摘 要: 菌核病是油菜主要病害, 至今尚未在油菜及相关植物中找到抗性基因。本研究利用 qRT-PCR 法比较了抗病
品种宁 RS-1 和感病品种 APL01在接种核盘菌后 0~48 h内 11个防御相关基因的表达差异, 以揭示抗病品种宁 RS-1
的抗病机制。结果表明, 4个基因(PGIP、Cu/ZnSOD、OXO和 GLP)在核盘菌诱导前后抗、感品种内表达量均较高, 且
抗病品种的表达量显著高于感病品种, 尤其是 PGIP基因, 抗病品种宁 RS-1在 24 h的表达量为诱导前的 170.4倍, 而
感病品种仅为诱导前的 3.5 倍, 该时期抗病品种 PGIP 的表达量为感病品种的 1299.4 倍; 2 个基因(LOX2 和 PDF1.2)
在诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 但抗、感品种间表达量差异显著; 5个基因(FeSOD、PAL、EDS1、PR1和
EIN3)诱导前后抗、感品种内的表达量均较低, 且抗、感品种间的表达量差异不显著。推测抗病品种宁 RS-1 对菌核
病的抗性可能是由于 PGIP的上调表达, 抑制了核盘菌 PG蛋白对侵染部位油菜组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜
菌核病的发生与蔓延。
关键词: 核盘菌; 甘蓝型油菜; 防御基因; 表达差异
Differential Expression of Defense Related Genes in Brassica napus Infected by
Sclerotinia sclerotiorum
MA Tian-Tian1,**, PENG Qi2,**, CHEN Song2, and ZHANG Jie-Fu2,*
1 National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Innovation, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 Key Laboratory of
Cotton and Rapeseed, Ministry of Agriculture / Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China
Abstract: Sclerotinia stem rot is the main disease of rapeseed. Up to date, genes involved in defending Sclerotinia sclerotiorum
have not been found in rapeseed and some other related plants. In order to reveal the disease resistance mechanism, we inoculated
Sclerotinia sclerotiorum on the stems of resistant variety Ning RS-1 and susceptible one APL01, and compared eleven defensive
related genes’ expression profiles between two varieties during the period of inoculation by using fluorescence quantitative PCR.
Results showed that four genes (PGIP, Cu/ZnSOD, OXO, and GLP) were highly expressed both in Ning RS-1 and APL01, and the
expression in Ning RS-1 was much higher than that in APL01. Especially, PGIP’s expression at 24 hours after inoculation (hai)
with Sclerotinia sclerotiorum was 170.4 times as high as that at 0 hai in Ning RS-1, while it was only 3.5 times in APL01, and
PGIP’s expression in Ning RS-1 was 1299.4 times as high as that at 24 hai in APL01. Two genes (LOX2 and PDF1.2) were ex-
pressed low both in Ning RS-1 and APL01, but with significant difference between two varieties. Five genes (FeSOD, PAL, EDS1,
PR1, and EIN3) were also expressed low in Ning RS-1 and APL01, and without significant difference between two varieties. We
inferred that the reason of resistance against Sclerotinia sclerotiorum in Ning RS-1 is related to the up-regulated expression of
PGIP, which prevents the PG protein in pathogen from degrading the cell wall of infected host tissues, resulting in the inhibition
of incidence and spread of sclerotinia stem rot in rapeseed.
Keywords: Sclerotinia sclerotiorum; Brassica napus; Defense gene; Differential expression
第 3期 马田田等: 核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析 417


核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum (Lib) de Bary]是
一种常见的腐生型病原真菌[1], 其寄主范围非常广泛,
可感染 75个科, 278个属的 408个种和 42个亚种或
品种的植物[2]。核盘菌的致病机制比较复杂, 其致病
基因编码着侵染寄主所必需的一系列产物。研究表明
草酸(oxalic acid, OA)和细胞壁降解酶(cell wall degrade
enzymes, CWDEs)是核盘菌致病的重要因子[3-4], 通过
提高植物体内草酸氧化酶和细胞壁降解酶抑制蛋白
的表达可以有效抑制核盘菌的侵染[5-6]。
目前, 对油菜中与核盘菌侵染过程中植物组织
细胞内的分子变化及抗性相关基因的表达情况还知
之甚少 [7], 抗病相关基因的研究还停留在功能基因
的筛选与克隆阶段。Mei等[8]构建了抗、感菌核病甘
蓝 F2群体, 在 C09 染色体上获得 2 个主效 QTL。
Wen 等[9]利用蛋白组双向电泳技术比较了抗、感菌
核病甘蓝型油菜的蛋白质表达谱, 获得 20个与抗病
株系抗性相关的蛋白。刘仁虎等[10]以拟南芥 cDNA
芯片筛选核盘菌侵染时甘蓝型油菜的局部抗(耐)病
相关基因, 共获得在病斑周围局部组织中受核盘菌
胁迫后表达变化达 2倍以上的基因 61个。这些基因
中, 36个上调表达, 25个下调表达。通过分子标记或
者生物芯片技术分析得到的抗病相关基因很多, 但
是其中真正有应用价值的很少, 大部分是借鉴其他
植物中分离的基因再转化油菜, 研究其在油菜中的
抗病作用。因此, 抗病基因尤其是抗菌核病功能基因
的分离与应用仍将是近期内油菜抗病研究的重点[11]。
江苏省农业科学院经济作物研究所在育成抗菌
核病种质宁 RS-1 的基础上[12], 构建了宁 RS-1 接种
核盘菌前后的 SSH 文库, 获得了多个与植物抗病、
防御反应、信号传递等相关的基因[13]。为了进一步
研究这些基因在核盘菌侵染过程中的表达规律, 揭
示宁 RS-1 在核盘菌侵染过程中所涉及的防卫反应
和信号传递机制, 本研究筛选了多个防御相关基因
(表 1), 分析了抗病与感病油菜品种在接种核盘菌前
后不同时间内各基因的表达动态差异, 以期获得与
宁 RS-1抗菌核病密切相关的基因。

