全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(3): 414421 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由中国博士后科学基金(2012M511053)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2013ZX08011-006)资助。
*通讯作者(Corresponding authors): 董树亭, E-mail: stdong@sdau.edu.cn; 张杰道, E-mail: jdzhang@sdau.edu.cn
**同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-06-30; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2014-12-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141229.1001.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00414
玉米小分子热激蛋白 ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析
孙爱清 1,** 葛淑娟 2,** 董 伟 2 单晓笛 3 董树亭 1,* 张杰道 2,*
1山东农业大学农学院 / 作物生物学国家重点实验室 / 山东省作物生物学重点实验室, 山东泰安 271018; 2山东农业大学生命科学学
院, 山东泰安 271018; 3安徽大学生命科学学院, 安徽合肥 230036
摘 要: 植物热激蛋白是一类代表性高温响应蛋白。以玉米种质 POB21为材料, 克隆了一个 CDS序列长度为 477 bp
的小分子热激蛋白基因。该基因编码的蛋白含 158个氨基酸, 具有 HSP20蛋白典型的 ACD结构域, 预测的等电点为
5.36, 分子量为 17.746 kD, 被命名为 ZmHSP17.7。在水稻、拟南芥等植物基因组中都有其同源基因, 进化和亚细胞
定位分析表明, 此基因属 CI类小分子热激蛋白家族成员。Northern杂交分析表明, 高温快速诱导 ZmHSP17.7基因表
达, 15%PEG 模拟干旱胁迫不诱导该基因表达, 但在复合胁迫下干旱增强了高温的诱导效果。外源 ABA也不影响该
基因的表达。与野生型拟南芥相比, 超表达 ZmHSP17.7的转基因拟南芥在种子萌发和植株生长过程中表现出更强的
高温和干旱耐受性, 说明该基因可以在植物防御高温、干旱及复合胁迫中发挥一定作用。
关键词: 玉米; 小分子热激蛋白; 高温; 胁迫抗性
Cloning and Function Analysis of Small Heat Shock Protein Gene ZmHSP17.7
from Maize
SUN Ai-Qing1,**, GE Shu-Juan2,**, DONG Wei2, SHAN Xiao-Di3, DONG Shu-Ting1,*, and ZHANG
Jie-Dao2,*
1 State Key Laboratory of Crop Biology / Shandong Key Laboratory of Crop Biology / College of Agriculture, Shandong Agricultural University,
Tai’an 271018, China; 2 College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 3 College of Life Sciences, Anhui Univer-
sity, Hefei 230036, China
Abstract: Heat shock proteins are typical proteins responding to high temperature. Maize germplasm POB21 was used to isolate a
small heat-shock protein gene with a 477 bp CDS sequence. This gene, designated ZmHSP17.7, encodes a protein of 158 amino
acids, which contains the typical ACD domain of HSP20 proteins. The predicted isoelectronic point and molecular weight of
ZmHSP17.7 protein are 5.36 and 17.746 kD, respectively. The ZmHSP17.7 homologues were found in diverse plants, such as
Arabidopsis and rice. According to the phylogenetic and subcellular localization analyses, ZmHSP17.7 is considered as a member
of CI class of small heat shock protein family. The Northern blotting assay indicated that the expression of ZmHSP17.7 was
quickly induced by high temperature. Drought stress simulated by 15% PEG did not regulate the gene expression independently,
but enhanced the heat-induced gene expression under combined stress of high temperature and drought. Exogenous ABA had no
influence on ZmHSP17.7 expression. Overexpression of ZmHSP17.7 in Arabidopsis during seed germination and plant growth
enhanced tolerance to high temperature and drought stresses. Our results indicate that ZmHSP17.7 may play a certain role in pro-
tecting plant from high temperature, drought and their combination.
