全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(4): 593600 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08005-004), 江苏省农业科技自主创新资金项目[cx(14)2065]和江苏省现代作物
生产协同创新中心(JCIC-MCP)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn, Tel: 025-84396523
Received(收稿日期): 2014-10-17; Accepted(接受日期): 2015-02-06; Published online(网络出版日期): 2015-03-02.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150302.0301.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00593
受多逆境诱导表达的 GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析
杜 皓 丁林云 何曼林 蔡彩平 郭旺珍*
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 教育部杂交棉创制工程研究中心, 江苏南京 210095
摘 要: WRKY 蛋白属于锌指型转录调控因子, 参与植物生长发育及耐逆响应。以陆地棉遗传标准系 TM-1为材料,
克隆GhWRKY64 (KF031101)基因上游1064 bp的启动子序列, 并对其调控元件及功能进行分析。生物信息学分析表明,
该区域含 18个组织器官表达及诱导表达关键元件 , 分别为 6个 ROOTMOTIFTAPOX1根特异调控元件 , 4个
CACTFTPPCA1叶肉特异性调控元件、4个 OSE2ROOTNODULE 病菌诱导元件、2个 GTIGMSCAM4盐调控元件和2
个 W-box胁迫应答响应元件。将该启动子与 GUS基因融合, 构建 pBIW64:GUS植物表达载体, 通过农杆菌介导叶盘
转化法获得12个转基因烟草株系。选择 GUS表达量最高的 pBIW64-5进行转基因不同组织器官表达及诱导表达分析。
GUS组织化学染色显示, 苗期的转基因烟草植株在叶和根部均具有 GUS活性, 开花期在转基因烟草植株根、叶及叶
柄均检测到 GUS活性, 特别在转基因烟草的根及根尖部分染色更深, 在茎和花组织上未检测到 GUS活性。对该转基
因烟草幼苗进行黄萎病菌诱导处理, 诱导48 h后, 转基因烟草幼苗根和叶片的 GUS染色比未诱导处理的对照明显加
深。结果表明, GhWRKY64上游1064 bp长度的 DNA序列，具有启动子的相关顺式作用元件，且为病原菌诱导型启动
子。该启动子可为开展棉花抗黄萎病转基因研究提供调控元件。
关键词: GhWRKY64启动子; 逆境胁迫; 转基因烟草; 调控元件; GUS活性
Cloning and Functional Identification of Promoter Region of GhWRKY64 In-
duced by Multi-stresses in Cotton (Gossypium hirsutum)
DU Hao, DING Lin-Yun, HE Man-Lin, CAI Cai-Ping, and GUO Wang-Zhen*
State Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement / Hybrid Cotton Research & Development Engineering Research Center, Minis-
try of Education, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: WRKY proteins are members of a transcription factor family with Zinc-finger structure in higher plant, which partici-
pate in various physiological processes and responses to multiple stresses. In this study we isolated a 1064 bp promoter sequence
of GhWRKY64 (KF031101) from Gossypium hirsutum acc. TM-1 and analyzed its regulatory elements and functional characteri-
zation. Bioinformatics analysis revealed 18 putative tissue-specific or stress-induced regulatory motifs corresponding to known
cis-elements in eukaryotic genes, including six ROOTMOTIFTAPOX1 of root-specific regulatory elements, two W-boxes, four
CACTFTPPCA1 mesophyll-specific regulatory elements, four OSE2ROOTNODULE of pathogen-induced elements, and two
GTIGMSCAM4 of salt-induced regulatory elements. The vector pBIW64:GUS was constructed by cloning the pGhWRKY64
promoter region into a pBI121 plasmid upstream of the β-glucuronidase (GUS) reporter gene. Twelve transgenic tobacco plants
were obtained by means of Agrobacterium-mediated leaf-disc transformation. Transgenic line pBIW64-5 with the highest GUS
expression was selected for tissue-specific expression and induced-expression analyses. Histochemical analyses indicated that the
full-length promoter directed efficient expressions of the reporter gene in root and leaf of pBIW64-5 seedlings, and root, leaf and
petiole of pBIW64-5 plants at flowering stage, especially in root and root tip; however, no GUS activity was detected in stem and
flower in the transgenic tobacco plants. The pBIW64-5 seedlings were also inoculated with Verticillium dahliae for 48 hours and
the GUS activities in root and leaf showed the increased expressions compared to that of the untreated transgenic tobacco plants.