表 1 基因及其相关研究
Table 1 Gene and related research
基因
Gene
编码蛋白
Encoding protein
参考文献
Reference
Cu/ZnSOD
FeSOD
超氧化物歧化酶 Super oxide dismutase, SOD Gupta et al.[14]
Breusegem et al.[15]
OXO 草酸氧化酶 Oxalate oxidase, OXO Ramputh et al.[16]
GLP 类萌发素蛋白 Germin-like protein, GLP Dunwell et al.[17]
PAL L-苯丙氨酸解氨酶 L-phenylalanin ammo-nialyase, PAL Zhang et al.[18]
PGIP 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 Polygalacturonase-inhibiting protein, PGIP Hahn et al.[19]
EDS1 促病易感蛋白 Enhanced disease susceptibility 1, EDS1 Brodersen et al.[20]
PR1 病程相关蛋白 Pathogenesis related protein 1, PR1 Uknes et al.[21]
LOX 赖氨酸氧化酶 Lipoxygenase, LOX Feussner et al.[22]
EIN3 非敏感型乙烯转录因子 Ethylene-insensitive 3, EIN3 Xu et al.[23]
PDF1.2 植物防卫素蛋白 Plant defensins, PDF1.2 Penninckx et al.[24]

1 材料与方法
1.1 供试材料
抗菌核病品种宁 RS-1[25-26]、感病品种 APL01[27],
均由江苏省农业科学院经济作物研究所提供, 苗期
和花期菌核病接种鉴定表明, 这两品种间抗性差异
达极显著水平[28]。
供试菌株的菌核采自江苏省农业科学院试验
田油菜残茬, 经表面消毒, 并适量巴斯消毒液浸泡
3~5 min, 转入 75%乙醇漂洗数秒后迅速用无菌水洗
净。然后接种于马铃薯培养基(PDA)上, 萌发菌丝后
于 4℃保存用作菌源, 接种前 3 d继代一次备用。
1.2 试验方法
1.2.1 病菌接种和取样 选取终花期的油菜为被
接种植株, 接种前将牙签置盛有 PDA培养液的烧瓶
中, 浸泡 24 h, 再经灭菌备用。将菌丝块接种到 PDA
平板中央, 把牙签呈放射状均匀摆放在菌丝块周围,
每个培养皿 20 根, 活化菌丝培养 2 d 后用于接种,
用消毒电钻在离地面 50 cm 的茎杆处打孔, 插入带
菌牙签。每个品种各接种长势一致的 3 株植株。分
别在接种前和接种后 12、24和 48 h取主轴及上部 2
个分枝同一部位开花后 5 d 的幼嫩角果。装入离心
418 作 物 学 报 第 40卷


管后迅速冷冻于液氮中, –80℃保存。
1.2.2 总 RNA 提取及 cDNA 制备 采用
Promega 公司生产的 SV total RNA 提取试剂盒
(Z3105), 按其说明书提取幼嫩角果样品的 RNA,
样品起始量为 100 mg。以琼脂糖凝胶电泳检测 RNA
质量, 紫外分光光度计检测 RNA 总浓度, 并根据结
果用 DEPC水调整 RNA终浓度至 250 ng μL–1。采用
TaKaRa公司生产的 RT Reagents反转录试剂盒合成
cDNA, RT 反应液含 5 × Prime Script buffer (for
Real-time PCR) 2 μL和总 RNA 2 μL, 用 RNase Free
ddH2O 补充至总体积 10 μL, 将反应后得到的
cDNA保存在–20℃冰箱备用。
1.2.3 引物设计 根据在 NCBI 网站检索得到的
各基因序列, 利用 Primer Premier 5.0软件设计并筛选,
获得荧光定量 PCR 扩增所用的特异性引物, 并由华
大基因科技有限公司合成引物, 引物序列见表 2。

表 2 荧光定量 PCR引物序列
Table 2 Primers used for qRT-PCR
基因
Gene
基因 ID
Gene ID
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
Tm
(℃)
扩增片段
Size (bp)
Cu/ZnSOD AY970822 F: GACGAAGAGAGTGATGTAA; R: AAGCAATGAGCCACTAAGC 56 109
FeSOD EF634058 F: AATCAGCAGAGAAGACGCTC; R: TAGATTGTCCACGTAGCCTC 60 195
OXO U21743 F: CTACTTTCCTACCGCCT; R: GACAAGAAGAATCCATC 52 127
GLP BNU21743 F: TTCCTACCGCCTGCTACA; R: GACAAGACAAGAAGAATCC 54 122
PAL DQ341309 F: ATCCCTCCATAATCTCCTAC; R: GCCACCGTGACATTCTTG 58 115
PGIP AF529691 F: CAACAAGTGCCTATGTGATG; R: CCGAATAGAACGTCATACAG 58 123
EDS1 AJ620884 F: CTTACAACACCGACCACTTC; R: ACGCTTCATCTTGGTTTCTC 60 132
PR1 U70666.1 F: ATGTGAACGAGAAGCCTTAC; R: TGCCAGTAAACTAGGTAACG 58 172
LOX2 408544 F: TGTTTGAATGAGCCTCCGAGT; R: CTTCGAAAGCGTCAAAAAGGTG 62 127
EIN3 532014 F: CGAGACAGCGGCTTACCCTA; R: GCAGTTGACTTTCCGTGACCAT 64 146
PDF1.2 AY884023 F: GCACGAAACGAAATAATGAGTC; R: TGACCTCTCGCACAACTTAG 58 115
ACTIN AF111812 F: CGAGGCTCCTCTTAACCCAAAGG; R: CACCAGAATCCAGCACAATACCG 60 152