Keywords: Maize; Small heat shock protein; High temperature; Stress resistance
玉米是我国主要的粮食、饲料和工业原料作物,
生育期遭遇高温是造成黄淮海夏玉米产区玉米品质
和产量下降的重要原因。最近 50年内全球气温上升
了大约 1.0~4.5℃, 并有逐年上升的趋势[1]。近年来,
我国华北、西北以及黄淮地区每年出现气温普遍升
高的现象, 而气温每超过玉米正常生长温度 1℃, 能
够引起产量下降 3%~4%[2]。长期高温常常伴随干旱
发生, 使危害更加严重。
第 3期 孙爱清等: 玉米小分子热激蛋白 ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析 415
在高温胁迫下, 植物细胞中的各种酶和功能蛋
白容易发生构象改变, 甚至变性。在植物进化过程
中形成蛋白质量控制系统, 能够对损伤蛋白进行修
复和清除[3]。其中, 热激蛋白(HSP, heat shock protein)
就是蛋白质量控制系统成员的典型代表[4]。热激蛋
白主要是作为分子伴侣, 辅助蛋白正确折叠和运输,
维持蛋白的构象和功能稳定。根据相对分子量可以
把植物热激蛋白分成 HSP100、HSP90、HSP70、
HSP60、HSP40和小分子热激蛋白(sHSP, small mo-
lecular HSP)共 6种类型[5-6]。
小分子热激蛋白的分子量在 12~45 kD之间, 也
是保守性最低的一类热激蛋白。与其他类型的分子
伴侣不同, 小分子热激蛋白不能单独使非变性蛋白
再折叠, 但可以和未折叠蛋白及其他热激蛋白组成
复合物。所有小分子热激蛋白都有一个保守的 C 端
α-crystalline 结构域[7-10]。根据氨基酸序列、胞内定
位和免疫学交叉反应特性, 被子植物中的小分子热
激蛋白至少可分为 11 类, 6 种定位于细胞质和(或)
细胞核, 称之为胞质 I、II、III、IV、V、VI类(CI~CVI);
2种定位于线粒体, 即线粒体 I、II类(MTI、MTII); 其
他 3 类分别定位于内质网(ER)、叶绿体(CP)和过氧
化物酶体中(Px), 在 N端都有相应的信号肽[11-12]。
小分子热激蛋白在植物胁迫防御中常发挥重要
作用, 具有丰富的功能和遗传多样性。AtHSP17.6A
在种子发育过程中受高温和渗透胁迫诱导表达, 超
表达该基因能够增强拟南芥对干旱和盐的抗性[13]。
过量表达叶绿体 HSP21基因也能增强拟南芥的强光
和高温胁迫抗性[14]。超表达莲 NnHSP17.5能提高拟
南芥种子活力[15]。超表达水稻 Hsp17.7 则可以提高
水稻对干旱、高温和 UV-B 的抗性 [16-17]。表达
RcHsp17.8的大肠杆菌、酵母、拟南芥都表现出对高
盐的抗性 [18]。玉米中只有 HSP16.9、HSP17.0、
HSP17.3、HSP18.2和 HSP22等少数几个小分子热激
蛋白基因的研究报道, 这些小分子热激蛋白基因的
过量表达能够增强转基因植物的抗热性或激素敏感
性[19-22]。
我们从玉米基因组中分离了一个小分子热激蛋
白基因, 对其在高温和干旱两种非生物逆境中的表
达特性进行了分析, 并通过拟南芥异源超表达对其
在胁迫防御中的功能进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
玉米材料为国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)
提供的热带玉米种质 POB21的自选系, 拟南芥为哥
伦比亚生态型(Col-0), 大肠杆菌和根癌农杆菌菌株
分别为 DH5α 和 GV3101。克隆载体为 pMD18-T
vector, 植物表达载体为 pBI121。DL2000 DNA
Marker、DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶
购自 TaKaRa 公司; 质粒提取试剂盒购自 Omega 公
司; 卡那霉素、氨苄青霉素等化学试剂购自上海生
工生物工程有限公司; 带正电荷尼龙膜(Hybond N+)
购自 Amersham公司; DIG Northern Starter Kit购自
