全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 424−430 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由西北农林科技大学基本科研业务经费(Z109021123)和国家自然科学基金项目(31371626)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 薛吉全, E-mail: xjq2934@163.com; 郭东伟, E-mail: gdwei1973@126.com
第一作者联系方式: E-mail: 158895300@qq.com (郭艳萍); 498985713@qq.com (任成杰) **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-05-13; Accepted(接受日期): 2013-10-20; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1607.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00424
玉米胚乳细胞原生质体的分离与流式纯化
郭艳萍** 任成杰** 李志伟 王文斌 张仁和 路海东 刘建超
张兴华 薛吉全* 郭东伟*
西北农林科技大学农学院 / 农业部西北旱区玉米生物学与遗传育种重点实验室, 陕西杨凌 712100
摘 要: 玉米胚乳是籽粒淀粉形成的主要场所, 胚乳细胞的发育对籽粒的器官建成具有重要意义。分离胚乳细胞原
生质体, 能为胚乳培养、转录组分析等后续研究提供均一实验材料。本文在借鉴前人研究的基础上, 通过调整酶的搭
配种类、浓度以及质膜稳定剂、渗透压稳定剂的使用, 优化了一套有效的玉米籽粒胚乳原生质体分离方法, 并进一步
运用流式分选技术纯化原生质体。结果表明, 以 1%纤维素酶、0.5%离析酶、0.5%半纤维素酶, 在渗透压调节剂 0.7~
0.8 mol L–1和质膜稳定剂 0.8 mol L–1的MS培养液内, 30℃消解 4 h, 能够获得大量完整的粗制原生质体, 二乙酸荧光
素(FDA)染色表明纯化的原生质体仍能保持 90%以上的生活力。流式分选术可将有活力原生质体从粗制原生质体悬
浮液中富集、纯化出来。对一些原生质体分离和流式分选时的技术参数和影响因素进行了讨论。
关键词: 玉米; 胚乳细胞; 原生质体; 内多倍化; 分离; 流式分选
Isolation and Flow Purification of Endosperm Protoplast from Developing Seed
of Maize
GUO Yan-Ping**, REN Cheng-Jie**, LI Zhi-Wei, WANG Wen-Bin, ZHANG Ren-He, LU Hai-Dong, LIU
Jian-Chao, ZHANG Xing-Hua, XUE Ji-Quan*, and GUO Dong-Wei*
College of Agronomy, Northwest A&F University / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Arid Area of Northwest Re-
gion, Ministry of Agriculture, Yangling 712100, China
Abstract: Grain starch is mainly synthesized in endosperm. The development of endosperm cell is critical to yield formation in
maize. Isolation and purification of endosperm cell protoplasts provide the homogeneous materials in many experiments, such as
endosperm culture, transcriptome analysis, and cell typing. In this study, we optimized the experimental system for isolating and
purifying maize endosperm protoplast. Plenty of crude protoplasts were obtained when endosperm tissue was digested in MS me-
dium for 4 h at 30℃, which contains 0.5% macerozyme, 0.5% hemicellulase, 1.0% cellulose, 0.7–0.8 mol L–1 osmotic stabilizer
and 0.8 mol L–1 membrane stabilizer. Staining of fluorescein diacetate (FDA) showed that purified protoplasts maintained more
than 90% of viability. The viable protoplasts were accumulated and purified from the crude protoplast suspension by flow sorting
technology. The key technical parameters and influencing factors on protoplast isolation and flow sorting were also discussed.
Keywords: Maize; Endosperm; Protoplast; Endoreduplication; Isolation; Flow sorting
玉米是重要的工业原料作物, 对国民经济发展
具有重要意义。玉米籽粒干物质的 70%~90%都存储
于胚乳, 是玉米经济和营养价值的主要来源, 因此
胚乳的正常发育是决定玉米经济产量形成的关键因
素[1]。和其他禾谷类作物一样, 玉米胚乳也属于核型
胚乳, 是植物双受精的产物。研究表明, 在受精后
2~4 h, 由源自母本的两个中央极核和一个源自父本
的精核融合而成的三倍体细胞核即开始快速同步分
裂, 形成由同一细胞膜包被的双核体。随后, 双核体
继续分裂 8~10次, 发育成一个含有 256~512个细胞
核的多核体。之后, 胚乳细胞内部各核之间的微管
不断加厚形成细胞壁, 逐渐将每个细胞核分隔开来,
第 3期 郭艳萍等: 玉米胚乳细胞原生质体的分离与流式纯化 425


