全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(11): 16821691 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由北京市科技计划项目(Z141100002314018), 国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08002-003B), 陕西省科技攻关项目
(2014K02-04-05)和陕西省科技统筹创新计划项目(2014KTZB02-01-01)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 陈明, E-mail: chenming02@caas.cn, Tel: 010-82108750; 张小红, E-mail: zhxh2493@126.com, Tel:
13572869993
第一作者联系方式: E-mail: fenglu063925@126.com, Tel: 010-82108750
Received(收稿日期): 2015-02-11; Accepted(接受日期): 2015-06-01; Published online(网络出版日期): 2015-06-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150629.1349.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01682
过表达谷子液泡 H+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性
冯 露 1,2 钟 理 2,3 陈丹丹 4 马有志 2 徐兆师 2 李连城 2 周永斌 2
陈 明 2,* 张小红 1,
1 西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科
学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北京 100081; 3 贵州省草业研究所, 贵州贵阳 550006; 4 西北农林科技大学农
学院, 陕西杨凌 712100
摘 要: V-H+-ATPase在植物生长、发育和胁迫响应等生物学过程中发挥重要作用。本研究通过序列比对, 从谷子中
克隆到 V-H+-ATPase E 亚基基因 SiVHA-E。进化树分析显示 , SiVHA-E 基因在进化上属于 E1/E3 亚族 , 与玉米
V-H+-ATPase E亚基基因 ZmVHA-EL亲缘关系较近。表达谱分析结果显示, SiVHA-E在高盐、茉莉酸甲酯(MeJA)、水
杨酸(SA)和脱落酸(ABA)处理下表达上调, 在低温和低氮处理下表达下调。亚细胞定位分析表明 SiVHA-E 定位于液
泡膜上。遗传转化拟南芥的耐盐性鉴定表明, 在盐处理条件下, 转基因株系的种子萌发率、幼苗主根长、植株鲜重及
存活率显著高于野生型的。与野生型拟南芥植株相比, SiVHA-E过表达植株体内 Na+含量减少, 体内相对含水量提高。
此外, ABA 萌发试验结果显示, 在种子萌发后期, SiVHA-E 过表达植株对 ABA 更加敏感。研究表明, 谷子 SiVHA-E
可以显著提高拟南芥耐盐性, 这可能与其正向调控 ABA信号途径以及减少植株体内 Na+积累和水分散失有关。
关键词: 谷子; V-H+-ATPase E亚基基因; 耐盐性; 作用机制
Overexpression of Vacuole H+-ATPase E Subunit Gene SiVHA-E from Foxtail
Millet Enhances Salt Resistance in Transgenic Arabidopsis thaliana
FENG Lu1,2, ZHONG Li2,3, CHEN Dan-Dan4, MA You-Zhi2, XU Zhao-Shi2, LI Lian-Cheng2, ZHOU
Yong-Bin2, CHEN Ming2,*, and ZHANG Xiao-Hong1,*
1 College of Life Science, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences
/ National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crop,
Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China; 3 Guizhou Provincial Institute of Grass Industry, Guiyang 550006, China; 4 College of Agronomy,
Northwest A&F University, Yangling 712100, China
Abstract: The V-H+-ATPase plays an important role in processes of plant growth, development and response to stresses. In this
research, SiVHA-E, a V-H+-ATPase E subunit gene, was cloned from millet by the Blast analysis against GenBank database. Phy-
logenetic tree showed that the gene belongs to E1/E3 subgroup and is close with ZmVHA-EL, a V-H+-ATPase E subunit from
maize. The quantitative Real-time PCR (qRT-PCR) analysis revealed that the expression levels of SiVHA-E were up-regulated
under treatments of high-salt, exogenous MeJA, SA, and ABA hormones, while down-regulated under stresses of cold and low
nitrogen. Protein subcellular localization analysis using protoplast showed that SiVHA-E is located on tonoplast. The results of
salt tolerance assay showed that the germination rate of SiVHA-E transgenic lines was significantly higher than that of wild type
plant under salt stress. During seedlings period, the root lengths were significantly longer as well as fresh weight and survival rate
were significantly higher in transgenic lines than in wild type plant under salt treatment. Compared with wild type plant, trans-
genic plant reduced the content of Na+ and increased the relative water content inside cells. In addition, the results of germination
experiment used ABA showed that SiVHA-E transgenic Arabidopsis was more sensitive to ABA than wild type plant during
post-germination. In short, overexpressing SiVHA-E in transgenic Arabidopsis lines enhances salt tolerance, which might be
第 11期 冯 露等: 过表达谷子液泡 H+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性 1683


