全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(9): 15651571 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(12)1003], 江苏省科技支撑计划项目(BE2013301)和国家现代农业产业技术体系建设
专项(CARS-01-47)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王才林, E-mail: clwang@jaas.ac.cn, Tel: 025-84390307
第一作者联系方式: E-mail: echo09111982@aliyun.com
Received(收稿日期): 2014-02-27; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140709.1532.010.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01565
水稻抗稻瘟病基因 Pi-ta 和 Pi-b 多重 PCR 体系的构建与应用
姚 姝 刘燕清 张亚东 朱 镇 陈 涛 赵庆勇 周丽慧
赵春芳 于 新 王才林*
江苏省农业科学院粮食作物研究所 / 江苏省优质水稻工程技术研究中心 / 国家水稻改良中心南京分中心, 江苏南京 210014
摘 要: 稻瘟病是我国水稻主产区的重要病害之一, 其主效抗性基因 Pi-ta和 Pi-b在我国很多稻区表现广谱持久的稻
瘟病抗性, 被广泛应用于我国的水稻育种和生产。本研究选用稻瘟病抗性基因 Pi-ta和 Pi-b及其等位基因的功能标记,
在对 22份分别已知抗病基因 Pi-ta和 Pi-b以及感病基因 pi-ta与 pi-b组成的水稻品种检测验证基础上, 建立了 2套稻
瘟病基因多重 PCR 体系: 体系 I 同时检测抗病基因 Pi-ta 与 Pi-b, 体系 II 同时检测感病基因 pi-ta 与 pi-b, 并利用 2
套体系对 336份高世代育种材料进行检测, 与单标记检测结果比较, 表现稳定可靠, 重复性好。本研究构建的抗稻瘟
病基因分子标记多重 PCR体系可用于水稻种质资源的快速评价和抗稻瘟病分子标记辅助育种。
关键词: 稻瘟病; 分子标记; 抗性基因; 多重 PCR体系
Establishment and Application of Multiplex PCR System for Blast Resistance
Genes Pi-ta and Pi-b in Rice
YAO Shu, LIU Yan-Qing, ZHANG Ya-Dong, ZHU Zhen, CHEN Tao, ZHAO Qing-Yong, ZHOU Li-Hui,
ZHAO Chun-Fang, YU Xin, and WANG Cai-Lin*
Institute of Food Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Jiangsu High Quality Rice R&D Center / Nanjing Branch of China National
Center for Rice Improvement, Nanjing 210014, China
Abstract: Rice blast is one of the important diseases in major rice producing areas in China. The main blast resistance genes Pi-ta
and Pi-b showed wide and durable resistance spectrum in many rice growing areas. In this study, two sets of multiple PCR system
primed by functional markers were established to identify Pi-ta and Pi-b, using 22 rice varieties with known alleles on both Pi-ta
and Pi-b loci. The PCR system I could detect the resistance alleles on Pi-ta and Pi-b loci, while the PCR system II could detect the
susceptible alleles simultaneously. The effectiveness of the two PCR systems was validated in 336 japonica breeding lines. The
result was highly consistent with that of molecular detection using conventional single marker. Therefore, the two multiple PCR
systems developed are stable, reliable and time-saving, and can serve as a rapid and efficient method to identify Pi-ta and Pi-b genes
in bulky screening and marker-assistant selection in rice aiming at blast resistance breeding.
Keywords: Rice blast; Molecular marker; Resistance gene; Multiplex PCR system
稻瘟病由子囊真菌 (Magnaporthe grisea)引起 ,
是最严重的水稻病害之一, 其危害面积和危害程度
较大, 已成为水稻高产稳产的严重阻碍。据统计, 稻
瘟病使全球每年损失稻谷产量约占总产量的 10%~
15%, 造成经济损失达数十亿美元[1]。实践证明, 培
育抗性品种是防治稻瘟病最经济、有效的方法。但
由于稻瘟病菌变异性强, 很多抗性品种种植几年就
会丧失抗性[2]。因此, 利用分子标记辅助选择(marker-
assisted selection, MAS)技术将多个具有不同抗谱的
稻瘟病抗性基因聚合到同一个品种中, 是培育具有
持久抗瘟性品种的有效措施之一[3]。
随着分子生物学技术的迅速发展, 迄今已有50
多个主效抗稻瘟病基因被精细定位, 其中24个基因
被克隆[4-8]。Pi-ta和Pi-b是最早被克隆的2个主效抗稻
1566 作 物 学 报 第 40卷