1.2.4 荧光定量 PCR 采用 ABI 公司的 7500 型荧
光定量 PCR仪, 参照 TaKaRa公司的 Prime Script RT
Master Mix 试剂盒 (DRR036A)介绍的方法进行
qRT-PCR。以油菜 Actin基因(AF1l1812)作为内标基因,
采用 2–ΔΔCT 法分析数据, 荧光染料为 SYBR Green I,
分别检测抗病相关基因在油菜接种核盘菌前后的相对
表达量的动态变化, 进一步研究菌核病诱导后不同抗
性品种中基因的表达差异。实时荧光定量 PCR反应体
系含 SYBR Premix Ex Taq 10 μL、10 μmol L–1上下游
引物各 0.4 μL、cDNA模板 2 μL, 以 ddH2O补充体积
至 20 μL。PCR反应程序为预变性 95 , 30 s℃ ; 95 5 s, ℃
60 34 s℃ 。根据不同引物调整退火温度, 每个样品设 3
次技术重复, 试验共设 3次生物学重复。
2 结果与分析
2.1 油菜总 RNA检测
取接种核盘菌前后不同时间的宁 R S - 1 和
APL01样品, 提取总 RNA, 经琼脂糖凝胶电泳检测,
样品的总 RNA 条带清晰(图 1), 质量较好; 总 RNA
紫外分光光度计检测, A260nm/A280nm比值为 2.0, 表明

图 1 油菜角果总 RNA琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Electrophoretogram of total RNA from silique of
Brassica napus L.

总 RNA纯度较高, 可用于荧光定量 PCR分析。
2.2 油菜接种核盘菌后抗氧化相关酶基因的表
达差异
Cu/ZnSOD基因的表达量在抗、感品种内均呈先
降后升的变化趋势, 且在 24~48 h出现峰值。但抗病
品种宁 RS-1在 12~48 h内一直呈上升的趋势, 48 h
的表达量超过接种前; 而感病品种 APL01在 48 h后
又回到了接种前水平(图 2)。接种前后 Cu/ZnSOD基
因在宁RS-1中的表达量均高于APL01, 接种后 48 h,
Cu/ZnSOD在抗病品种宁 RS-1的表达量为感病品种
APL01 的 4.7 倍(表 3), 但同一品种接种前后表达量
变化不大。
第 3期 马田田等: 核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析 419


FeSOD 在抗病品种宁 RS-1 中的表达一直处于
较低水平且变化幅度不大, 只在 24 h 后略有上升,
但 48 h 后又恢复到接种前水平。FeSOD 的表达在
感病品种 APL01 中同样处于较低水平, 但显著高
于在抗病品种宁 RS-1 中, 且在感染后呈现上升趋
势(图 2)。

图 2 不同油菜品种接种核盘菌后 Cu/ZnSOD和 FeSOD的表达差异
Fig. 2 Expression of Cu/ZnSOD and FeSOD in different rapeseed varieties infected by S. sclerotiorum

表 3 核盘菌诱导下抗、感品种相关基因的表达差异比较
Table 3 Comparison of gene expression between resistant and susceptible varieties infected by S. sclerotiorum
表达方式
Gene expression mode
接种前后表达量最大差异比率
RMGEI
品种间表达量最大差异比率
RMGEV 基因
Gene
Ning RS-1 APL01 Ning RS-1 APL01
时间段
Period (h)
比率
Ratio
Cu/ZnSOD Lowest at 12 h, highest at 48 h Lowest at 12 h, highest at 24 h 1.98 2.44 24–48 4.67
FeSOD Highest at 24 h Lowest at 0 h, highest at 48 h 1.84 1.81 24–48 2.95
OXO Lowest at 0 h, highest at 24 h Lowest at 0 h, highest at 48 h 2.48 3.67 24–48 2.40
GLP Lowest at 0 h, highest at 24 h Lowest at 0 h, highest at 48 h 2.40 4.24 24–48 2.15
PAL Lowest at 12 h, highest at 48 h Lowest at 12 h, highest at 48 h 3.04 3.91 24–48 2.16
PGIP Lowest at 12 h, highest at 24 h Lowest at 12 h, highest at 24 h 170.45 13.10 24–48 1299.49
EDS1 Lowest at 12 h, highest at 24 h Lowest at 12 h, highest at 48 h 2.61 4.11 12–24 3.14
PR1 Lowest at 12 h, highest at 0 h Lowest at 12 h, highest at 0 h 2.62 4.54 0–12 2.30
LOX2 Lowest at 12 h, highest at 48 h Lowest at 12 h, highest at 24 h 6.15 3.72 24–48 4.06
EIN3 Lowest at 12 h, highest at 48 h Lowest at 12 h, highest at 24 h 1.32 1.23 24–48 1.39
PDF1.2 Lowest at 12 h, highest at 48 h Lowest at 24 h, highest at 48 h 3.22 2.15 24–48 6.95
RMGEI: ratio of max gene expression between before and after inoculations; RMGEV: ratio of maximum gene expression between varieties.