relates to positive regulation of ABA signaling pathway or reduction of Na+ accumulation and water loss in transgenic plants.
Keywords: Foxtail millet; V-type H+-ATPase E subunit gene; Salt stress tolerance; Mechanism
土壤盐碱化是影响植物生长发育和制约农业生
产最主要的非生物胁迫之一[1]。盐胁迫通过破坏植
物细胞膜, 从而破坏细胞内离子平衡[2]。以植物通过
限制 Na+的吸收, 加速 Na+排出或将 Na+隔离至液泡
中 3 种方式来减缓 Na+的毒害 [3-4]。植物液泡
H+-ATPase 是一类膜结合转运蛋白, 能够利用水解
ATP 产生的能量将质子泵入膜内, 产生维持离子转
运的驱动力, 在维持植物体内离子平衡中发挥重要
功能。V-H+-ATPase是由 13个亚基组成的一个蛋白
质复合体, 包括 V1 (640 kD)和 V0 (260 kD) 2个亚蛋
白复合体。V1在液泡膜外, 由 A~H 8个亚基组成, 呈
球茎状, 属于催化区域。V0在液泡膜内, 由 a、c、c、
c和 d 5个亚基组成, 呈柄状, 属于质子传导区[5-7]。
在拟南芥中有 E1、E2、E3三个 VHA-E亚基, 其
中 E1在植物的生长过程中作为持家基因存在, E3在
外围组织表达, E2 是花粉特异表达基因。系统发育
分析表明 VHA-E2 是进化比较古老的一个分支, 其
序列保守, 且限制雄性配子体的发育, 被独立进化
出来[8]。Zhang等[13]报道小麦 VHA-E定位于胞质内。
Detmer 等[9]研究发现, 冰叶日中花 V-H+-ATPase 的
A、B、E、c亚基受盐胁迫诱导表达。盐地碱蓬在盐
胁迫条件下, 叶片 V-H+-ATPase 水解活性增加[10]。
当植物处于逆境时, V-H+-ATPase能够通过结构、状态
以及体内数量的改变减小逆境对植物造成的伤害[11]。
He 等 [12]和 Zhang 等 [13]研究表明 , 过表达 V-H+-
ATPase 的 A、a、C、c、D、d、F、G、H、E 亚基
都可以提高植物的耐盐性 , 其中 c 亚基可能对
V-H+-ATPase的功能起重要调控作用。然而, 对于这
些亚基的耐盐机制研究甚少。
谷子在 8000多年以前在中国北部已经被驯化[14]。
由于谷子具备优良的耐逆性, 至今仍被广泛种植于
世界的干旱和半干旱地区, 特别是在中国和印度[15]。
除此以外, 谷子基因组小(约 510 Mb), 近亲繁殖率
高, 与几种重要的禾本科作物、饲料、燃料和生物
能源草类亲缘关系近, 因此, 谷子是一种理想的禾
本科作物抗逆性研究的模式植物[16-19]。
本试验从谷子中克隆到 V-H+-ATPase E 亚基基
因 SiVHA-E, 拟通过遗传转化及生物信息手段, 了
解该基因的功能及亲缘关系, 为作物耐盐遗传改良
提供新的候选基因, 并为了解 V-H+-ATPase 的耐盐
机制提供新的线索。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野生型拟南芥(Ecotype Columbia, Col-0)由本实
验室保存, 谷子种子由中国农业科学院作物科学研
究所刁现民课题组提供。在温室中培养谷子和拟南
芥幼苗, 培养室温度为 22℃, 湿度 65%, 光照周期
为 16 h/8 h。农杆菌菌株GV3101, GFP质粒及 pBI121
质粒由本实验室保存。
1.2 SiVHA-E基因进化树分析
使用NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.
cgi)查找 V-H+-ATPaseE 亚基序列 , 采用 ClustalX
(1.83)进行序列比对, 采用 MEGA绘制进化树。
1.3 SiVHA-E 基因的表达分析及盐害胁迫相关
基因的表达分析
将谷子在温室中培养 10 d后, 取长势一致的植
株, 用含 150 mmol L–1 NaCl和 0.05 mmol L–1总氮的
培养基处理, 表达谱分析取样时间点为处理后 0、1、
6、12、24和 48 h; 其他胁迫处理的条件为低温(4℃),
ABA (100 µmol L–1)、MeJA (50 µmol L–1)和 SA (50
µmol L–1), 分别在处理后 0、1、6、12和 24 h取样,
样品经液氮速冻后 , –80℃保存。以谷子 SiACTIN
(Si001873m.g)基因为内参基因。Real-time PCR反应
条件为 95℃预变性 15 min; 95℃ 10 s, 60℃ 20 s, 72
℃ 32 s, 40个循环(表 1)。
将野生型(WT)和转基因株系 7 (在幼苗盐胁迫
处理条件下, 转基因株系 7的耐盐性较株系 3、4更
强, 因此选择转基因株系 7 进行基因的表达检测)在
MS上培养 2周, 用含 120 mmol L–1 NaCl的液体MS
培养基培养 24 h。样品经液氮速冻, –80℃保存。使
用 RT-PCR 方法检测盐胁迫相关基因 AVP1
(At1g15690)及 AVA-P2 (At1g19910)。以拟南芥 AtActin
(At3g18780)基因为内参基因。Real-time PCR反应条件
同上(表 1)。
1.4 SiVHA-E的亚细胞定位分析
将 SiVHA-E 和 GFP 融合表达 , 构建 35S::
SiVHA-E-GFP 定位载体, 原生质体以生长 3 周的拟
南芥叶片为材料, 制备及转化参考 Yoo等方法[20], 转
化时, 每 100 μL原生质体加入 10 µg目标质粒, 转入
10 µg GFP空载体作为对照, 使用 PEG-4000诱导转
化, 过夜培养 16 h, 在激光共聚焦显微镜下观察。
1684 作 物 学 报 第 41卷