瘟病基因[9-10]。近期, 源于这2个基因及其等位感病
位点的功能标记也已被开发出来, 可以快速、准确
地从水稻种质资源中鉴定出抗性基因 Pi-ta和
Pi-b[11-12]。李进斌等[13]利用抗性基因Pi-ta和Pi-b特异
性分子标记分析了云南地方稻种的2个基因的分布;
刘华招等[14]和时克等[15]同样利用这2个特异性分子
标记分别对黑龙江省主推的水稻品种和我国水稻主
栽品种进行抗性基因Pi-ta和Pi-b鉴定分析。前人多
侧重于利用标记研究这2个抗性基因在不同水稻品
种中的分布 , 但很少涉及对标记检测方法的优化 ,
尤其是同时检测抗性基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR体
系还未见报道。与单一基因分子标记的PCR相比, 多
重PCR在一次PCR中就可检测2个或2个以上目标基
因, 工作效率显著提高, 成本明显降低[16-17]。因此,
针对特定目标, 开发简单、快捷和有效的多重PCR
体系对促进水稻抗病分子育种发展具有重要意义。
本研究通过摸索PCR反应组分和循环参数对多
重PCR反应结果的影响, 构建了2套稻瘟病分子标记
多重PCR体系。每个体系内的引物之间不存在相互
抑制作用和错配, 经检测已知基因型的品种反复验
证 , 结果稳定准确 , 可用于同时筛选鉴定同一PCR
反应体系中的2个抗(感)稻瘟病基因, 并利用该体系
对336份高世代粳稻品种(系)的相关抗病基因Pi-ta和
Pi-b及其感病等位基因pi-ta与pi-b进行检测, 旨在为
Pi-ta和Pi-b基因筛选提供快速高效的分子标记辅助
选择方法, 从而提高水稻抗稻瘟病育种效率。
1 材料与方法
1.1 供试材料
在构建抗病基因Pi-ta和Pi-b的多重PCR体系(简
称为体系I)时选用南粳44、南粳45、武运粳7号、武
运粳8号、武运粳21、武粳15、武香粳14、常农粳5
号、盐稻9号、扬粳805。在构建感病等位基因pi-ta
与pi-b的多重PCR体系(体系II)时选用徐稻3号、徐稻
4号、徐稻6号、镇稻88、淮稻5号、淮稻9号、连粳4
号、连粳5号、连粳6号、连粳7号。分别以公认的抗
稻瘟病品种嘉33作为抗病对照, 丽江新团黑谷作为
感病对照[13,18], 利用开发的多重PCR体系对336份高
世代粳稻新品系所含抗病基因Pi-ta和Pi-b进行检测,
与单标记检测结果比较, 验证多重PCR体系的可靠
性。在江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田种
植上述材料。5月10日播种, 6月10日移栽, 每个材料
种植8行, 每行40株, 株行距13.2 cm × 26.4 cm, 常
规田间管理。
1.2 DNA提取
在水稻分蘖盛期采取新鲜幼嫩叶片 , 按CTAB
方法 [19], 略有修改, 提取对照品种及供试材料单株
基因组DNA。
1.3 引物合成
根据等位基因特异 PCR原理, 王忠华等[20]利用
自身序列设计特异性引物 YL155/YL87 和 YL183/
YL87, 前一对引物能特异扩增出抗病等位基因
Pi-ta的相应序列, 约 1042 bp的 DNA片段; 后 1对
引物能特异扩增出感病等位基因 pi-ta 的相应序列,
约 1042 bp的 DNA片段。根据 Fjellstrom等[21]的序
列合成引物 Pi-bdomF/Pi-bdomR, 能特异扩增出抗
病等位基因 Pi-b的相应序列, 约 365 bp的 DNA片
段 ; 根据刘洋等 [12]的序列合成引物 Lys145F/
Lys145R, 扩增感病等位基因 pi-b 的相应序列, 约
803 bp的 DNA片段。这些引物名称、序列及其扩增
片段预期大小见表 1。引物均由上海英潍捷基公司
合成。
1.4 多重 PCR反应和电泳条件
2 套多重 PCR 反应体系均为 20 μL, 包括 l ×
PCR buffer (1.5 mmol L–1 MgCl2)、200 μmol L–1
dNTP、1.25 U Taq DNA聚合酶(南京金斯特生物技
术有限公司)、100~150 ng模板 DNA和适量引物。
扩增反应在 Tprofessional 热循环仪上进行, 扩增参
数为 95℃预变性 3 min; 然后 94℃变性 1 min, 55℃
复性 1 min, 72℃延伸 1 min, 6个循环; 再进行 94℃
变性 1 min, 55℃复性 50 s, 72℃延伸 30 s, 32个循环;
最后 72℃延伸 6 min。扩增产物加 2 μL加样缓冲液,
取 10 μL在含有溴化乙锭的 1.5%琼脂糖凝胶上电泳
分离, 缓冲体系为 1×TAE溶液, 120 V电泳 45 min,
紫外灯下观察并照相。为保证结果的稳定性和可靠
性, 每份材料重复扩增 3次以上。
2 结果与分析
2.1 多重 PCR体系的创建
先以 22 个已知基因组成的水稻品种 DNA 为模
板, 利用 4个基因的特异引物, 分别进行退火温度的
梯度 PCR, 明确每对引物出现清晰特异扩增条带的
退火温度范围; 筛选出具有相同退火温度且扩增条
带差异较大的引物, 组合成多重 PCR, 进行下步已
知基因组成材料的多重 PCR检测。在明确构建体系
所涉及的 4对引物相同的退火温度后 , 再按照原有
第 9期 姚 姝等: 水稻抗稻瘟病基因 Pi-ta和 Pi-b多重 PCR体系的构建与应用 1567