2.3 油菜接种核盘菌后防御相关酶基因的表达
差异
抗病品种宁 RS-1 在接种 24 h 内 OXO 和 GLP
表达量均持续上升, 24 h 的表达量分别为接种前的
2.3 倍和 2.4 倍, 之后表达量逐渐下降, 感病品种
APL01接种核盘菌后, OXO和 GLP表达量均呈现先
升后降再升的趋势, 48 h表达量最高, 分别为接种前
的 3.67倍和 3.91倍(图 3和表 3)。抗、感品种间 OXO
和 GLP 表达量在时间上存在差异, 而表达量没有显
著差异。这说明在抗、感品种间 OXO 和 GLP 诱导
防御反应的快慢存在差异。OXO与 GLP的表达变化
趋势在抗、感品种间的表现基本一致, OXO 与 GLP
基因同源, 同属 GLP 家族成员, 这也从侧面证明了
2种抗病基因经核盘菌诱导表达的同步性。
PAL 基因在同一个品种接种前后表达量差异显
著, 抗病品种宁 RS-1接种 48 h内持续升高, 达接种
前的 2.6倍, 而感病品种 APL01在接种 24 h后表达
量即不再升高。抗病品种宁 RS-1和感病品种 APL01
在接种诱导 48 h内, PGIP的表达均呈先降后升再降
的变化趋势, 24 h达最高峰值, 接种前后 PGIP在抗
病品种宁 RS-1中的表达差异极显著, 24 h表达量为
接种前的 170.4倍, 而 PGIP在感病品种 APL01中表
达量在接种前后差异较小, 24 h 表达量仅为接种前
的 3.5 倍, 并且 PGIP 基因在抗病品种宁 RS-1 的表
达量远高于感病品种 APL01, 同时期最高差异达
1299.4倍(图 3和表 3)。
2.4 油菜接种核盘菌后水杨酸(SA)介导的抗病
信号相关基因表达差异
接种前 EDS1 基因在抗、感品种间的表达量差
异不显著; 接种后 EDS1基因在抗、感品种中都能被
420 作 物 学 报 第 40卷



图 3 不同油菜品种接种核盘菌后 OXO、GLP、PAL与 PGIP的表达差异
Fig. 3 Expression of OXO, GLP, PAL, and PGIP in different rapeseed varieties infected by S. sclerotiorum

图 4 不同油菜品种接种核盘菌后 EDS1和 PR1的表达差异
Fig. 4 Expression of EDS1 and PR1 in different rapeseed varieties infected by S. sclerotiorum

核盘菌诱导表达, 且品种间表达量差异达到显著水
平, 其中抗病品种宁 RS-1在接种后 24 h表达量达最
大值, 然后迅速降低, 而感病品种 APL01 在接种后
48 h表达量达最大值, 表明 EDS1作为一种信号分子,
在抗、感品种中可能存在不同的诱导表达途径。接
种后 48 h内, PR1在抗、感品种间的表达虽在某一
时间段略有起伏, 但总体上均处于下调状态, 说明
PR1在核盘菌诱导后表达受到了抑制(图 4和表 3)。
2.5 油菜接种核盘菌后 JA/ET 介导的抗病信号
相关基因表达差异
接种后 24 h内, 抗、感品种中相关基因表达均
呈先降后升趋势, 且表达量基本保持一致, 但在侵
染后期, 抗病品种宁 RS-1的 LOX2表达量迅速上升,
至 48 h达最大值, 表达量是诱导前的 2.0倍, 而感病
品种 APL01的 LOX2表达量在 48 h有所下降, 表达
量仅为抗病品种的 1/4 倍。EIN3 的表达量在接种
0~48 h 内呈先略降后略升的趋势, 但变化不大, 且
抗、感品种间的趋势基本一致。抗病品种宁 RS-1在
接种 12 h后, PDF1.2的表达量有所下降, 随后迅速
增加, 至 48 h表达量达到最大值, 为接种前的 2.2倍;
而感病品种 APL01 在接种前后的 PDF1.2 表达量没
有明显变化, 一直处于较低水平。由此可见, 核盘菌
诱导可激活油菜的 JA/ET 途径, 抗病品种的 LOX2
和 PDF1.2基因表达得到增强(图 5和表 3)。
3 讨论
3.1 核盘菌诱导下油菜抗氧化相关酶基因的表达
在植物中, Cu/ZnSOD是 3种超氧化物歧化酶中
含量最丰富的一类, 主要存在于叶绿体、胞质、细
胞核和质外体中[14]。FeSOD每个亚基都只含一个金
属离子, 从 FeSOD 的一些生化指标及前导序列推测,
该酶存在于叶绿体中[15]。齐绍武等[29]研究表明, 油
菜抗、感菌核病品种组织内的 SOD 活性差异显著,
SOD活性与品种抗性显著相关。接种核盘菌后, SOD
活性均发生变化。叶绿体内氧自由基的增加常引起
FeSOD 基因表达, 细胞质氧自由基增加会引起细胞
质 Cu/ZnSOD 基因的表达[14]。本研究表明, 接种核
盘菌后, FeSOD在抗、感品种间的表达量均较低, 且
品种间差异不显著; 而 Cu/ZnSOD 在抗病品种中表
达增强, 且 48 h 表达量显著高于感病品种, 这一结
果与杨鸯鸯等[30]对 Cu/ZnSOD 的研究结果相符, 由
此可以推断 Cu/ZnSOD 基因的表达与活性氧的变化
第 3期 马田田等: 核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析 421