表 1 引物序列
Table 1 Primers sequence
引物名称
Primers name
正向引物
Forward primers (5→3)
反向引物
Reverse primers (5→3)
SiVHA-E GGGAAGATGAACGACGCCG CATCGTAAATTGAGAAAATGAGATGGC
RT-PCR-SiVHA-E TCAGCGACAACCACCATGA ACTCATGCTTTGCCGAATGC
GFP-SiVHA-E TATCTCTAGAGGATCCGGGAAGATGAACGACGCCG
TGCTCACCATGGATCCCATCGTAAATTGAGAAA
ATGAGATGGC
121-SiVHA-E CACCGCGGTGGAGCTCGGGAAGATGAACGACGCCG
CACCGCGGTGGAGCTCCATCGTAAATTGAGAAA
ATGAGATGGC
RT-PCR-SiACTIN
RT-PCR-AVA-P2
RT-PCR-AVP1
RT-PCR-AtACTIN
GGCAAACAGGGAGAAGATGA
TCAGTACCGGAATCAACCCT
TGTTGCTGCTCTTGGTATGC
GAAATCACAGCACTTGCACC
GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG
TCGCCGACAATTCCAATAGC
GTGGCTCATTCCAGCCATTTC
AAGCCTTTGATCTTGAGAGC