表 1 用于多重 PCR 反应的引物名称、序列及预期片段长度
Table 1 Name, sequences, and expected fragment size of specific primers used for Multiplex PCR
目标基因
Target gene
引物
Primer
序列
Sequence (5–3)
预期片段
Fragment size (bp)
注释
Note
参考文献
Reference
YL155 AGCAGGTTATAAGCTAGGCC Pi-ta
YL87 CTACCAACAAGTTCATCAAA
1042
抗病
Resistant
YL183 AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT pi-ta
YL87 CTACCAACAAGTTCATCAAAS
1042
感病
Susceptible
Wang et al. [11]
Pi-bdomF GAACAATGCCCAAACTTGAGA Pi-b
Pi-bdomR GGGTCCACATGTCAGTGAGC
365
抗病
Resistant
Fjellstrom et al. [21]
Lys145F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT pi-b
ys145R GGGAAGCGGATCCTAGGTCTS
803
感病
Susceptible
刘洋等[12]
Liuyang et al. [12]

引物、dNTP、DNA 聚合酶等用量配制多重 PCR 体
系, 进行 PCR 扩增和电泳检测。然后结合对照材料
扩增的结果, 主要从引物用量、延伸时间和循环数
等方面对体系进行调试优化。实验中先加入等浓度
的引物量, 根据扩增结果再调整, 增大弱扩增的引
物用量, 减少强扩增的引物用量; 在优化延伸时间
时, 弱扩增适当延长。最终, 在 2 套多重 PCR 体系
中, 使每个标记引物在含目标基因(位点)的已知对
照材料中扩增出清晰的特异条带, 而在不含目标基
因(位点)的已知对照材料中无特异条带出现。现将构
建 2套多重 PCR体系的具体内容分述如下。
2.1.1 Pi-ta 和 Pi-b 多重 PCR 体系 本体系涉及
Pi-ta 和 Pi-b 两个抗病基因位点的标记 , 由引物
YL155/YL87和 Pi-bdomF/Pi-bdomR构成。以已知基
因组成的12个水稻品种(系) DNA为模板, 利用 Pi-ta
与 Pi-b 基因标记对其相应位点基因进行 PCR 扩增
和电泳, 通过反复调整体系中引物间浓度比例、延
伸时间和循环数等条件, 不断优化体系, 最终获得
20 μL PCR反应体系 I含2.0 μL DNA模板(约20 ng
μL–1), 2.0 μL 10 × PCR buffer (25 mmol L–1), 2.0 μL
d NTPs (2.5 mmol L–1), 引物浓度是10 μmol L–1, 每条
引物用量0.8~1.2 μL, 用 ddH2O补至20 μL。
在图 1多重 PCR体系 I检测的 12个品种中, 南
粳 44和南粳 45等 10份材料同时扩增出了与抗病对
照嘉 33相同的条带, 分别为 1042 bp和 365 bp; 而
感病对照丽江新团黑谷则无目的条带, 与时克等[15]
和杨杰[22]等单一抗病基因 PCR 的检测结果完全一
致, 表明这些品种都含有抗病基因 Pi-ta和 Pi-b。
2.1.2 感病等位基因 pi-ta与 pi-b多重 PCR体系
按照构建多重 PCR 体系 I 的方法, 本体系涉及
pi-ta与 pi-b两个感病基因位点的标记, 由引物YL183/
YL87和 Lys145F/Lys145R构成。通过不断优化体系,