并最终发育为正常的三倍体胚乳细胞[2]。在玉米胚
乳中, 细胞化过程通常在授粉后 4 d就已经完成, 随
后胚乳细胞进行正常的有丝分裂, 完成胚乳发育所
需细胞数目的增长, 直至授粉后 8~10 d, 胚乳中部
的一些细胞开始停止有丝分裂, 继而转向一种称之
为内复制(endoreduplication)的特殊的细胞分裂, 并
逐渐向胚乳外部扩散。在内复制过程中, 胚乳细胞
每个周期只进行一次正常的 DNA 复制, 但不分裂,
产生 DNA加倍一至数轮的大量内复制细胞。从发育
进程来看, 这种内复制分裂始于授粉后 8~10 d, 16 d
左右达到最大程度, 18~20 d后, 随着籽粒淀粉的积
累、细胞的失水凋亡而逐渐停止。此时, 胚乳中可
检测到 DNA含量达 96 C的内复制细胞。内复制的
直接结果就是细胞体积的快速增加, 由于胚乳细胞
的内复制进程与籽粒的快速膨大完全同步, 因此被
认为是玉米籽粒发育和经济产量形成的关键性动
力 [3]。理解玉米胚乳细胞内复制的分子调控机理和
生物学意义, 可为改善栽培措施、培育更具经济价
值的玉米新品种奠定理论基础。此外, 玉米胚乳还
是研究细胞发育的理想模型。根据各部分细胞的功
能和特征, 可将玉米胚乳分为糊粉层(aleurone)、淀
粉区 (starchy endosperm, SE)、基部转化层 (basal
endosperm transferlayer, BETL)和胚周区(endosperm
surrounding region, ESR)四部分, 尽管这些组织都由
同一胚乳细胞发育而来 , 却经历了不同的分化途
径。玉米胚乳各部分以及整个胚乳组织细胞发育的
分子调控机制至今仍不清楚。
转录组分析是新近发展起来的以 DNA 二代测
序为基础的基因表达分析技术, 它能够在整个转录
组水平上对基因的差异表达、SNP 检测和可变剪切
等转录水平上的表达情况快速系统分析, 有利于用
系统生物学的方法描绘基因表达和调控的时空网
络。目前, 该方法已广泛用于多个物种基因的表达
分析 [4], 但这些研究多集中在组织水平上 , 以特定
细胞为对象的转录组分析研究仍鲜有报道。如果通
过特定分离技术将不同特征的胚乳细胞分离出来进
行转录组分析, 就有可能对内多倍化、细胞凋亡、
细胞分化等生命现象的分子调控更精确地解释。为
此, 本研究在借鉴前人研究的基础上, 通过调整酶、
渗透调节物质和膜稳定剂的种类、浓度及反应时间,
优化了一套玉米胚乳细胞原生质体的酶解方案, 并
运用流式分选技术纯化原生质体, 以期为更深入的
特定细胞转录组分析及胚乳细胞原生质体培养提供
技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料
玉米自交系郑 58, 由西北农林科技大学农业部
西北旱区玉米生物学与遗传育种重点实验室提供。
分期播种材料, 人工套袋授粉, 取授粉后 8~ 10 d新
鲜果穗于 4℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 原生质体制备 在超净工作台上, 用手术
刀(11号)从新鲜果穗上切取若干完整籽粒, 横切, 取
中部淀粉区组织于 5.5 cm一次性培养皿, 切成 1 mm
左右小块, 转入 2.0 mL 离心管, 确保总量控制在
0.4~0.6 g之间, 加酶解液 1 mL, 振荡混匀, 使酶液
与组织充分接触, 于 30℃, 40 转 min–1振荡培养 2~
14 h, 每隔 2 h取样 1次, 统计原生质体数, 确定最
佳酶解时间。待酶解完成后, 以巴斯德吸管吸取酶
解混合液, 100 μm 滤网过滤, 以血球计数板在显微
镜下计算原生质体产量和活力。酶解液以 MS 为基
础培养基, pH 5.8, 采用 3 组合酶, 每种酶设高低 2
个浓度, 分别为纤维素酶 0.5%、1.0%; 半纤维素酶
0.5%、1.0%; 离析酶 0.3%、0.5%, 共 8个处理(表 1)。
设 0.6、0.7、0.8、0.9 mol L–1 4个渗透压稳定剂蔗糖
浓度处理 ; 质膜稳定剂处理分别为 Z1: 80%
CaCl2+20% MES+0.5 mmol L–1 DTT; Z2: 100%
CaCl2+25% MES+0.5 mmol L–1 DTT; Z3: 120%
CaCl2+30% MES+0.5 mmol L–1 DTT; Z4: 150% CaCl2
+35% MES +0.5 mmol L–1 DTT。
1.2.2 流式纯化 酶解后的原生质体混合物, 加
等量无酶培养液稀释 1倍, 经 100 μm滤网过滤, 滤
液加二乙酸荧光素(FDA)染液, 终浓度 0.01%, 避光
常温染色 30 min。用流式细胞仪(FACS calibur,
Becton Dickinson, USA)分选, 分选参数为输出功率
150 mW, 电压 400 V, 激发波长 488 nm, 指数放大,