Our results suggest that the upstream region of GhWRKY64 with 1064 bp contains cis-elements of the promoter, and is also a
pathogen-induced promoter. This promoter is an efficient regulatory element in cotton transgenic research aiming at resistance to
594 作 物 学 报 第 41卷
Verticillium dahliae.
Keywords: GhWRKY64 promoter; Abiotic and biotic stress; Transgenic tobacco; Regulatory elements; GUS activity
植物生长环境经常受复杂多变的逆境胁迫影
响。在长期进化过程中, 植物对各种不良环境产生
胁迫应答反应, 并调控自身代谢过程中转录水平与
转录后水平基因的表达, 形成一套完整的耐胁迫机
制。植物各种诱导型基因的表达主要受大多以家族
形式出现的转录因子调控, 进而参与植物对生物和
非生物胁迫的应答反应[1]。启动子作为具有调控作
用的反式作用因子, 通过与转录蛋白结合有效控制
基因转录的起始时间, 表达部位和表达程度。
组织特异性启动子不仅可以有效驱动外源基因
发挥其功能, 而且使外源基因的表达更具有针对性,
实现定时、定点、定量在植物中表达[2-3]。杨学文等[4]
从玉米自交系综 31基因组中分离茎特异表达启动子
ZmSSP, 通过转化烟草检测其融合基因 GUS 活性,
证明 ZmSSP 是茎组织特异性启动子, 可启动目标基
因在茎中专化表达, 有效改良玉米地上性状营养器
官。颜彦等[5]用电子克隆法从水稻明恢 63基因组中
获得鞘叶特异表达启动子 GSP, 构建 GSP:GUS转化
水稻受体中花 11, 对转基因后代的GUS活性分析证
明 GSP 是一个叶鞘和叶片特异表达启动子, 对改良
水稻叶型具有很好的应用价值。
WRKY 转录因子是一个大基因家族 , 参与植
物的生长、发育、衰老等进程, 对各种生物和非生
物胁迫都有一定响应。当受到病原菌、损伤、水杨
酸(salicylic acid)等因子诱导时, WRKY基因的特异
性识别序列(T)(T)TGAC(C/T) (W-box)将调控基因
表达 , 参与抗逆生理过程 , 促进植物生长发育 , 有
效应对各种逆境胁迫[6]。郝中娜等[7]利用 GUS报告
基因分析 OsWRKY19 基因启动子受多种胁迫处理
后的表达情况和表达的组织特异性, 明确其受多胁
迫诱导后优势表达。棉花是世界性重要经济作物 ,
前期我们根据雷蒙德氏棉基因组序列信息 [8-9]完成
了棉花全基因组 WRKY 转录因子家族的发掘、鉴
定和分类研究, 并对其表达特征进行初步分析[10]。
其中 GhWRKY64 在陆地棉根和叶中优势表达, 且
在根中表达量最高。对不同逆境胁迫分析表明 ,
GhWRKY64受黄萎病菌及干旱、高盐胁迫诱导显著
上调表达。为了进一步揭示 GhWRKY64 的功能作
用特征, 本研究用陆地棉遗传标准系 TM-1 克隆其
启动子序列, 分析其调控元件及功能, 以进一步明
确 GhWRKY64的作用机制, 为棉花抗逆育种利用提
供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
陆地棉遗传标准系 TM-1 (Gossypium hirsutum
acc. TM-1)、烟草 (Nicotiana tabacum)品种三生烟
NC98, 均由本实验室保存并繁殖。大肠杆菌(Esche-
richia coli)菌株 DH5α、根癌农杆菌(Agrobacterium
tumefaciens) 菌株 LBA4404、黄萎病菌株 VD8及植
物表达载体 pBI121:GUS质粒等均由本实验室保存。
DNase (RNase Free)、Taq DNA 聚合酶、pMD19-T
simple vector、T4-DNA连接酶、限制性内切酶及修
饰酶均购自 TaKaRa公司(Japan); DNA胶回收、质粒
提取试剂盒均购自 Axygen公司(USA); M-MLV反转
录酶购自 Progema 公司(USA); 其他常规试剂均为