1.5 SiVHA-E基因的拟南芥转化及阳性鉴定
参考 Xu 等方法[21], 将 SiVHA-E 基因插入植物
表达载体 pBI121, 载体启动子为 CaMV 35S。将转
基因拟南芥在含有 25 µg L–1卡那抗生素的 MS培养
基培养, 4℃春化 3 d后, 光照培养 14 d, 样品经液氮
冷冻 , 置–80℃保存 , 用于提取 RNA。以拟南芥
AtACTIN 基因为内参基因。使用半定量方法检测转
基因植株的基因表达量。
1.6 SiVHA-E转基因拟南芥的耐盐性鉴定
1.6.1 种子萌发期 SiVHA-E 转基因株系及野生
型拟南芥种子经过 NaClO 消毒后, 播于 MS、60、
90、120 mmol L–1 NaCl培养基上(每种处理 3次重复,
每个材料每个皿点 64粒种子), 4℃春化 4 d后, 将其
放在光照培养室培养(22℃, 光照 16 h/8 h黑暗), 从
第 2天开始统计萌发率, 连续统计 5 d。
1.6.2 幼苗期 SiVHA-E 转基因株系及野生型拟
南芥种子经过 NaClO消毒后, 播于 MS培养基, 4℃
春化 3 d后, 将其放在光照培养室培养, 4 d后转移至
含有 60、90和 120 mmol L–1 NaCl培养基上, 竖直放
置培养 7 d后照相, 测量植物根长及鲜重, 每个试验
3次重复。
1.6.3 成苗期 SiVHA-E 转基因株系及野生型拟
南芥种子经消毒后, 种于 MS培养基上, 春化 3 d后
放在光照培养室培养, 1 周后移栽土里生长, 4 周后
用 120 mmol L–1 NaCl盐溶液处理 16 d, 照相, 同时
测定生理指标。
1.7 转基因植株体内 Na+含量、叶绿素含量、相
对含水量的测定
转基因拟南芥在土里生长 3周后, 用 120 mmol
L–1 NaCl 溶液处理 15 d, 然后将植物地上部分取下
清洗干净, 105℃高温处理 10 min, 80℃烘箱烘 48 h。
参照 Ding 和 Zhu[22]的方法检测 Na+ 含量。将
SiVHA-E 转基因株系及野生型拟南芥培养 7 d 后移
至含 90 mmol L–1 NaCl培养基上培养 10 d, 按照李
合生[23]的方法检测叶绿素含量。测定鲜重, 在 105℃
杀青 30 min, 70℃烘干, 称重。相对含水量＝(鲜重–
干重) / 鲜重×100%
1.8 SiVHA-E转基因拟南芥 ABA敏感性鉴定
将转基因株系及野生型拟南芥种子分别播于
MS和含 1 µmol L–1、2 µmol L–1 ABA的培养基上, 4
℃春化 3 d, 转至光照培养室(22℃, 光照 16 h / 8 h黑
暗)培养, 从第 2天开始统计萌发率, 连续统计 9 d。
1.9 统计分析
用 Microsoft Excel、Prism 5软件处理数据和绘
图, 用 SPSS 软件进行方差分析, 用 t 检验进行显著
性分析(P<0.05)。
2 结果与分析
2.1 SiVHA-E基因的克隆及进化树分析
参考已报道的小麦 V-H+-ATPase E基因 TaVH+-
ATPase E 的序列[24], 与谷子基因组数据库(phytozome
v9.1:home)比对, 搜索到谷子 V-H+-ATPase E 基因,
命名为 SiVHA-E。SiVHA-E的序列全长为 696 bp, 编
码 231 个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明, V-H+-
ATPase E亚基类基因在 N端很保守, 在 C端序列变
异较大(图 1)。采用邻接法构建进化树(图 2), 可以看
出 V-H+-ATPase E亚基包含 E1、E2、E3三种类型, 其
中 E1 和 E3同源关系较近, 形成 1 个亚族, E2 独立
分化形成单独亚族。谷子的 SiVHA-E属于 E1 和 E3
亚族, 与玉米的 ZmVHA-EL亲缘关系最近。
2.2 SiVHA-E基因的表达特性及亚细胞定位分析
表达特性分析结果表明, SiVHA-E 的表达受盐
第 11期 冯 露等: 过表达谷子液泡 H+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性 1685