图 1 Pi-ta 和 Pi-b 基因标记的多重 PCR 琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 1 Multiplex PCR specific for genes Pi-ta and Pi-b
M: DL2000; 1: 抗病对照嘉 33; 2: 感病对照丽江新团黑谷; 3~12:
分别为南粳 44、南粳 45、武运粳 7号、武运粳 8号、武运粳 21、
武粳 15、武香粳 14、常农粳 5号、盐稻 9号和扬粳 805。
M: DL2000; 1: resistant control Jia 33; 2: susceptible control
Lijiangxintuanheigu; 3–12: tested rice varieties Nanjing 44, Nan-
jing 45, Nanjing 9108, Nanjing 46, Nanjing 5055, Wuyunjing 7,
Wuyunjing 8, Wuyunjing 21, Wujing 15, and Wuxiangjing 14.

同样获得了 20 μL PCR 反应体系 II含 2.0 μL DNA模
板(约 20 ng μL–1), 2.0 μL 10 × PCR buffer (25 mmol L–1),
2.0 μL dNTPs (2.5 mmol L–1), 引物浓度是 10 μmol
L–1, 每条引物用量 0.8~1.2 μL, 用 ddH2O补至 20 μL。
图 2 为利用感病等位基因 pi-ta 与 pi-b 多重 PCR
体系 II检测 12个已知品种(系)的结果。徐稻 3号和徐
稻 4号等 10份材料, 同时扩增出了和感病对照丽江新
团黑谷相同的特异条带, 分别为 1042 bp和 803 bp; 而
抗病对照嘉33则未扩增出目的条带, 与杨杰等[22]和何
重等(待发表)单一感病基因PCR的检测结果完全相同,
表明这些品种都含有感病基因 pi-ta与 pi-b。
2.2 多重 PCR体系对高世代品系抗性基因的检测
利用已建立的2套多重PCR体系, 对本研究团队
自主选育的336份高世代育种材料进行抗病基因
Pi-ta和Pi-b以及感病等位基因pi-ta与pi-b的检测。结
果显示 , 336份供试材料中 , 只含有抗性基因Pi-ta
的品系有119份 , 占总量的35.42%, 只含有抗性基
因Pi-b的品系有319份, 占总量的94.94%。有112个
品系同时扩增出1042 bp和365 bp两条抗病基因目
的条带, 占供试材料的33.33%, 这些品系的目的条
1568 作 物 学 报 第 40卷



图 2 pi-ta 和 pi-b 基因标记的多重 PCR 琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 2 Multiplex PCR specific for genes pi-ta and pi-b
M: DL2000; 1: 抗病对照嘉 33; 2: 感病对照丽江新团黑谷, 3~12:
分别为徐稻 3号、徐稻 4号、徐稻 6号、镇稻 88、淮稻 5号、
淮稻 9号、连粳 4号、连粳 5号、连粳 6号和连粳 7号。
M: DL2000; 1: susceptible control variety Lijiangxintuanheigu;
2: resistant control variety Jia 33, 3–12: tested rice varieties Xudao
3, Xudao 4, Xudao 6, Zhendao 88, Huaidao 5, Huaidao 9, Lianjing
4, Lianjing 5, Lianjing 6, and Lianjing 7.