国产分析纯。
1.2 GhWRKY64启动子的克隆与序列分析
采用 CTAB 法[11]从陆地棉 TM-1 新鲜幼嫩的叶
片中提取 DNA。根据公布的二倍体棉花雷蒙德氏棉
基 因 组 序 列 (http://www.phytozome.net/), 搜 寻
GhWRKY64 同源基因在基因组的位置, 预测其上游
启动子序列并设计 PCR 引物。将 PCR 产物连接到
克隆载体 pMD19-T simple vector上, 测序验证产物
大小及准确性。分别采用 PlantCARE (http://bioinfor-
matics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/), BDGP
(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html) 和
Place (http://www.dna.affrc.go.jp/htdocs/PLACE/) 等
软件对启动子序列的相关作用元件进行分析。用
Primer 5.0 (http://www.premierbiosoft.com/)设计引物
(表 1), 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成和测序。
1.3 GhWRKY64启动子表达载体的构建
在 GhWRKY64启动子序列两侧设计构建植物表
达载体的引物, 其中正向引物末端加入Xba I酶切位
点, 反向引物末端加入 Hind III 酶切位点。将 PCR
扩增获得的目标片段连接 pMD-19 T simple载体, 获
得 pMD19-T-GhWRKY64 启动子质粒, 经酶切与测
序分析验证序列准确性。分别用 Hind III和 Xba I双
酶 切 pMD19-T-GhWRKY64 与 植 物 表 达 载 体
pBI121:GUS 质粒, 用 GhWRKY64 启动子替换 35S
启动子。将构建的含有目的片段启动子与 GUS融合
的植物表达载体, 命名为 pBIW64:GUS。
第 4期 杜 皓等: 受多逆境诱导表达的 GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析 595
表 1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence information (5–3)
用途
Purpose
PW64F1
PW64R1
F: ACCTCAATCATTCGTGTCACGCTAA
R: CTCACCAGTGTCCCCTGCTCC
克隆 GhWRKY64启动子
Cloning GhWRKY64 promoter region
PW64F2
PW64R2
F: GCTCTAGATTTTCTTTTCCTTTTCC
R: CCCAAGCTTTATAATTATTGTTTTA
含 GhWRKY64启动子的植物表达载体构建与检测
pBIW64:GUS construct and identification
GUSF3
GUSR3
F: GGTTTGAAGAGTACCGAAGA
R: CATTTTTACGATTACAACATTATTA
GUS基因组及转录组检测
GUS detection at genomic and transcriptional level
ActinF4
ActinR4
F: TGTCATGAACAGATGGCTCTAACTCT
R: TACCTTGATTACTCGTCGAGTGAAGA
内标对照
Reference gene
1.4 转 pBIW64:GUS烟草的遗传转化
将构建好的表达载体转化农杆菌菌株 LBA4404,
采用农杆菌介导叶盘转化法导入野生型烟草, 利用
改良的组织培养技术获得烟草转基因植株[12]。利用
50 µg mL–1 卡那霉素抗性筛选并继代生根, 获得再
生转化幼苗, 移栽温室培养。
1.5 转基因烟草抗性筛选与分子检测
取长势相同的野生型 WT 和转基因 T1代种子
以 75%酒精处理 45 s, 无菌 ddH2O清洗 2~3次 ; 继
续用 15%次氯酸钠浸泡 10~15 min, 无菌 ddH2O清
洗 5~6 次。将消毒种子点播于含 100 µg mL–1卡那
霉素的 1/2MS 培养基上 , 置温室(30℃左右)光照