图 1 不同物种来源的 V-H+-ATPase E亚基基因氨基酸序列比对分析
Fig. 1 Amino acid sequence alignment of the V-H+-ATPase E subunit genes in foxtail millet and other species
水稻: OsVHA-E2, NP_001055857.1, OsVHA-Ea, NP_001042437.1, OsVHA-Eb, NP_001043767.1; 拟南芥: AtVHA-E1, NM_117185.4,
AtVHA-E2, NM_111690.1, AtVHA-E3, NM_105094.2; 小麦: TaVHA-E, DQ272489.1; 大麦: HvVHA-E, U84269.1; 玉米: ZmVHA-EL,
NM_001147854.1; 二穗短柄草: BdVHA-EL, XM_003569441.1; 毛果杨: PtVHA-E, XM_006371074.1; 橡胶树: HbVHA-E, KC509435.1;
冰叶日中花: McVHA-E, X92118.1; 马铃薯: StVHA-EL, XM_006352196.1; 琴叶拟南芥: AlVHA-E, XM_002882525.1。
GenBank accession number of each genes: Oryza sativa: OsVHA-E2, NP_001055857.1, OsVHA-Ea, NP_001042437.1, OsVHA-Eb,
NP_001043767.1; Arabidopsis thaliana: AtVHA-E1, NM_117185.4, AtVHA-E2, NM_111690.1, AtVHA-E3, NM_105094.2; Triticum aesti-
vum: TaVHA-E, DQ272489.1, Hordeum vulgare: HvVHA-E, U84269.1; Zea mays: ZmVHA-EL, NM_001147854.1; Brachypodium dis-
tachyon: BdVHA-EL, XM_003569441.1; Populus trichocarpa: PtVHA-E, XM_006371074.1; Hevea brasiliensis: HbVHA-E, KC509435.1;
Mesembryanthemum crystallinum: McVHA-E, X92118.1; Solanum tuberosum: StVHA-EL, XM_006352196.1; Arabidopsis lyrata: AlVHA-E,
XM_002882525.1.


图 2 不同物种来源的 V-H+-ATPase E亚基进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of the V-H+-ATPase E subunit genes
in foxtail millet and other species
胁迫诱导, 在48 h表达量达到最高, 约为对照的 2.8倍
(图 3); 在 4℃低温处理下, 该基因表达量呈现下调趋
势; 在低氮(0.05 mmol L–1) 处理下, 在 24 h达到最低
值, 约下降至完全培养基上培养的 2.5 倍; 在 ABA
(100 µmol L–1) 处理下, SiVHA-E的表达量先上升后下
降, 并在 1 h 达到最大值, 约是完全培养基上培养的
2.5倍左右; 在MeJA (50 µmol L–1)处理下, SiVHA-E表
达量上升, 在24 h约为完全培养基上培养的7.5倍; 在
SA处理下, SiVHA-E的表达量先上升后下降, 并在 6 h
达到最大值, 约是完全培养基上培养的 7 倍左右。由
上述试验证明, SiVHA-E 基因除受高盐等胁迫处理的
诱导表达外, 还参与 ABA等激素的响应过程。
1686 作 物 学 报 第 41卷


图 3 不同处理条件下谷子 SiVHA-E基因的表达
Fig. 3 Expression of SiVHA-E in foxtail millet under various stress conditions
标以不同小写字母的柱值差异显著(P0.05); 标以不同大写字母的柱值差异极显著(P0.01)。
Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at P0.05 and those by different capital letters are significantly
different at P0.01.

拟南芥原生质体亚细胞定位分析结果表明 ,
SiVHA-E蛋白定位于液泡膜上(图 4-A)。
2.3 SiVHA-E转基因拟南芥的耐盐性鉴定
将 SiVHA-E 在拟南芥中过表达, 获得 8 个转基
因株系, 选择其中 SiVHA-E 基因表达较高的 3 个株
系(E3、E4 和 E7)进行耐盐性鉴定, 3 个株系目标基
因表达情况见图 4-B。耐盐性鉴定结果表明, 在种子
萌发期, 在 60 mmol L–1 NaCl处理条件下, SiVHA-E
过表达植株的萌发率与野生型拟南芥(WT)无明显差
异, 而在 90 mmol L–1 NaCl和 120 mmol L–1 NaCl处
理条件下, SiVHA-E 过表达株系 E3、E4 和 E7 的萌
发率显著高于对照(图 5和图 6); 在苗期, SiVHA-E过

图 4 SiVHA-E蛋白亚细胞定位分析及转基因拟南芥的阳性检测结果
Fig. 4 Subcellular localization of SiVHA-E in plant cells and positive detection of transgenic Arabidopsis thaliana
A: SiVHA-E subunit, SiVHA-E蛋白定位; 35::GFP, GFP对照载体; B: 转基因拟南芥的阳性检测(1, WT; 2~4, 转基因株系 3, 4, 7)。
A: SiVHA-E subunit, the subcellular localization of the SiVHA-E; 35::GFP, the GFP control vector; B: transgenic Arabidopsis thaliana
positive detection (1, WT; 2–4, transgenic plants 3, 4, 7).