表 1 不同酶浓度处理组合
Table 1 Treatment combination with different enzyme
concentrations (%)
处理
Treatment
离析酶
Macerozyme
纤维素酶
Cellulase
半纤维素酶
Hemicellulase
1 0.3 0.5 0.5
2 0.3 1.0 0.5
3 0.3 0.5 1.0
4 0.3 1.0 1.0
5 0.5 0.5 0.5
6 0.5 1.0 0.5
7 0.5 0.5 1.0
8 0.5 1.0 1.0
426 作 物 学 报 第 40卷


分析流速 1000~2000 Particle s–1。散点图设门分选,
分选模式 Normal-R, 分选流速 100~150 Particle s–1。
以 CEllquest软件获取数据进行流式核型分析。将原
生质体直接分选至干净载玻片上, 以荧光倒置显微
镜(Nikon, TE 2000-5)检测分选原生质体活力。
1.2.3 原生质体产量与活力统计 (1)原生质体
产量测定(采用血球计数板计数), 吸取原生质体混
合滤液 10 μL, 悬浮于血球计数板上, 在显微镜下逐
次数出 16 个方格内的原生质体。每样品重复 3 次,
取平均值; (2)原生质体活力测定(FDA 染色法), 用
丙酮配成 5 mg mL–1 FDA 溶液, 按照 25 μL mL–1
FDA对原生质体染色, 染色后放于黑暗处 20 min。
在荧光显微镜下 , 有活力的原生质发出绿色荧光 ,
无活力的不发光。随机选取 5个视野进行统计, 每样
品重复 3 次。原生质体存活率=(有活力的原生质体
数/原生质体总数)×100%。
2 结果与分析
2.1 原生质体分离
2.1.1 不同酶浓度及组合对原生质体产量和活力的
影响 原生质体以血球记数板随机统计 12 个记
数区域内的数目显示, 不同酶处理对原生质体的产
量和活力有显著影响。以 8 种酶组合分别处理胚乳
组织过夜酶解后, 结果如图 1所示, 处理 6原生质体
产量最高, 达到 180个, 其中有活力原生质体 47个,
占总数的 26.1%。处理 4 产量最低, 仅 62 个, 其中
活原生质体 13 个, 占 21.0%。不同酶浓度处理对原
生质体产量及活力的影响也存在明显差异。在 3 种
酶中, 离析酶对原生质体产量影响最大, 0.5%浓度
下的原生质体总数比 0.3%水平增加 45%, 而原生质
体活力没有显著下降。纤维素酶则对原生质体活力
影响最大, 低浓度水平(0.5%)下有活力原生质体占
原生质体总数的百分比为 36.3%, 显著高于高浓度
水平(1.0%)下的 27.5%; 而在两种浓度纤维素酶水
平下, 原生质体总数没有显著差异。半纤维素酶对
原生质体总数和原生质体活力的影响介于纤维素酶
和离析酶之间, 低浓度水平更有助于原生质体总数
的提高和原生质体活性的维持, 半纤维素酶的这种
影响同时受纤维素酶和离析酶的影响, 在离析酶高
浓度水平下, 配合高浓度的纤维素酶比低浓度更有
助于提高原生质体产量和活力。综上认为, 酶组合
处理 6 (0.5%的离析酶+0.5%半纤维素酶+1%纤维素
酶)为玉米胚乳原生质体分离的最佳选择。