Roche公司。
参考 Cao等[21]和 Todorov等[23]的方法。取饱满
一致的玉米种子, 播种于沙床上, 25℃光照培养(12
h d–1) 10 d, 以生长整齐一致的健壮玉米幼苗为材料,
分别进行高温(38℃)、15% PEG-6000模拟干旱、高
温干旱复合胁迫和 100 µmol L–1 ABA处理, 处理时
间分别为 1 h、3 h、6 h和 12 h, 未经处理的正常培
养幼苗作为对照。胁迫处理结束后取植株的完全展
开叶片混合, 于液氮中保存, 用于基因克隆和表达
特性分析。
1.2 基因克隆及载体构建
以 TRIzol 法提取叶片总 RNA, 进行一步法
RT-PCR 扩增, 所使用的引物对为 ZmHSP17.7/F 和
ZmHSP17.7/R (表 1)。PCR反应条件为, 50℃反转录
30 min; 94℃预变性 2 min; 94℃变性 1 min, 53℃退
火 1 min, 72℃延伸 2 min, 32 个循环; 72℃延伸 5
min。PCR 产物经凝胶电泳回收后, 按照 pMD18-T
克隆载体构建操作说明进行 TA 克隆连接, 构建重
组克隆载体并转化大肠杆菌 DH5α, 通过 50 mg L–1
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
引物说明
Primer annotation
ZmHSP17.7/F AGGATCCGAAGTAACAACCGTCGTCGG 5′-primer with BamH I site
ZmHSP17.7/R AGAGCTCCCATGCTTGAACAGTTGTG 3′-primer with Sac I site
ZmHSP17.7/2R ACTCGAGGCCGGTGATCTGAATGGACT 3′-primer with Xho I site
ZmHSP17.7/3R TAATACGACTCACTATAGGGGCCGGTGATCTGAATGGACT 3′-primer for DIG-probe
416 作 物 学 报 第 41卷
氨苄青霉素抗性筛选和菌落 PCR 鉴定阳性克隆, 测
定序列。
通过 BamH I 和 Sac I 双酶切和体外连接, 将
ZmHSP17.7 基因取代植物表达载体 pBI121 上的
gusA报告基因, 构建 ZmHSP17.7超表达植物表达载
体(图 1-I), 转化农杆菌 GV3101, 用于拟南芥遗传转
化。利用 ZmHSP17.7/F和 ZmHSP17.7/2R引物对扩
增, 在基因的起始密码和终止密码的上游分别引入
BamH I和 Xho I酶切位点, 通过双酶切和体外连接
构建 pBI121-ZmHSP17.7:GFP 融合基因植物表达载体
(图 1-II), 用于洋葱表皮细胞的蛋白亚细胞定位分析。
图 1 ZmHSP17.7基因超表达载体和 ZmHSP17.7:GFP
融合表达载体图谱
Fig. 1 Schematic diagram of the overexpression vector of
ZmHSP17.7 and ZmHSP17.7:GFP fusion expression vector
1.3 基因表达特性分析
采用地高辛(DIG)-Northern 杂交分析基因表达
特性。以 ZmHSP17.7/F和 ZmHSP17.7/3R引物扩增
DNA 片段作为制备 RNA 探针的模板, 以 TRIzol 法
提取叶片总 RNA, 进行甲醛变性凝胶电泳和印迹转
膜, 参照 DIG Northern Starter Kit说明书进行探针的
合成和 DIG标记等杂交检测步骤。
1.4 蛋白洋葱表皮细胞亚细胞定位分析
参考 Xu 等[24]的方法, 将洋葱表皮切成 2 cm ×
2 cm 方块, 平铺在 MS 固体培养基上, 将 pBI121-
ZmHSP17.7: GFP融合表达载体质粒 DNA包裹金粉
颗粒, 利用 PDS-1000基因枪轰击洋葱表皮, 在固体
培养基上恢复培养 20 h后, 在荧光显微镜下观察细
胞中的 GFP绿色荧光。
1.5 生物信息学分析
采用在线工具 ProtComp v.9.0 database (http://
www.softberry.com/)预测蛋白的亚细胞定位。参考玉