带与抗病对照嘉33相同, 说明这些品系均含有抗性
基因Pi-ta和Pi-b; 10份材料均检测到了与感病对照
丽江新团黑谷相同的1042 bp和803 bp感病基因目的
条带, 占总数的3.0%, 说明这些品系含有感病基因
pi-ta和pi-b; 有7个品系同时扩增出1042 bp抗病基因
目的条带和803 bp感病基因目的条带 , 占总数的
2.1%, 说明这些品系含有抗性基因Pi-ta和感病基因
pi-b; 207个品系同时扩增出1042bp感病基因目的条带
和365 bp抗病基因目的条带, 占总数的61.61%, 说明
这些品系含有感病基因pi-ta和抗病基因Pi-b (表2)。上
述检测结果与何重等(待发表)单一感病基因PCR的检
测结果完全相同。部分品系检测结果见图3和图4。
从以上分析可以看出, 高世代育种材料中聚合
2个抗稻瘟病基因的品系比例较少, 抗性基因 Pi-b
的分布频率明显高于抗性基因 Pi-ta的分布频率。

图 3 部分水稻品系抗病基因 Pi-ta 和 Pi-b 的多重 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 3 Results of multiplex PCR detection of resistance genes Pi-ta and Pi-b in partial rice lines
M: DL2000; 1: 抗病对照嘉 33; 2: 感病对照丽江新团黑谷; 3~24: 部分检测品系。
M: DL2000; 1: resistant control Jia 33; 2: susceptible control Lijiangxintuanheigu; 3–24: partial rice lines tested.

图 4 部分水稻品系感病基因 pi-ta 和 pi-b 的多重 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig. 4 Results of multiplex PCR detection of disease genes pi-ta and pi-b in partial rice lines
M: DL2000; 1: 抗病对照嘉 33; 2: 感病对照丽江新团黑谷; 3~24: 部分检测品系。
M: DL2000; 1: resistant control Jia 33; 2: susceptible control Lijiangxintuanheigu; 3–24: partial rice lines tested.

3 讨论
3.1 多重 PCR体系检测抗病基因 Pi-ta和 Pi-b的
优势
分子生物学的发展, 极大地推进了稻瘟病抗性
遗传研究的进程, 而大量定位的稻瘟病抗性基因为
采用 MAS 技术开展抗性育种奠定了基础。开发一
种高效且不受季节和样品种类限制、能在水稻生长
发育早期即可检测其抗性基因组成的方法, 有助于
加快水稻抗稻瘟病遗传改良的进度。常规的抗稻瘟
病基因型分析, 依赖于抗性鉴定和表型选择, 育种
周期长, 且存在选择效率低、工作量大、操作困难
等诸多缺点。分子标记检测样品可以是植株任何部
位的组织, 取样不受水稻生长季节和样品种类限制,
操作过程比较简单; 而与单一 PCR 方法相比, 多重
PCR 一次可以同时检测多个目标基因, 具有低成本、
易操作、高效率等优点, 适合目标位点的分子辅助
选择聚合育种。与前人建立的单一 PCR检测体系相
比, 本研究构建的多重 PCR 体系涉及更多位点, 特
异性和灵敏度较好, 检测效率更高, 更适合抗病基
因 Pi-ta和 Pi-b的资源筛选和分子聚合育种。
3.2 高世代粳稻品种(系)Pi-ta和 Pi-b的分布特点
及对抗性育种的建议
前人研究表明, Pi-ta和 Pi-b基因在江苏、云南、
吉林等地区菌株仍表现较高水平的抗性[23-26]。本研
究分子检测结果显示 Pi-ta 和 Pi-b 在品系中的分布
频率存在明显差异, Pi-b的分布频率明显高于 Pi-ta。
第 9期 姚 姝等: 水稻抗稻瘟病基因 Pi-ta和 Pi-b多重 PCR体系的构建与应用 1569