培养 , 约 30 d 后观察长势 , 将经卡那霉素选择标
记抗性筛选的阳性幼苗移栽到正常生长环境 , 取
样和留种。
分别以植物表达载体 pBIW64:GUS 质粒和未转
化烟草植株 WT 作阳性和阴性对照, 提取其基因组
DNA, 进行GUS和GhWRKY64基因启动子序列 PCR
检测分析。
采用 RNA提取试剂盒(Bioer Technology, 北京)
提取转基因烟草根和叶总 RNA。采用微量分光光度
计(Nanodrop, USA)和 1%琼脂糖凝胶检测 RNA的浓
度和质量。取 2 μg总RNA用于 cDNA第 1链合成, 研
究方法参照试剂盒说明书(Vazyme Biotech, 南京)。
以烟草持家基因 β-actin 作为内参基因, 利用实时荧
光定量 PCR仪(ABI 7500型, USA)进行 GUS基因实
时荧光定量 PCR分析。从每个株系选 3 个单株, 每
个样品设 2次重复。采用 2–ΔΔCt法进行数据的相对定
量分析[13]。
1.6 GUS活性组织染色分析
选取卡那霉素抗性筛选和 PCR 检测均为阳性,
且长势一致的转基因烟草 T1代幼苗, 进行GUS组织
化学染色[14]。将 T1代转基因烟草植株培育到开花期,
取其根、茎、叶、花等组织分别置 1.5 mL的 Eppendorf
管染色液中, 37℃避光 24 h, 直接观察样品染色情
况。去除样品染色液, 用 70%乙醇︰冰乙酸(9∶1)
脱色液脱去叶绿素至阳性对照为白色, 观察并照相
记录结果。利用转基因烟草 T1代阳性植株及野生型
对照长至 3片真叶期幼苗, 接种黄萎病菌 VD8进行
诱导处理。将 VD8 菌液均匀涂抹于 PDA 培养基表
面, 并覆盖一层滤纸, 将待测烟草小苗轻轻置滤纸
培养基上, 封口于光照培养箱培养 48 h, 进行 GUS
组织化学染色鉴定。
2 结果与分析
2.1 GhWRKY64启动子克隆与相关调控元件分析
根据公开释放的二倍体雷蒙德氏棉基因组序列
信息 (http://www.phytozome.net/), 预测 GhWRKY64
同源基因的启动子序列, 设计 PCR 引物扩增四倍体
陆地棉 TM-1 叶片 DNA, 获得一条长 1064 bp 的目
的条带。序列分析表明来自陆地棉 TM-1 中的
GhWRKY64 启动子序列与二倍体雷蒙德氏棉基因组
中同源序列同源性为 98%。
运用 BDGP、Place 和 Plant CARE 等软件对
GhWRKY64 启动子区域调控元件, 发现该区域含有
许多高等植物重要的顺式调控元件, 以及组织器官
表达及诱导表达专化元件。这些元件主要包括顺式
作用元件 CAAT-box 8个和 TATA-box 1个; 植物根
特异性表达调控元件 ROOTMOTIFTA POX1(ATATT)
6 个; 叶肉组织特异表达启动元件 CACTFTPPCA1
(TACT) 4个; 与病原菌诱导相关元件 OSE2ROOTN
ODULE(CTCTT) 4 个; 盐诱导响应相关元件 GT1
GMSCAM4(GAAAAA) 2 个; 参与植物胁迫应答响
应元件 W-box(TGACC) 2个(图 1)。
596 作 物 学 报 第 41卷
图 1 GhWRKY64启动子调控元件预测
Fig. 1 Prediction for regulatory elements in GhWRKY64 promoter region
“ ”表示 CAAT-box (CAAT); “ ”表示 ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT); “ ”表示 GT1GMSCAM4 (GAAAAA); “ ”表示
W-box (TGACC); “□”表示 OSE2ROOTNODULE (CTCTT); “ ”表示 CACTFTPPCA1 (TACT); “△”标注起始密码子 ATG位置。
“ ” shows CAAT-box (CAAT); “ ” shows ROOTMOTIFTAPOX1 (ATATT); “ ” shows GT1GMSCAM4 (GAAAAA);
“ ” shows W-box (TGACC); “□” shows OSE2ROOTNODULE (CTCTT); “ ” shows CACTFTPPCA1 (TACT); “△” shows the
initiation codon ATG.