图 1 不同酶浓度及组合对原生质体产量与活力的影响
Fig. 1 Effect of different enzyme concentrations and composi-
tion on the yield and vigor of protoplasts
1: 0.3%离析酶+0.5%纤维素酶+0.5%半纤维素酶; 2: 0.3%离析酶
+1.0%纤维素酶+0.5%半纤维素酶; 3: 0.3%离析酶+0.5%纤维素
酶+1.0%半纤维素酶; 4: 0.3%离析酶+1.0%纤维素酶+1.0%半纤
维素酶; 5: 0.5%离析酶+0.5%纤维素酶+0.5%半纤维素酶; 6:
0.5%离析酶+1.0%纤维素酶+0.5%半纤维素酶; 7: 0.5%离析酶
+0.5%纤维素酶+1.0%半纤维素酶; 8: 0.5%离析酶+1.0%纤维素
酶+1.0%半纤维素酶。
1: 0.3% macerozyme+0.5% cellulase+0.5% hemicellulase; 2: 0.3%
macerozyme+1.0% cellulase+0.5% hemicellulase; 3: 0.3%
macerozyme+0.5% cellulase+1.0% hemicellulase; 4: 0.3%
macerozyme+1.0% cellulase+1.0% hemicellulase; 5: 0.5%
macerozyme+0.5% cellulase+0.5% hemicellulase; 6: 0.5%
macerozyme+1.0% cellulase+0.5% hemicellulase; 7: 0.5%
macerozyme+0.5% cellulase+1.0% hemicellulase; 8: 0.5%
macerozyme+1.0% cellulase+1.0% hemicellulase.

2.1.2 渗透压稳定剂对原生质体的影响 维持适
当的渗透压是确保细胞正常代谢的基本条件之一。
细胞内外的渗透压差决定着细胞与外部环境之间的
物质交流取向。当渗透压差过大时细胞将丧失主动
吸收能力, 造成水分缺失或过渡吸水, 给细胞的空
间结构带来严重伤害, 进而影响到细胞活力。在原
生质体分离过程中, 由于失去了细胞壁的保护, 原
生质体会更加脆弱, 因此确保反应体系与原生质体
内渗透压平衡对于原生质体分离的产量和活力至关
重要[5]。本文以蔗糖为渗透压调节剂, 研究了 4种浓
度下, 以最佳酶处理组合处理胚乳组织过夜酶解时,
原生质体时产量和活力。图 2 表明, 不同渗透压水
平下, 原生质体产量和活力存在明显差异; 原生质
体产量和活力随渗透压的增大而提高, 但二者的峰
值并不同步, 在 0.8 mol L–1时, 16个计数区域内原生
质体总数 117个, 达到最高, 而有活力的原生质体只
有 23个; 原生质体活力则在 0.7 mol L–1维持了最高
水平, 在统计的 104 个原生质体中, 有活力原生质体
41个, 占总数的39.4%; 因此, 在玉米胚乳的原生质体
分离时, 酶解液蔗糖浓度应介于 0.7~0.8 mol L–1之间,
更高浓度(0.9 mol L–1)蔗糖处理下, 导致原生质体产
第 3期 郭艳萍等: 玉米胚乳细胞原生质体的分离与流式纯化 427


量和活力显著下降。这可能是因为低浓度 (0.6 mol L–1)
水平时, 原生质体渗透压远大于酶分离液的渗透压,
细胞被动吸水胀破或结构发生改变。在高蔗糖浓度
水平下, 原生质体渗透压低于分离液, 细胞失水皱
缩, 部分原生质体因体积变小在过滤时流失, 另一
部分原生质体则因为失水失活, 最终导致原生质体
产量和活力下降。

图 2 渗透压稳定剂对原生质体分离的影响
Fig. 2 Effect of osmotic pressure regulator on protoplasts
isolation

2.1.3 质膜稳定剂对原生质体的影响 与渗透压
稳定剂作用类似, 在酶解反应体系中加入质膜稳定
剂也是为了保护原生质体膜的完整性或促进原生质
体培养时细胞壁的再生 [6], 常用的质膜稳定剂有葡
萄糖硫酸钾、MES、氯化钙等[7]。本文以氯化钙和
MES为质膜稳定剂, 研究了4种不同浓度配比下, 原
生质体酶解的产量及活力。结果表明(图3), 在设定
的4个浓度范围内, 伴随着质膜稳定剂浓度的提高,
原生质体的产量及活力均显著提高 , 在 Z4水平
(150% CaCl2+35% MES +0.5 mmol L–1 DTT)达到峰
值。至于更高浓度的质膜稳定剂能否进一步提高原
生质体产量和活力, 尚待进一步实验研究。

图 3 质膜稳定剂对原生质体分离的影响
Fig. 3 Effect of membrane stabilizer on protoplasts isolation
Z1: 80% CaCl2+20% MES+0.5 mmol L–1 DTT; Z2: 100% CaCl2+25%
MES +0.5 mmol L–1 DTT; Z3: 120% CaCl2+30% MES+0.5 mmol L–1
DTT; Z4: 150% CaCl2+35% MES +0.5 mmol L–1 DTT.