表 2 抗病基因 Pi-ta 和 Pi-b 在 336 份粳稻品系中的分布
Table 2 Distribution of Pi-ta and Pi-b in 336 japonica rice lines
品系
Line
数量
Number
比例
Ratio (%)
含有 Pi-ta和 Pi-b
Containing Pi-ta and Pi-b
112 33.33
含有 Pi-ta和 pi-b
Containing Pi-ta and pi-b
7 2.08
含有 pi-ta和 Pi-b
Containing pi-ta and Pi-b
207 61.61
含有 pi-ta和 pi-b
Containing pi-ta and pi-b
10 2.98
合计 Total 336 100.00

分析含 Pi-ta但不含 Pi-b以及不含 Pi-ta只含有 Pi-b
这 2 种基因组合的抗性表现, 发现只含 Pi-b 基因的
品系, 其感病率明显高于只含 Pi-ta基因品系的感病
率, 且稻瘟病菌表现高度的小种专化性。在未来水
稻抗稻瘟病育种中, 应当注重改良现有育成品种的
抗性基因组成, 使各位点的抗稻瘟病基因尽可能聚
合到同一品种中, 选育出抗性优良的水稻新品种。
3.3 构建多重 PCR的建议
由于多重PCR实验设计较单一PCR要复杂得多,
技术难度大 , 因而在建立多重PCR反应体系时 , 必
须对其中的主要成分和反应条件进行繁琐的优化[27]。
根据实践经验, 我们认为采用下面步骤可能会提高
构建多重PCR体系的效率。第一, 选择扩增产物差异
较大的基因标记来组合多重PCR体系, 这是决定琼
脂糖凝胶电泳能否容易、准确分辨结果的保证。第
二 , 在多重PCR反应中 , 退火温度是一个最重要的
需要调整的因素。通常依据引物的解链温度选择退
火温度, 但有的时候其结果和预期并不一致。最简
单的方法就是对每个基因标记的引物采用梯度PCR
程序进行单一基因扩增, 确定能够满足每个目标基
因扩增的多重PCR的退火温度; 而对没有相同退火
温度的多重 PCR组建体系 , 可以考虑采用 touch
down扩增程序。第三, 在多重PCR组建体系中对扩
增条带较弱的基因增加其引物用量, 而较强的减少
用量, 通过不断调整引物的相对用量, 最终达到每
个基因标记都能扩增出足够数量的PCR产物。虽然
选择基因标记的引物是决定多重PCR成败最关键的
因素, 但DNA模板、化学试剂(PCR buffer、Mg2+、
Taq聚合酶和dNTP等)和仪器(PCR仪和电泳仪)等因
素也会影响多重PCR的结果。建议初期试用不同公
司的试剂和不同型号的PCR仪, 确定多重PCR体系
和程序; 当体系和程序基本确定后, 最好固定使用
仪器和试剂。建议对每条引物稀释后分装使用, 而
不要将多条引物混装保存和使用; 尽量避免反复冻
融dNTP等试剂, 使用期间最好保存在4℃。与单个基
因标记PCR相比, 多重PCR检测试剂成本明显降低、
时间显著缩短。将本研究创建的稻瘟病抗病相关基因
多重PCR体系与田间抗性鉴定相结合, 开展水稻抗稻
瘟病育种, 必将有效提高水稻抗病性改良的效率。
4 结论
构建了涉及水稻抗稻瘟病基因 Pi-ta 和 Pi-b 及
其感病基因 pi-ta与 pi-b的分子标记多重 PCR体系,
其鉴定结果稳定可靠, 实验成本低廉, 可用于水稻
育种亲本评价和杂交后代抗病基因聚合的分子标记
辅助选择。利用 2 套体系分别检测的 336 份水稻后
备品系中, 有 112个品系同时携带抗性基因 Pi-ta和
Pi-b; 有 7个品系只含有单一抗性基因 Pi-ta; 有 207
个品系只含有单一抗性基因 Pi-b; 有 10个品系同时
携带感病基因 pi-ta和 pi-b。
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