图 5 SiVHA-E转基因株系在种子萌发期耐盐性鉴定
Fig. 5 Salt tolerance analysis of SiVHA-E transgenic plants during seed germination stage
第 11期 冯 露等: 过表达谷子液泡 H+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性 1687


表达株系 E3、E4、E7在 60 mmol L–1 NaCl、90 mmol
L–1 NaCl、120 mmol L–1 NaCl处理条件下, 主根长显
著高于 WT, 在 90 mmol L–1 NaCl 处理条件下 ,
SiVHA-E过表达株系 E3、E4、E7的整株鲜重显著高
于WT (图 7和图 8); 在成苗期, SiVHA-E过表达株系
E3、E4、E7的耐盐性优于 WT (图 9)。以上实验结
果表明, 过表达 SiVHA-E 基因的转基因拟南芥在萌
发期、苗期以及成苗期均比 WT耐盐性显著提高。
2.4 SiVHA-E转基因植株中 Na+含量、相对含水
量、存活率及叶绿素含量
图 10表明, E3、E4、E7的存活率显著高于 WT,
分别高 29.3%、23.6%、28.9%; 转基因植株 E3、E4、
E7的相对含水量显著高于WT, 分别高 3.0%、3.0%、
3.7%; E3和 E7的叶绿素含量高于 WT; E3和 E4的
体内钠离子含量低于 WT。
2.5 SiVHA-E转基因拟南芥对 ABA敏感性
在含有 ABA 的培养基上, 随着 ABA 浓度的增
加转基因拟南芥相对于 WT 表现变绿率更低, 表明
SiVHA-E转基因拟南芥对 ABA的敏感性比WT更高
(图 11和图 12)。
2.6 盐胁迫相关基因在 SiVHA-E 转基因植物中
的表达
120 mmol L–1 NaCl处理下, 在 SiVHA-E转基因

图 6 SiVHA-E转基因株系在种子萌发期耐盐性萌发率
Fig. 6 Salt tolerant germination rate of SiVHA-E transgenic
plants during seed germination stage

图 7 SiVHA-E转基因株系在幼苗期耐盐性表型
Fig. 7 Phenotype of SiVHA-E transgenic plants on salt medium during seedling stage

图 8 SiVHA-E转基因株系在幼苗期盐胁迫下的根长及鲜重
Fig. 8 Root length and fresh weight of transgenic plants under high salt stress condition during seedling stage
* 表示差异达 0.05显著水平, ** 表示差异达 0.01显著水平。
* Significantly different at the 0.05 probability level. ** Significantly different at the 0.01 probability level.
1688 作 物 学 报 第 41卷


图 9 SiVHA-E转基因株系成苗期耐盐性表型
Fig. 9 Phenotype of SiVHA-E transgenic plants on salt medium during mature period

图 10 高盐胁迫处理下 SiVHA-E转基因株系的部分生理指标
Fig. 10 Part physiological indices of transgenic lines under high salt stress
标以不同小写字母的柱值差异显著(P0.05); 标以不同大写字母的柱值差异极显著(P0.01)。
Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different at P0.05 and those by different capital letters are significantly
different at P0.01.

图 11 SiVHA-E转基因株系在 ABA处理下种子萌发表型
Fig. 11 Phenotype of SiVHA-E transgenic plants on ABA medium during seed germination stage

株系 E7中, 检测了盐胁迫相关基因氢离子焦磷酸化
酶基因 AVP1及 V-H+-ATPase c亚基基因 AVA-P2的
表达量。结果显示, 在盐胁迫条件下, 在转基因植物
中, 这 2 个基因的表达比野生型拟南芥都增加(图 13),
证明 SiVHA-E转基因植物耐盐性提高可能与这 2 个
盐胁迫相关基因的上调表达相关。
3 讨论
质子泵是一种推动质子跨膜运输的转运系统 ,
在植物生长发育及细胞信号转导过程中起重要的作
第 11期 冯 露等: 过表达谷子液泡 H+-ATPase E亚基基因在拟南芥中的耐盐性 1689



图 12 SiVHA-E转基因株系(E3, E4, E7)在 ABA处理条件下的种子萌发率分析
Fig. 12 Germination rate of SiVHA-E transgenic lines (E3, E4, and E7) under ABA treatment