2.1.4 酶解时间对原生质体的影响 按照最佳酶
处理组合、最适渗透压、最适质膜稳定剂浓度, 重
新配置酶解液, 调节 pH至5.8, 分装在2.0 mL离心
管中, 每管1 mL, 加胚乳材料0.5 g。在30℃、40转
min–1条件下酶解, 间隔2 h 取样统计原生质体总数
及活原生质体数, 直至14 h。结果如图4所示, 原生
质体产量和活力与酶解时间密切相关, 以酶解液处
理2 h, 时间不足, 材料不能得到充分酶解, 原生质
体产量较低, 12个视野内的原生质体数仅76个, 其
中有活力原生质体65个, 占原生质体总数的85.5%;
4 h 处理时的原生质体产量达到最大值219个, 同期
的活原生质体数204个, 占总数的93.2%;处理时间超
过4 h, 原生质体总数急剧降低(6~12 h), 但此时活
性原生质体数占原生质体总数的百分比仍在
76.9%~95.2%之间 , 这说明酶解时间过长时 , 源自
振荡培养的物理剪切力会导致原生质体大量破裂 ,
产量下降, 但未破裂的原生质体在反应体系中仍能
维持较长时间活性[8]。对于玉米胚乳材料, 4 h为最
佳酶解时间。

图 4 酶解时间对原生质体分离的影响
Fig. 4 Effect of digestion time on protoplasts isolation

2.2 原生质体纯化
酶解后的原生质体悬浮液中混有多种成分, 主
要是淀粉体、原生质体和细胞碎片, 其中的淀粉体
呈白色球体(图 5)。淀粉体最初被细胞膜包被在细胞
内, 在分离过程中由于振荡的物理剪切力或其他原
因导致原生质体破裂时被释放到反应体系中, 由于
一个原生质体中包含有多个淀粉体, 因此释放出的
淀粉体数量常常超过体系中原生质体的数量。这些
淀粉体对原生质体的后续利用会产生较大影响, 需
要将它们与原生质体有效分离。我们以 FDA对原生
质体悬浮液染色, 采用流式细胞仪对原生质体分选
纯化[9]。体系中有活力的原生质体能够被染色, 在荧
光显微镜下被激发出绿色荧光, 没有活性的淀粉体
以及失活的原生质体则不能被染色, 在显微镜下呈
428 作 物 学 报 第 40卷


黑色(图 6)。当染色后的原生质体悬浮液通过流式细
胞仪时, 一元流式核型图上能够形成两个明显的峰
(图 7), 在散点图上则形成明显的 2 群粒子, 经分选
鉴定它们分别为原生质体和淀粉体粒子群(图 8), 再
对原生质体群设门分选, 分离出的原生质体纯度超

图 5 未纯化原生质体
Fig. 5 Unpurified protoplasts

图 6 FDA染色后的原生质体
Fig. 6 Protoplasts dyed with FDA

图 7 一元流式核型图
Fig. 7 Unitary Diagram of flowing karyo

图 8 流式散点图
Fig. 8 Flowing diagram of scatter plot
过 98%, 100%保持活性(图 9)。结果表明, 用流式分
选法可有效分离胚乳细胞原生质体。