图 5 不同油菜品种接种核盘菌后 LOX、EIN3和 PDF1.2的表达差异
Fig. 5 Expression of LOX, EIN3, and PDF1.2 in different rapeseed varieties infected by S. sclerotiorum

相关, 该基因对清除活性氧的能力比 FeSOD 强, 在
油菜抗菌核病中具有重要作用。
3.2 核盘菌诱导下与油菜防御相关酶基因的表达
草酸氧化酶 (OXO)可以分解病菌分泌的草酸 ,
生成 CO2 和过氧化氢(H2O2), 从而限制病菌的生长;
草酸被降解后生成的 H2O2 是植物和病原微生物互
作中快速合成的一种早期活性氧类, 它在植物受病
原微生物侵染后可引发一系列反应, 如直接杀死病
原菌、作为超敏反应组织者诱导细胞壁结构蛋白的
氧化交联从而阻止病菌侵入、诱导植保素生成以及
最终诱导系统获得性抗性等[31]。GLP被称为类萌发
素蛋白, 与草酸氧化酶基因同源, 是多基因编码的
一种细胞壁糖蛋白[32]。已有研究表明, 在病原菌侵
染期间, GLP 可能起结构作用, 作为靶标进行蛋白
交联加固细胞壁。本研究表明, 接种前后 OXO 与
GLP 表达量变化趋势基本一致, 且在抗、感品种间
的表达差异不显著。根据此前的研究, OXO 与 GLP
同源, 均属于 GLP 基因家族, 因此, 两基因在油菜
的防卫反应中可能存在某种协作关系, 另外, 从基
因的表达量来看, 在抗病品种中, OXO与 GLP主要
在接种后的 24 h内表达, 推测两基因可能在防卫反
应的前期发挥作用。
研究发现, 植物与病原物互作过程中, 会伴随
着 PAL 活性的升高, 同时有木质素的积累及酚类物
质和植保素的合成, 因此PAL与植物抗病性有着密切
的关系。植物 PAL 基因的表达受植物病原物及病菌
诱导物乙烯等的诱导调控, 并与品种抗性相关[33]。
本研究结果表明, 接种核盘菌后, PAL在抗、感品种
中均被诱导表达, 后期在抗病品种的表达量迅速上
升, 且显著高于其在感病品种的表达水平。由此推
测 PAL 与植物抗病性有着密切的关系, 抗性品种在
接种后期才诱导产生大量的 PAL, 可能是由于激活
了乙烯信号途径, 随着乙烯合成的增加导致 PAL 的
积累。
核盘菌侵染寄主植物时能分泌果胶酶, 尤其是
内切-多聚半乳糖醛酸酶(endo-PGs), 而 PG 是核盘
菌导致受感染的植物组织出现水浸状病症的主要原
因 [34], 在病菌感染植物过程中起重要作用, 在多种
植物中发现 PGIPs 是一种细胞壁蛋白, 能够专一性
抑制真菌病原菌的 PGs。PGIPs 抑制真菌的 PG, 有
利于寡聚半乳糖醛酸的积累, 而寡聚半乳糖醛酸是
植物防御反应的激发子[35], 激发子通过信号传导途
径, 将信号传递到细胞, 诱导 PGIP基因的表达。本
研究结果表明, 接种前后 PGIP 在抗病品种宁 RS-1
中表达差异极其明显, 24 h表达量为接种前的 170.4
倍, 而在感病品种 APL01 中表达量差异相对较小,
24 h 表达量仅为接种前的 3.5 倍, 同时 PGIP 在宁
RS-1的表达量远远高于 APL01, 24 h达 1299.4倍。
由此可以推断, PGIP在油菜抵御真菌侵染的防卫反
应前期发挥着关键性的作用, PGIP诱导表达产生的
PGIPs 作为一种糖蛋白能够特异性地识别真菌分泌
的 PGase, 并与其形成二聚体复合物, 从而抑制了
PGase 的活性, 最终延缓甚至抑制了病原真菌对植
物细胞壁的降解, PGIP的这种生物学特性决定了它
在植物抵御真菌病害的发生中起着重要作用。这也
证实了周晓婴等[36]的研究结果。
3.3 核盘菌诱导下与油菜防卫反应信号传导相
关的基因表达
核盘菌侵染拟南芥时激活了 JA/ET 防卫途径,
而非 SA途径。一些研究者提出, 植物防卫反应中依
赖于 SA 途径的防卫反应作用于活体营养病原菌,
而依赖于 JA/ET 途径的防御反应作用于死体营养病
原菌。并且 SA和 JA途径各自诱导表达的一些基因
会相互抑制[37]。另有研究表明, JA能够抑制依赖 SA
途径的标志基因 PR 的表达[37]。本研究中抗病品种
的PDF1.2基因可被核盘菌诱导而增强表达, 但在感
病品种中则没有显著变化, 一直处于较低水平。接
种病菌后, PR1在抗、感品种间的表达总体上均处于
下调状态, 推测核盘菌接种可能激活了油菜 JA/ET
信号途径, 同时抑制了 SA信号途径。
422 作 物 学 报 第 40卷