米基因组数据库 (http://www.maizesequence.org/)基
因序列设计引物 , 水稻小分子热激蛋白序列来自
NCBI 公共数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), 拟
南芥小分子热激蛋白序列来自 TAIR 数据库(http://
www.arabidopsis.org/)。用 DNAman5.0 软件翻译
cDNA 序列并对蛋白序列进行相似性分析 , 采用
ExPASy在线工具(http://web.expasy.org/compute_pi/)
预测蛋白分子量和等电点 , 利用 ClustalX 和
MEGA4.0软件分析基因同源性并构建进化树。
1.6 拟南芥转化和鉴定
参考 Zhang 等[25]的方法转化拟南芥。将拟南芥
花序用农杆菌渗透液浸泡, 在保湿和低光强下生长
1~2 d后, 转入正常光照条件下生长, 成熟后收集种
子。种子经 3%次氯酸钠消毒后, 在含 50 mg L–1卡
那霉素的 MS 固体生根培养基上进行抗性筛选, 将
抗性苗转移至基质中正常光照条件下生长, 提取转
基因植株的总 DNA 为模板, 通过 PCR 扩增进行鉴
定。连续筛选 3 代, 以获得转基因纯合系。参考改
进的 Zhou 等[15]方法鉴定转基因拟南芥的高温抗性,
采用 40℃高温胁迫鉴定种子萌发过程抗性。以 3周
龄野生型和转基因拟南芥植株为材料, 分别进行干
旱、高温和复合胁迫抗性鉴定。干旱胁迫为自然干
旱脱水处理 7 d, 高温胁迫为 42℃高温处理 6 h后恢
复生长 7 d, 复合胁迫为自然干旱胁迫与高温胁迫的
叠加, 以正常生长条件下培养的拟南芥植株作为对
照。处理 7 d后观察并照相。
2 结果与分析
2.1 玉米小分子热激蛋白基因 ZmHSP17.7 的克
隆
利用基因芯片分析 38℃热激处理的玉米幼苗叶
片的基因表达谱, 检测到一个小分子热激蛋白基因
在热激后高水平表达。根据玉米基因组参考基因
ZmHSP17.4 (EU962980.1)序列设计特异引物, 以玉
米总 RNA反转录产物为模板, 对目的基因进行高保
真扩增 , 琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物片段为
500 bp左右, 与预期长度一致(图 2)。回收目的片段
并连接到 pMD18-T 克隆载体上 , 转化大肠杆菌
DH5α, 从中挑选重组子测序。
图 2 玉米 ZmHSP17.7 cDNA片段扩增
Fig. 2 PCR amplification of ZmHSP17.7 cDNA fragment in
maize
Marker: DL2000.
第 3期 孙爱清等: 玉米小分子热激蛋白 ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析 417
测序结果表明 , 目的基因编码区(CDS)序列全
长 477 bp, 编码 158 个氨基酸(图 3)。利用 ExPASy
pI/Mw 在线预测蛋白的等电点为 5.36, 分子量为
17.746 kD。该基因核酸序列与 EU962980.1 基因的
cDNA 序列在编码区相似性达 98%, 只有 11 个碱基
变异; 蛋白氨基酸序列相似性达 96%, 有 5个氨基酸
差异。表明已经成功克隆到所需小分子热激蛋白基
因, 根据分子量将其命名为 ZmHSP17.7, 将序列提
交 GenBank数据库, 序列号为 KJ789381。
2.2 ZmHSP17.7基因序列相似性和同源性分析
利用该基因编码的蛋白序列在 NCBI 公共数据
库中进行 BlastP 在线搜索发现, 高粱、水稻、二穗
图 3 玉米 ZmHSP17.7 cDNA及编码蛋白序列
Fig. 3 cDNA and protein sequence of ZmHSP17.7 in maize
短柄草、大麦、谷子、大豆和拟南芥等基因组中都
有其相似基因(图 4)。这些相似基因编码蛋白的氨基
酸序列相似性在 62%~96%, 分子量在 17.0~18.5 kD
范围内。各相似蛋白序列在 N 端保守性较低, 在中
部和 C 端相对保守, 几个单子叶植物的相似蛋白序
列在 N 端比双子叶植物(拟南芥和大豆)蛋白序列少
6 个氨基酸。在 ZmHSP17.7 的 54~157 氨基酸区是