2.2 转 pBIW64:GUS烟草植株鉴定与 GUS基因
表达分析
利用 PCR 技术检测转基因烟草植株(T0 代)中
GhWRKY64基因启动子序列及 GUS基因, 在 12个转
基因烟草株系中扩增出目标产物, 而非转基因对照
无扩增产物, 表明 pBIW64: GUS已整合到这 12个转
基因烟草株系基因组中。表达特征分析表明 ,
GhWRKY64基因启动子驱动GUS基因均可在 12个转
基因株系的根和叶组织中表达, 尤其在 pBIW64-5 转
基因系中表达量最高(图 2)。与 pBI121-35S:GUS转基
因阳性对照相比, pBIW64-5转基因株系叶和根中GUS
表达量分别为阳性对照 pBI121-GUS 转基因株系叶中
GUS表达量的 92.9%和 74.5%。表明 GhWRKY64启动
子可启动目标基因在根和叶中优势表达。
2.3 转基因烟草 GUS组织表达分析
以 pBIW64-5转基因株系为研究材料, 将生长 3
周后的幼苗进行 GUS组织化学染色分析表明, 在转
pBIW64:GUS基因 T1代烟草幼苗的叶片和根部均检
图 2 pBIW64-5转基因烟草幼苗的 GUS表达分析
Fig. 2 Quantitative real-time PCR analysis of GUS for
pBIW64-5 transgenic tobacco line
CK: 转 pBI121-35S:GUS转基因阳性对照烟草植株;
pBIW64-5-GUS: 转 pBIW64:GUS烟草阳性植株。误差线表示重
复 3次的标准差值。
CK: pBI121-35S:GUS transgenic tobacco plant for positive control;
pBIW64-5-GUS: pBIW64:GUS transgenic tobacco plant. Error bars
indicate the standard deviation with three replicates.
第 4期 杜 皓等: 受多逆境诱导表达的 GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析 597
测到 GUS活性的蓝色信号, 而在非转基因烟草植株
的各个部位均未检测到 GUS 活性, 各组织未见染色,
呈黄白色(图 3)。
选取 pBIW64-5 开花期植株的根、茎、叶、叶
柄及花器官进行 GUS活性分析表明, 成株期的转基
因植株其根尖、叶及叶柄均有 GUS活性, 染成蓝绿
色 , 特别是烟草根及根尖部分染色极深 , 表现出
GUS 基因在根中表达量很高, 在茎和花中未检测到
GUS 活性(图 4)。综合上述结果, 棉花 GhWRKY64
启动子可启动 GUS基因在根和叶中高表达, 是在根
和叶组织中优势表达的启动子。
2.4 黄萎病诱导处理后转基因烟草的 GUS 活性
检测
将 pBIW64-5 转基因烟草幼苗进行黄萎病菌诱
图 3 转 pBIW64:GUS烟草幼苗的 GUS组织化学染色
Fig. 3 Histochemical staining of GUS activity in pBIW64:GUS
transgenic tobacco plants
WT: 非转基因植株; pBIW64-5: 转 pBIW64:GUS阳性植株。
WT: Non transgenic plant; pBIW64-5: pBIW64:GUS transgenic
plant.
导处理, GUS 组织化学染色表明, 非转基因的野生
型烟草在病菌诱导前后均不能被染色, 而转基因烟
草株系表现出 GUS活性, 在诱导前后表现出明显蓝
色深浅变化。黄萎病菌诱导后能增强 pBIW64:GUS
启动子的转录活性, 根尖和叶片组织均染成深蓝色,
特别是根尖部位染色更深, 近褐色(图 5)。说明棉花
GhWRKY64 启动子含有黄萎病菌胁迫诱导的顺式调
控元件, 黄萎病菌诱导后可驱动目标基因优势表达,
参与胁迫抗性应答反应。
3 讨论
真核基因表达是非常复杂的调控过程, 研究基
因的启动子调控元件及启动子活性对分析转录起始
水平上基因调控具有重要意义。利用基因工程手段
挖掘组织特异性强、表达模式与强度适当的启动子,
使外源基因在作物的特定部位或发育阶段产生目标
蛋白或其他代谢产物, 可避免组成型启动子表达对
作物生长造成的不良影响。组织器官特异性启动子
调控的基因只在作物的某些特定器官或组织部位表
达, 例如通过克隆大豆 β-伴球蛋白 α亚基基因启动子
序列, 并构建 GUS 融合蛋白载体转化烟草, 成功证
明该启动子在大豆种子中特异启动 GUS基因表达[15]。
马铃薯 SGT3启动子的组织特异性实验表明, GUS组
织化学染色主要集中在烟草叶片的叶脉部分, 在茎
中的表皮、韧皮部及木质部, 在根冠, 及分生区以及
维管束组织中低表达, 髓部几乎不表达[16]。柑橘启
动子 GRP具有较强的韧皮部组织特异性, 有望在抗
病基因工程育种中发挥重要作用 [ 1 7 ]。水稻基因
OsESG1上游启动子序列OsESP1是水稻种胚特异性
启动子, 是影响种胚中特异基因表达的关键调控顺
式作用元件[18]。棉花是重要的纤维作物, 也是世界
第六大油料作物。多个研究已对棉花不同组织、器
图 4 转 pBIW64:GUS烟草不同组织器官的 GUS组织化学染色
Fig. 4 Histochemical staining of GUS activity in different tissues and organs in pBIW64:GUS transgenic tobacco plants
R: 根; P: 叶柄; L: 叶片; F: 花; S: 茎。R: root; P: petiole; L: leaf; F: flower; S: stem.