任秋红的研究表明 , 在油菜中核盘菌能激活
LOX2基因的表达, 受茉莉酸正调控[38]。刘胜毅等[23]
认为油菜 EIN3及拟南芥 EIN3基因在对死体营养型
病原菌的抗性中发挥着重要作用, 植物可能通过上
调 EIN3基因的表达来抵御病原菌的侵染。本研究结
果表明, 核盘菌诱导抗病品种中 LOX、EIN3表达量
的变化趋势与 JA/ET 途径的标记基因 PDF1.2 保持
一致, 且均在 48 h达最大值, 其中 LOX、PDF1.2在
抗病品种中的表达量明显高于感病品种, 由此推测,
LOX、EIN3可能参与了油菜 JA/ET介导的抗病信号
的启动与传导, LOX、PDF1.2 的高表达在油菜对菌
核病抗性中起重要作用, 油菜可能通过上调 LOX2、
PDF1.2基因的表达来抵御病原菌的侵染。
EDS1 是一种信号分子, 其编码的蛋白与脂肪
酶同族, 可抵制植物对活体营养病原菌产生抗性(包
括 HR 的产生)[39], 但其调控产生的 HR 反应有利于
死体营养病原菌核盘菌在油菜上定殖, 接种后期感
病品种 EDS1 上调表达可能是核盘菌利用了 SA 与
JA/ET 信号的抑制效应以增加致病性[40], 同时也是
SA防卫途径的激发子和 JA/ET的抑制子[20]。Kamal
等[41]发现, B. cinerea激活了EDS1的表达, 将该基因
沉默后, 烟草对 B. cinerea抗性得到增强。本研究发
现, 接种核盘菌后, 抗病品种 EDS1基因先是被诱导
表达, 24 h达最大值, 随后表达水平降低, 恢复到接
种前水平。感病品种在接种病菌后, EDS1基因的表
达水平先下调, 随后一直上调。推测抗病品种被核
盘菌诱导后 , 随着防御反应体系的激活 , 抑制了
EDS1基因的表达, 从而减少细胞死亡的程度。
4 结论
PGIP、Cu/ZnSOD、OXO、GLP、LOX2、PDF1.2
等基因可能与油菜抗菌核病防卫反应相关, 推测抗
病品种宁 RS-1对菌核病的抗性可能是由于 PGIP的
上调表达, 抑制了核盘菌 PG 蛋白对侵染部位油菜
组织细胞壁的降解, 从而抑制了油菜菌核病的发生
与蔓延。
References
[1] 李丽丽. 世界油菜病害研究概述. 中国油料, 1994, 16(1): 79–82
Li L L. The review of the world’s rapeseed disease. Chin J Oil Crop
Sci, 1994, 16(1): 79–82 (in Chinese with English abstract)
[2] Purdy L H. Sclerotinia sclerotiorum: history, diseases and sympto-
matology, host range geographic distribution, and impact. Phyto-
pathology, 1979, 69: 875–880
[3] Rajane L G, Henrik U S. Oxalate production by Sclerotinia scle-
rotiorum deregulates guard cells during infection. Plant Physiol,
2004, 136: 3703–3711
[4] Collmer A, Keen N T. The role of pectic enzymes in plant patho-
genesis. Annu Rev Phytopathol, 1986, 24: 383–409
[5] Steffen R, Friederike E M, Daguang C. Members of the germin-like
protein family in Brassica napus are candidates for the initiation of
an oxidative burst that impedes pathogenesis of Sclerotinia scle-
rotiorum. J Exp Bot, 2012, 63: 5507–5519
[6] Zafer D B, Roger R, George G K, Dwayne D H. Brassica napus
polygalacturonase inhibitor protein inhibit Sclerotinia sclerotiorum
polygalacturonase enzymatic and necrotizing activities and delay
symptoms in transgenic plants. Can J Microbiol, 2013, 59: 79–86
[7] Li R, Rimmer R, Buchwaldt L, Sharp A G. Interaction of Sclerotinia
sclerotiorum with a resistant Brassica napus cultivar: expressed
sequence tag analysis identifies genes associated with fungal
pathogenesis. Fungal Genet Biol, 2004, 41:735–753
[8] Mei J Q, Ding Y J, Liu S Y, Disi J O, Li J, Liu L, Liu S, Mckay J,
Qian W. Identification of genomic regions involved in resistance
against Sclerotinia sclerotiorum from wild Brassica oleracea.
Theor Appl Genet, 2013, 126: 549–556
[9] Wen L, Tan T L, Shu J B, Chen Y, Liu Y, Yang Z F, Zhang Q P, Yin
M Z, Tao J, Guan C Y. Using proteomic analysis to find the proteins
involved in resistance against Sclerotinia sclerotiorum in adult
Brassica napus. Eur J Plant Pathol, 2013, DOI: 10.1007/
s10658-013-0262-z
[10] 刘仁虎, 赵建伟, 肖勇, 孟金陵. 拟南芥 cDNA芯片和油菜一拟
南芥比较作图相结合筛选甘蓝型油菜抗菌核病先验基因. 中国
科学 C辑: 生命科学, 2005, 35: 13–21
Liu R H, Zhao J W, Xiao Y, Meng J L. Identification of prior can-
didate genes for Sclerotinia local resistance in Brassica napus using
Arabidopsis cDNA microarray and Brassica-Arabidopsis compara-
tive mapping. Sci China Ser C: Life Sci, 2005, 35: 13–21 (in Chi-
nese)
[11] 刘丹, 刘贵华, 王汉中. 油菜抗性相关基因的分离及其基因工
程研究进展. 中国农业科技导报, 2008, 10(3): 6–11
Liu D, Liu G H, Wang H Z. Isolation of resistant genes and their
gene engineering research developments in rapeseed. J Agric Sci
Technol, 2008, 10(3): 6–11 (in Chinese with English abstract)
[12] 张洁夫, 傅寿仲, 戚存扣, 浦惠明, 陈玉卿, 顾炳朝, 陈新军,
高建芹. 油菜抗菌核病材料宁 RS-1的选育与利用. 中国油料作
物学报, 2002, 24(3): 6–9
Zhang J F, Fu S Z, Qi C K, Pu H M, Chen Y Q, Gu B C, Chen X J,
Gao J Q. Breeding and utilization of Ning RS-1 resistance to Scle-
rotinia stem rot in rapeseed (B. napus L.). Chin J Oil Crop Sci,
2002, 24(3): 6–9 (in Chinese with English abstract)
[13] 周晓婴, 陈松, 戚存扣. 核盘菌诱导下甘蓝型油菜宁 RS-1 的
SSH文库构建. 中国油料作物学报, 2011, 33: 157–161
Zhou X Y, Chen S, Qi C K. Construction of SSH cDNA library
from Ning RS-1 after inoculation of Sclerotinia sclerotiorum. Chin
J Oil Crop Sci, 2011, 33: 157–161 (in Chinese with English ab-
stract)
[14] Gupta A S, Heinen J L, Holaday A S, Burke J J, Allen R D. In-
creased resistance to oxidative stress in transgenic plants that
overexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc Natl
Acad Sci USA, 1993, 90: 1629–1633
[15] Breusegem F V, Slooten L, Stassart J M, Moens T, Botterman J,
Van Montaqu M, Inzé D. Over production of Arabidopsis thaliana
FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize. Plant
Cell Physiol, 1999, 40: 515–523
第 3期 马田田等: 核盘菌诱导下甘蓝型油菜防御相关基因表达差异分析 423