HSP20 亚家族小分子热激蛋白典型的 ACD (Alpha
crystallin domain)结构域(pfam00011)。
利用 ClustalX和MEGA4.0软件, 根据拟南芥和
水稻基因组中小分子热激蛋白家族成员的氨基酸序
列同源性构建进化树, 将玉米 ZmHSP17.7及其基因
组数据库的参考序列 ZmHSP17.4和已报道的玉米小
分子热激蛋白 HSP16.9、HSP17.0、HSP17.8整合到
进化树上[19-20]。结果表明, ZmHSP17.7与参考序列同
源性最高, 与拟南芥和水稻 16.9~18.1 kD 的小分子
热激蛋白家族成员位于进化树的同一大分支上, 此
分支均为胞质 I 类(CI 类)小分子热激蛋白。其中,
ZmHSP17.7 与水稻 CI 类成员 OsHSP17.9A、
OsHSP17.7、OsHSP18.1 和 OsHSP17.4 有更高的同
源性(图 5)。说明 ZmHSP17.7 属于 CI 类小分子热
激蛋白。CI类小分子热激蛋白定位于细胞质和(或)
细胞核内 , 常参与盐、高温、低温和氧化胁迫等多
种逆境响应 [16-19,26], 暗示该玉米 ZmHSP17.7 基因
图 4 ZmHSP17.7及其直系同源基因编码蛋白的相似性分析
Fig. 4 Protein sequence alignment of ZmHSP17.7 and orthologous genes
BdHSP17.9 (XP_003558276.1), HvHSP17 (ADW78607.1), OsHSP17.3 (ADR30404.1), PgHSP17.9 (ACR78191.1), SbHSP17.4
(XP_002468126.1), GmHSP18.5 (NP_001235177.1), AtHSP17.4 (At3g46230.1); Zm, Zea mays; Sb, Sorghum bicolor; Pg, Pennisetum
glaucum; Os, Oryza sativa; Bd, Brachypodium distachyon; Hv, Hordeum vulgare; Gm, Glycine max; At, Arabidopsis thaliana.
418 作 物 学 报 第 41卷
图 5 玉米 ZmHSP17.7与拟南芥和水稻 sHSP基因家族的进化
分析
Fig. 5 Phylogenetic relationship of ZmHSP17.7 with other
sHSP gene family from Arabidopsis and rice
可能参与调控玉米对高温等非生物胁迫的响应 ,
在植物防御非生物胁迫的过程中起着非常重要的
作用。
2.3 蛋白亚细胞定位分析
为了更进一步了解 ZmHSP17.7蛋白的亚细胞定
位, 构建了 CaMV35S 启动子驱动下的 35S-ZmHSP17.7:
GFP融合蛋白表达载体(图 1)。提取融合蛋白表达载
体质粒 DNA, 通过基因枪轰击洋葱表皮细胞, 恢复
培养 20 h后在荧光显微镜下检测绿色荧光, 进行亚
细胞定位分析。转 35S-GFP对照载体的洋葱细胞中
GFP 基因为组成型表达, 绿色荧光在细胞核和细胞
质中均有分布, 细胞核中荧光信号强于细胞质, 无
论是在细胞核中还是在细胞质中 , 荧光分布较均
匀。与之相似, ZmHSP17.7:GFP 融合蛋白的绿色荧
光在细胞质和细胞核中都有分布, 但荧光分散不均
匀, 细胞质中有聚集的现象, 细胞核中的核仁区没
有荧光分布(图 6)。此结果与莲 NnHSP17.5:GFP 的
亚细胞定位结果一致[15], 说明尽管融合蛋白比 GFP
分子量增大了 17.7 kD, 但不影响其进入细胞核, 荧
光聚集可能来自热激蛋白的寡聚化[26]。
图 6 玉米 ZmHSP17.7:GFP融合蛋白在洋葱表皮中的亚细胞定
位分析
Fig. 6 Subcellular localization of the ZmHSP17.7:GFP fusion
protein in onion epidermal cells
2.4 ZmHSP17.7基因表达特性分析
利用 DIG Northern Blot检测 ZmHSP17.7基因的
表达特性表明, 该基因在 15%PEG 模拟干旱胁迫条