598 作 物 学 报 第 41卷
图 5 黄萎病菌接种前后转 pBIW64:GUS烟草 GUS活性检测
Fig. 5 Histochemical staining of pBIW64:GUS transgenic
tobaccos before/after pathogen inoculation
WT: 非转基因烟草阴性对照; pBIW64-5: 转基因烟草株系;
Untreated: 未接种黄萎病菌的转基因烟草和对照 GUS表型;
Treated: 接种黄萎病菌后转基因烟草和对照 GUS表型。
WT: non transgenic tobacco plant for negative control; pBIW64-5:
transgenic tobacco plant; Untreated: GUS histochemical staining
between transgenic tobacco line and its control before pathogen
inoculation; Treated: GUS histochemical staining between trans-
genic tobacco line and its control after pathogen inoculation.
官优势表达启动子进行系统分析。棉花 GhGDRP85
与泛素结合酶 E2家族基因具有很高同源性, 其在不
同组织器官中均优势表达 , 在根中表达水平最高 ;
含该基因启动子和 5UTR 区的 uceA1.7 表达特征显
示, 其在大部分组织器官中表达水平与组成型表达
的 CaMV35S启动活性相当, 但在花中 uceA1.7:GUS
活性是 CaMV35S:GUS的 7倍, 在根中是 CaMV35S:
GUS 的 2 倍; 表明 uceA1.7 是一个强启动活性的调
控序列, 可用于驱动目标基因在不同组织器官, 尤
其是花和根中优势表达[19]。编码富含脯氨酸蛋白的
GhPRP3 和编码查尔酮合酶的 GhCHS1 均在铃壳中
优势表达, 其启动子驱动目标基因在铃壳中专化表
达, 可有效避免应用 CaMV35S 等组成型表达的启
动子在转基因作物中呈现组织器官表达广谱性, 进
而导致目标基因产物承受强选择压[20]。棉花胁迫相
关基因 GHSP26 编码热激蛋白, 启动子特征分析表
明含启动子上游 716 bp及更长的片段, 在 ABA、重
金属、干旱等胁迫下, 其诱导表达活性是对照的 2
倍以上 , 是一个干旱等逆境诱导型启动子 [21]。
GhCesA4 编码棉花纤维素合酶, 启动子分析表明其
不仅参与次生壁形态形成, 而且受多逆境胁迫诱导,
可启动目标基因在维管束组织或逆境胁迫诱导下优
势表达[22]。本文中, 我们克隆了一个受多逆境胁迫
诱导上调表达的棉花 GhWRKY64 启动子, 该启动子
有效启动目标基因在烟草根和叶组织中优势表达 ,
且受黄萎病菌诱导上调表达, 可为棉花抗黄萎病转
基因研究提供调控元件。
研究发现 , WRKY 蛋白在病原体的防卫反应 ,
植物的生长发育以及非生物胁迫等多种生理生化反
应中均发挥重要作用[23]。WRKY基因易受外界环境
刺激而诱导表达。在水稻中, 热激会使 OsWRKY11
过量表达, 从而诱导 HSP101的启动子启动, 增强水
稻对高温和干旱的耐受性[24]。而 OsWRKY45的过量
表达可提高水稻对盐和干旱的耐受能力, 进而提高
疾病抵抗力[25]。拟南芥 AtWRKY25或 AtWRKY33的
过量表达可以提高耐盐性[26]。上述研究表明 WRKY
转录因子的启动子区含有与不同逆境胁迫相关的诱
导调控元件。研究表明, WRKY 转录因子也能特异
结合(T)TGACC(A/T)序列(W-box)结构域, 调节含有
W-box 元件的启动子基因或功能基因的表达, 进而