图 9 流式纯化后的原生质体
Fig. 9 Protoplasts flow sorted

3 讨论
3.1 原生质体分离
原生质体是指细胞中除了细胞壁以外的所有部
分, 由于没有了细胞壁的阻隔和组织结构的限制,
原生质体具有普通植物细胞所不具有的用途, 如用
于体细胞杂交创造新物种及新的种质材料[10]; 用作
转化受体进行外源遗传物质的转化以及进行细胞生
长发育的理论研究[11]。从 1960年 Cooking首创了酶
法分离原生质体的方法以来 [12], 大量植物原生质
体的分离、离体培养及体细胞杂交等研究获得了成
功 [13], 但这主要针对双子叶植物, 用于原生质体分
离的材料也主要限制在叶肉、根尖等组织[14]。禾谷
类作物的原生质体分离和后续利用研究进展相对较
慢, 实验结果重复性较差, 仅有水稻[14]、大麦[15]等
作物原生质体分离和再生的报道。玉米的原生质体
分离与再生的研究一直进展缓慢, 从 1987年蔡启贵
等首次培养花药胚性愈伤组织原生质体并获得再生
植株以来[16], 玉米原生质体的再生依然鲜有成功报
道。理论上, 玉米各生活组织都能够通过酶解的方
法获得原生质体, 但这并不包括胚乳组织, 尽管利
用胚乳制备出的原生质体可为获得三倍体植株再
生、胚乳细胞生长发育的分子调控、胚乳细胞表达
分析等研究提供均一、稳定的受体, 但直接从幼嫩
的胚乳中分离原生质体是很困难的[17], 这主要是因
为 10 d左右的胚乳细胞中积累了大量的淀粉体, 酶
解处理时, 这些淀粉体在剪切力及酶解液的作用下
会分散到整个反应体系, 严重限制胚乳细胞原生质
体后续利用。本文参考了一些在大麦、水稻原生质
体分离、玉米造粉体分离[18]上的方法, 将纤维素酶、
半纤维素酶和果胶酶按一定浓度配比分离花后 10 d
第 3期 郭艳萍等: 玉米胚乳细胞原生质体的分离与流式纯化 429


左右的胚乳组织原生质体, 结果表明, 酶解处理时
间对原生质体的产量及活力影响最大, 在最初过夜
培养确定酶浓度及酶解反应条件时, 原生质体的产
量和活力远少于在最佳处理时间 4 h 下的产量和活
力; 用于胚乳原生质体分离的酶浓度、酶解反应条
件、以及渗透压和质膜稳定剂的使用方法与前人在大
麦等胚性愈伤组织酶解中所采用的方法基本一致。
3.2 原生质体纯化
粗制的原生质体溶液中含有大量的淀粉体及细
胞碎片(图 5), 需要对原生质体分离纯化。本实验首
先采用 Ficoll 漂浮法[19]去除粗酶解液中的大部分杂
质(图10), 但在除杂的同时, 原生质体的数量也损失
较大 , 直接影响后续实验 , 而采用流式纯化法 , 并
得到了较好的效果(图 9)。

图 10 Ficoll漂浮法纯化后的原生质
Fig. 10 Purified protoplasts with Ficoll flotation method

流式细胞分选术是近年来新发展起来的一项悬
浮粒子高通量分离技术, 已被广泛用于染色体、干
细胞、原生质体等的分选[4], 但用于玉米胚乳细胞原
生质体的分选尚属首次。先前的大量非特异性分选
研究多采用 DAPI 及 PI 等 DNA 插入型荧光剂进行
染色, 其中 DAPI显示了较高的分辨率, 可用于植物
染色体的分选。但在本研究中, 我们以 DAPI对原生
质体染色时, 不同原生质体间染色不均匀(图 11 和
图 12), 部分原生质体只在细胞核部位染色, 这可能
是细胞膜的选择性吸收所引起的。这种细胞核染色
和全细胞染色将增加分选的背景噪音, 降低细胞的
分选精度 , 在含有大量淀粉体背景的情况下 , 以
DAPI为染料可能无法对有活力原生质体有效分离。
FDA 染液自身无荧光, 但当它被活细胞选择性地吸
入细胞后 , 能被细胞质中的酯酶降解而发出荧光 ,
是一种有效的活细胞染色剂, 当以 FDA对酶解的玉
米胚乳原生质体染色时, 有活力原生质体能够被染
色, 在紫外激光激发下发出绿色荧光, 失活原生质
体则不能被有效染色呈黑色(图 6), 染色后的原生质

图 11 未染色原生质体
Fig. 11 Protoplasts un-dyed

图 12 DAPI染色后的原生质体
Fig. 12 Protoplasts dyed with DAPI

体能被流式细胞仪识别, 将活性原生质体分离出来,
这将为后续的胚乳原生质体大规模分选以及更深入
的胚乳细胞生长发育调控研究奠定基础。
4 结论
授粉后 8~10 d的玉米胚乳组织以 1%纤维素酶,
混合 0.5%的离析酶和 0.5%的半纤维素酶, 在渗透压
0.7~0.8 mol L–1和质膜稳定剂 0.8 mol L–1的MS培养
液内, 30℃消解 4 h, 能够获得大量完整的粗制原生
质体, 并保持 90%以上的生活力。用流式分选术可
将有活力原生质体从粗制原生质体悬浮液中有效富
集、纯化。
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