件下杂交信号很弱, 且随胁迫时间延长没有明显变
化, 说明单一干旱胁迫对基因表达没有影响(图 7)。
在 38℃高温胁迫下, 处理 1 h时杂交信号最强, 随着
处理时间延长信号逐渐减弱, 到 12 h时与对照一致,
几乎检测不到杂交信号。这说明 ZmHSP17.7基因能
快速响应高温胁迫而表达上调 , 但高温只诱导其
mRNA 在短期内积累, 不会随热激时间延长无限制
增加, 且在诱导一定时间后, 基因的诱导表达会被
抑制, mRNA被降解。高温和干旱复合胁迫下杂交
信号强度在 1 h和 3 h高于高温单独胁迫, 但 6 h后
表达下降更快, 说明复合胁迫下干旱增强了高温的
诱导效果, 同时也加快了后期的表达抑制进程。在
100 µmol L–1ABA 处理下, 杂交信号变化与干旱胁
迫下表现一致, 即 ZmHSP17.7 表达不受外源 ABA
影响。
第 3期 孙爱清等: 玉米小分子热激蛋白 ZmHSP17.7基因的克隆与功能分析 419
图 7 玉米 ZmHSP17.7基因的表达特性分析
Fig. 7 Analysis of gene expression of ZmHSP17.7 in maize
2.5 超表达 ZmHSP17.7 基因提高种子萌发高温
抗性
利用农杆菌介导的花序浸染法将超表达
ZmHSP17.7 基因导入拟南芥, 将野生型和转基因种
子平铺到MS培养基上, 高温处理 6 h后转移至正常
生长温度下培养, 比较鉴定萌发率表明, 40℃高温
胁迫时差异最明显, 转基因种子萌发高峰出现在第
2天, 萌发率增加 67.7%, 此后 3 d只增加了 12.3%,
最终达到 91.5%。而野生型种子萌发集中在第 2 天
到第 3天, 分别增加了 30.2%和 17.7%, 此后 2 d增
加了 6.3%, 最终达到 56.5% (图 8)。由此说明, 超表
达 ZmHSP17.7基因增强了种子对高温胁迫的耐受能
力, 使高温胁迫下转基因种子不仅比野生型拟南芥
种子萌发提前, 而且萌发率提高。
图 8 超表达 ZmHSP17.7基因(OE)对高温胁迫下拟南芥种子萌发的影响
Fig. 8 Effect of overexpression of ZmHSP17.7 gene on seed germination of Arabidopsis under heat stress
WT: 野生型植株; OE: 超表达 ZmHSP17.7的转基因株系; OE1、OE2和 OE3分别代表 3个独立转化系。
WT: wild-type plants; OE: transgenic lines over-expressing ZmHSP17.7; OE1, OE2, and OE3 represent three independent transgenic lines.
2.6 超表达 ZmHSP17.7提高植株旱热复合抗性
以 3 周龄野生型和转基因拟南芥植株为材料,
进行不同干旱高温逆境处理 , 比较超表达
ZmHSP17.7 基因对植株抗逆性的影响。在自然脱水
干旱条件下, 随基质中含水量的不断下降, 野生型
植株逐渐萎蔫死亡, 转基因植株仍能正常生长, 表
现出更强的脱水耐受能力(图 9)。在 42℃高温处理 6
h 后的恢复生长过程中, 野生型植株逐渐青枯死亡,
而超表达 ZmHSP17.7基因的植株仍能够恢复正常。
在高温和干旱复合胁迫时, 野生型植株比高温或干
旱单一胁迫下死亡更快, 而转基因植株虽然也表现
出胁迫伤害, 但损伤程度明显低于野生型植株。以
上结果表明 ZmHSP17.7基因的异源超表达能够显著
图 9 超表达 ZmHSP17.7基因对拟南芥转基因植株高温和干旱
耐受能力的影响
Fig. 9 Effect of overexpression of ZmHSP17.7 on heat and
drought tolerance of Arabidopsis plants
420 作 物 学 报 第 41卷
改善拟南芥植株对高温、干旱胁迫的耐受能力, 降
低胁迫对植物生长的影响。
3 讨论
植物热激蛋白是一类代表性的高温响应蛋白 ,
广泛参与多种逆境防御机制[27-28]。小分子热激蛋白
是热激蛋白基因家族中一个重要亚家族, 在细菌、
古细菌和一些单细胞真核生物中一般有 1~2 个小分