[16] Ramputh A I, Arnason J T, Cass L. Reduced herbivory of the Euro-
pean corn borer (Ostrinia nubilalis) on corn transformed with ger-
min, a wheat oxalate oxidase gene. Plant Sci, 2002, 162: 431–440
[17] Dunwell J M. Microbial relatives of the seed storage proteins of
high plants: conservation of structure and diversification of function
during evolution of the cupin superfamily. Microbiol Mol Biol Rev,
2000, 64: 153–179
[18] 张宽朝, 金青, 蔡永萍, 林毅. 苯丙氨酸解氨酶与其在重要次生
代谢产物调控中的作用研究进展. 中国农学通报, 2008, 24(12):
59–62
Zhang K C, Jin Q, Cai Y P, Lin Y. Research progress of PAL and its
control function of important secondav metabolltes. Chin Agric Sci
Bull, 2008, 24(12): 59–62 (in Chinese with English abstract)
[19] Hahn M G, Bucheli P, Cervone F. The roles of cell wall constituents
in plant pathogen interactions. Plant Microbe Interact, 1989, 3:
131–181
[20] Brodersen P, Petersen M, Bjorn N H, Zhu S, Newman M A, Shokat
K M, Rietz S, Parker J, Mundy J. Arabidopsis MAP kinase 4 regu-
lates salicylic acid and jasmonic acid/ethylene-dependent responses
via EDS1 and PAD4. Plant J, 2006, 47: 532–546
[21] Uknes S, Mauch-Mani B, Moyer M, Potter S, Williams S, Dincher
S, Chandler D, Slusarenko A, Ward E, Ryals J. Acquired resistance
in Arabidopsis. Plant Cell, 1992, 4: 645–656
[22] Feussner I, Kiihn H, Wasternack C. Lipoxygenase-dependent deg-
radation of storage lipids. Trends Plant Sci, 2001, 6: 268–273
[23] Xu L M, Huang J Y, Liu X Q, Qin R, Liu S Y. Cloning of Brassica
napus EIN3 gene and its expression induced by Sclerotinia scle-
rotiorum. Agric Sci & Tech, 2009, 10(2): 33–36
[24] Penninckx I A, Thomma B P, Buchala A, Métraux J P, Broekaert W
F. Concomitant activation of jasmonate and ethylene response
pathways is required for induction of a plant defensin gene in
Arabidopsis. Plant Cell, 1998, 10: 2103–2113
[25] Zhao J, Meng J. Detection of loci controlling seed glucosinalate
content and their association with Sclerotinia resistance in Brassica
napus. Plant Breed, 2003, 122: 19–23
[26] 王心宇, 杨恩东, 戚存扣, 陈松, 张洁夫, 杨清. 油菜 cDNA 表
达文库构建及核盘菌致病因子互作蛋白的筛选与鉴定. 作物学
报, 2008, 34: 192–197
Wang X Y, Yang E D, Qi C K, Chen S, Zhang J F, Yang Q. Con-
struction of cDNA expression library of oilseed rape and screening
and identification of interaction partner of PG, a virulence factor
from Sclerotinia sclerotiorum. Acta Agron Sin, 2008, 34: 192–197
(in Chinese with English abstract)
[27] 张洁夫, 傅寿仲, 戚存扣, 浦惠明, 伍晓明. 甘蓝型油菜无花瓣
近等基因系的选育研究初报. 中国油料作物学报, 2002, 24(2):
15-21
Zhang J F, Fu S Z, Qi C K, Pu H M, Wu X M. Preliminary report of
breeding for near-isogenic lines of apetalous in rapeseed (B. napus
L.). Chin J Oil Crop Sci, 2002, 24(2): 15–21 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[28] 马田田. 甘蓝型油菜抗菌核病 QTL 定位及相关基因表达分析.
南京农业大学硕士学位论文, 2012
Ma T T. Mapping of QTLs Associated with Disease Resistance to
Sclerotinia sclerotiorum in Brassica napus and Expression Analysis
of Resistance Related Gene. MS Thesis of Nanjing Agricultural