图 13 在 NaCl处理下盐胁迫相关基因 AVP1和 AVA-P2在 SiVHA-E转基因植物中的表达
Fig. 13 Expression of salt stress related genes AVP1 and AVA-P2 in SiVHA-E transgenic plants under NaCl stress condition

用。目前已知的膜质子泵有 H+-ATPase 和 H+-PPase
两类。而 H+-ATPase 又分为 3 类, 分别为质膜上的
P-H+-ATPase (plasma membrane H+-ATPase), 叶绿体
和线粒体上的 F-H+-ATPase (F-type ATP synthase)以
及液泡膜上的 V-H+-ATPase (vacuolar H+-ATPase)。
V-ATPase是一类持家基因及胁迫响应的酶[25]。该酶
在植物的生长发育及胁迫响应中具有非常重要的作
用。本实验表达谱分析表明, SiVHA-E基因能够不同
程度地响应盐和冷胁迫以及植物激素 ABA、SA、
MeJA 等, 而这些植物激素与植物抵御外界胁迫有
关, 表明该基因在逆境胁迫应答中起重要的作用。
高盐胁迫主要通过 Na+毒害、渗透胁迫等方式
影响植物的生长发育。SOS 信号途径是植物响应高
盐胁迫的主要信号途径, V-H+-ATPase参与 SOS信号
途径[26]。盐胁迫造成 Na+大量进入细胞, 刺激胞内
Ca2+浓度升高, SOS3接受 Ca2+信号而激活 SOS2, 活
化的 SOS2一方面可以激活质膜上的 SOS1向胞外泵
Na+, 另一方面可激活液泡膜上的 Na+/H+反转蛋白、
V-H+-ATPase等实现 Na+在液泡中的贮藏[26]。将 Na+
隔离进液泡是植物增加耐盐性的三大手段之一[27]。
本研究表明过表达 H+-ATPase E 亚基基因 SiVHA-E
可以显著提高植物的耐盐性(图4~图9), 转基因植物
相对于野生型拟南芥在高盐胁迫下存活率显著提高,
但是体内的 Na+略有降低 (图 10)。因此 , 推测
SiVHA-E 转基因植物可能是通过 SiVHA-E 介导的信
号途径激活V-H+-ATPase将Na+贮藏在液泡中, 减少
Na+毒害, 从而提高耐盐性。
Barkla 等[28]、Janicka-Russak 等[29]、Zhi 等[30]
和Kasai等[31]报道, 在盐胁迫下V-H+-ATPase活性增
加, 内源ABA水平也显著提高, 而且外源ABA能增
加 V-H+-ATPase的活性。本研究发现 ABA处理能引
起 SiVHA-E转录水平增加, 而且在种子萌发期 SiVHA-
1690 作 物 学 报 第 41卷

E过表达株系对 ABA更敏感(图 11和图 12), 证明过
表达 SiVHA-E基因正向调控植物 ABA信号途径。ABA
可以促进植物气孔关闭, 减少水分蒸腾[32-33]。本研究结
果显示, 在盐胁迫下, 转基因株系的相对含水量显
著高于野生型拟南芥, 证明 SiVHA-E 基因过表达可
能通过增强 ABA信号途径介导的植物气孔关闭, 减
少体内水分的流失, 减弱转基因植物渗透胁迫作用,
从而增强植物的耐盐性。
本研究结果显示在 SiVHA-E 转基因拟南芥中,
在盐胁迫下, 另一个重要的质子泵氢离子焦磷酸化
酶基因 AVP1和V-H+-ATPase c亚基基因 AVA-P2的表
达相比于野生型拟南芥都上调(图13)。在植物中过表
达 AVP1基因可以增强植物的耐盐性, V-H+-ATPase
活性的提高也可以提高植物的耐盐性[26,34-35]。由此推
测 SiVHA-E 转基因植物耐盐性提高可能与这2个盐
胁迫相关基因的上调表达相关。
4 结论
从谷子中克隆到液泡 H+-ATPase E 亚基基因
SiVHA-E, SiVHA-E 蛋白定位于液泡膜 , 并可被
NaCl、MeJA、SA、ABA等胁迫诱导表达。SiVHA-E
过表达株系在种子萌发期、幼苗期以及成苗期的耐
盐性均高于野生型拟南芥, 这些结果表明 SiVHA-E
基因在植物的耐盐胁迫调控过程中发挥重要作用。
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