子热激蛋白基因, 而在一些高等真核生物中小分子
热激蛋白基因数目则较多, 如拟南芥基因组中检测
到 19个小分子热激蛋白基因, 水稻基因组中有个 23
个小分子热激蛋白基因[11]。这些成员中大部分蛋白
的分子量在 20 kD左右, 又称之为 HSP20家族[28]。
在已有研究的几个玉米小分子热激蛋白基因中, 尽
管它们分子量接近, 且都受高温诱导表达, 但在进
化分类、表达特性和功能等方面有明显差异[19-22]。
如 HSP16.9 和 HSP17.7 属于 CI 类, 而 HSP17.0 和
HSP17.8属于 CII类, HSP22从蛋白亚细胞分布上属
于线粒体小分子热激蛋白。HSP16.9 和 HSP17.7 能
够提高超表达转基因植株对高温的抗性, 而超表达
HSP18.2 能够提高转基因植株对激素 CTK 的敏感
性。HSP17.0和 HSP17.8尽管同属 CII类热激蛋白, 但
HSP17.0的分子伴侣活性较弱, 且表达受发育调节。
我们从玉米中分离的 ZmHSP17.7 基因属于 CI
类小分子热激蛋白。此基因的表达呈典型的高温诱
导特性, 能够快速响应高温胁迫。这种高温诱导特
性与其他小分子热激蛋白基因的表达特性是一致的,
其诱导表达水平通常受胁迫温度和胁迫时间的共同
影响。胁迫温度越高, 即胁迫强度越大, 基因表达响
应越快, 表达产物积累高峰出现所需时间越短。反
之, 胁迫强度小, 则 mRNA 积累减缓, 积累高峰时
间后移。但 mRNA产物不随胁迫时间的延长无限积累,
在达到积累高峰后很快下降, 直至完全消失[19,29-30]。鉴
于 ABA 在植物响应非生物胁迫过程中的重要功能,
常常把响应非生物胁迫的基因按照其表达是否受
ABA调控分为两类[31-32]。ZmHSP17.7基因的表达不
受外源 ABA 调节, 暗示其可能属于不依赖 ABA 的
胁迫响应基因, 但还需要进一步就内源 ABA是否影
响其表达进行验证。尽管 ZmHSP17.7的基因表达不
受 PEG 模拟的干旱调节, 但在干旱和高温复合胁迫
时, 干旱可以改变基因的热诱导表达水平, 这种协
同作用说明不同非生物胁迫在调控基因表达上既有
相对的独立性, 又有紧密的相互作用, 通过其共同
的代谢反应可以相互影响。
超表达 ZmHSP17.7基因不仅可以提高拟南芥对
高温胁迫的耐受能力, 也能改善其干旱胁迫抗性。
而且在我们的抗性鉴定中, 超表达 ZmHSP17.7 基因
的干旱胁迫抗性改良效果比高温胁迫抗性更显著 ,
这可能是拟南芥中内源小分子热激蛋白基因在高温
和干旱胁迫下的表达差异造成的。对拟南芥基因组
数据库基因芯片数据分析表明, 其内源的 6个 CI类
小分子热激蛋白基因均受热胁迫诱导表达 , 且在
1~3 h内达到高峰, 但都不受干旱诱导。在高温胁迫
的早期, 拟南芥内源的 CI类小分子热激蛋白基因同
样受诱导快速表达, 使得超表达 ZmHSP17.7 的作用
效果相对较小; 而在高温胁迫的后期和恢复过程中,
内源基因不再表达时, 组成型超表达 ZmHSP17.7 的
效果才能体现出来。干旱胁迫不诱导拟南芥内源的
CI 类小分子热激蛋白基因表达, 而在组成型超表达
ZmHSP17.7的转基因拟南芥中 ZmHSP17.7在整个干
旱胁迫过程中始终发挥作用 , 这可能是超表达
ZmHSP17.7 的转基因拟南芥抗旱性显著提高的重要
原因。根据多年来对植物抗逆机制的研究结果, 拟
南芥对干旱、高温胁迫的响应是一个复杂的综合反
应机制, 小分子热激蛋白基因对干旱、高温胁迫应
激的差异可能只是该综合反应机制的一个方面。高
温诱导表达的小分子热激蛋白基因可以在干旱胁迫
防御中发挥作用, 因此在对植物进行非生物逆境抗
性遗传改良过程中, 可能不仅要考虑改变胁迫防御
基因的表达水平, 还要考虑对这些基因表达模式的
调节。
4 结论
玉米 ZmHSP17.7基因编码分子量约 17.7 kD的
小分子热激蛋白, 属 CI 类亚家族成员。ZmHSP17.7
基因表达受高温快速诱导, 干旱不诱导该基因表达,
但能增强复合胁迫下该基因对高温的响应 , 外源
ABA不改变基因表达水平。增强该基因表达可以提
高转基因拟南芥植株对高温、干旱胁迫的耐受能力。
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