University, Nanjing, China, 2012 (in Chinese with English abstract)
[29] 齐绍武, 官春云, 刘春林. 甘蓝型油菜品系一些酶的活性与抗
菌核病的关系. 作物学报, 2004, 30: 270–273
Qi S W, Guan C Y, Liu C L. Relationship between some enzyme ac-
tivity and resistance to Sclerotinia sclerotiorum of rapeseed cultivars.
Acta Agron Sin, 2004, 30: 270–273 (in Chinese with English abstract)
[30] 杨鸯鸯, 李云, 丁勇, 徐春雷, 张成桂, 刘英, 甘莉. 甘蓝型油
菜Cu/ZnSOD和 FeSOD基因的克隆及菌核病菌诱导表达. 作物
学报, 2009, 35: 71–78
Yang Y Y, Li Y, Ding Y, Xu C L, Zhang C G, Liu Y, Gan L. Cloning
of Cu/Zn-Superoxide dismutase of Brassica napus and its induced
expression by Sclerotinia sclerotiorum. Acta Agron Sin, 2009, 35:
71–78 (in Chinese with English abstract)
[31] 郭泽建, 李德葆. 活性氧与植物抗病性. 植物学报, 2000, 42:
881–891
Guo Z J, Li D B. Active oxygen species in plant disease resistance.
Acta Bot Sin, 2000, 42: 881–891 (in Chinese with English abstract)
[32] Carter C, Thornburg R W. Germin-like protein: structure, phyolo-
geny and functin. J Plant Biol, 1999, 42: 97–108
[33] 曾永三, 王振中. 苯丙氨酸解氨酶在植物抗病反应中的作用.
仲恺农业技术学院学报, 1999, 12(3): 56–65
Zeng Y S, Wang Z Z. Role of phenylalanine ammonia-lyase in
plant disease resistance. J Zhongkai Agrotech Coll, 1999, 12(3):
56–65 (in Chinese with English abstract)
[34] Favaron F, Castiglioni C, Dilenna P. Inhibition of some rot fungi
polygalacturonases by Allium cepa L. and Allium porrum L. ex-
tracts. Phytopathology, 1993, 139: 201–206
[35] Aya A, Jürgen E, Henrik U, Stotz. Interaction between polygalac-
turonase-inhibiting protein and jasmonic acid during defense acti-
vation in tomato against Botryis cinerea. Eur J Plant Pathol, 2010,
128: 423–428
[36] 周晓婴, 陈松, 戚存扣. 核盘菌多聚半乳糖醛酸酶基因克隆及
诱饵蛋白表达载体构建. 江苏农业科学, 2010, 26(4): 25–28
Zhou X Y, Chen S, Qi C K. Cloning of PG from Sclerotinia scle-
rotiorum and construction of a bait plasmid. Jiangsu Agric Sci,
2010, 26(4): 25–28 (in Chinese with English abstract)
[37] Corné M J, Antonio L R, Sjoerd V D, Van W S. Networking by
small-molecule hormones in plant immunity. Nat Chem Biol, 2009,
5: 308–316
[38] 任秋红, 黄军艳, 毛晗, 田保明, 刘胜毅. 甘蓝型油菜 LOX2 基
因在MeJA、BTH和核盘菌诱导下的表达. 河南农业科学, 2010,
7(1): 22–25
Ren Q H, Huang J Y, Mao H, Tian B M, Liu S Y. Brassica napus
LOX2 gene expression induced by methyl jasmonate (MeJA), ben-
zothiadiazole (BTH), and Sclerotinia sclerotiorum. J Henan Agric
Sci, 2010, 7(1): 22–25 (in Chinese with English abstract)
[39] Wiermer M, Feys B J, Parker J E. Plant immunity: the EDS1 regu-
latory node. Curr Opin Plant Biol, 2005, 8: 383–389
[40] 姜伟丽. 油菜抗菌核病品种的筛选和抗性机理分析. 南京农业
大学硕士学位论文, 2008
Jiang W L. The screening and resistant mechanism on Sclerotinia
sclerotiorum tolerant on rapeseed varieties. MS Thesis of Nanjing
Agricultural University, Nanjing, China, 2008 (in Chinese with
English abstract)
[41] Mohamed E O, Kamal B. Plant signalling components EDS1 and
SGT1 enhance disease caused by the necrotrophic pathogen Botry-
tis cinerea. New Phytol, 2007, 175: 131–139