调控对生物及非生物逆境胁迫的响应[27]。W-box 主
要位于抗病或抗逆相关基因的启动子区域, 其数量
有一个到多个不等, 它们位置相近, 呈同向或者回
文结构排列, 利于与 WRKY蛋白结合[28]。对大白菜
BrWRKY33 启动子上游的调控元件分析, 进一步构
建不同长度缺失突变体载体转化拟南芥植株, 结果
表明, BrWRKY33 基因启动子上游存在多个 W-box
元件, 参与该基因负调控表达, 对软腐病抗性起重
要作用[29]。本文克隆的棉花 GhWRKY64启动子区域
含有 2个W-box调控元件, 其位置相近, 提高了其他
WRKY蛋白与其结合能力。同时, 生物信息学预测表
明该启动子区共有 4个与病原菌诱导相关元件 OSE2
ROOTNODULE(CTCTT), 暗示该启动子受病原菌诱
导后表达量增强。我们的研究表明在黄萎病菌诱导下,
pBIW64:GUS 转基因烟草中 GUS 表达明显增强。表
明该启动子可启动植物病菌胁迫应答相关基因高表
达, 有望用于棉花黄萎病抗病分子育种研究。
在已报道的植物启动子中 , 大多数均富含 AT
序列。高含量的 AT意味着 DNA双链结构更易解螺
旋 , 从而提高基因的转录效率 [30]。本研究克隆的
GhWRKY64基因启动子序列中, GC含量占 27%, AT
第 4期 杜 皓等: 受多逆境诱导表达的 GhWRKY64基因启动子克隆与功能分析 599
含量占 73%, 获得的 pBIW64:GUS 转基因后代其
GUS 均表现较强活性, 特别在 pBIW64-5 转基因系
中转录活性最高。根据 GhWRKY64基因启动子中调
控元件的分布, 我们进一步设计了含不同调控元件
的缺失启动子。其中, –1 ~ –273 bp区间预测发现含
有转录起始位点的核心启动子区, 同时该区域存在
一个对基因转录有激活作用的核心启动元件
CAAT-box, 2 个叶肉组织特异表达启动元件 CACT
FTPPCA1, 和 2 个病原菌相关元件 OSE2 ROOTN
ODULE。–1 ~ –477 bp区间新增 1个病原菌相关元
件 OSE2ROOTNODULE; 1个 GT1GMSC AM4盐胁
迫诱导相关元件, 和 2个 W-box元件。–1 ~ –740 bp
区间除含有上述元件外, 又新增 2个 ROOTMOTIFT
APOX1 植物根特异表达启动元件。分析–740 ~
–1064 bp区域之间的 325 bp区段相关调控元件表明,
该区段其 GC含量为 11.5%, AT含量高达 88.5%, 有
3 个 5′-TATTAAT-3′元件, 2 个 5′-TTATTT-3′元件, 1
个 5′-TTTATATA-3′元件, 4个 ROOTMOTIFTAPOX1
元件和 3个 CAAT-box增强转录元件。因此, 通过启
动子不同缺失突变体启动活性分析, 有望进一步深
入阐明 GhWRKY64基因启动子中各调控元件的作用
机制。
4 结论
克隆了棉花 GhWRKY64基因上游长 1064 bp的
启动子序列。该启动子区含 18个组织器官专化表达
及诱导表达关键元件 , 分别为 6 个 ROOTMOTIF
TAPOX1 根特异调控元件、2 个 W-box 框、4 个
CACTFTPPCA1叶肉特异调控元件、4个 OSE2ROO
TNODULE 病原菌诱导元件和 2 个 GTIGMSCAM4
盐调控元件。通过构建棉花 GhWRKY64 启动子与
GUS 基因植物表达载体获得转基因烟草, GhWRKY64
启动子在叶和根组织中启动 GUS优势表达。受黄萎
病菌诱导后 , GUS 基因表达水平显著提高。
GhWRKY64 启动子可启动目标基因在叶和根组织或
逆境胁迫诱导下优势表达。
References
[1] Eulgem T, Rushton P, Robatzek S, Somssich I E. The WRKY
superfamily of plant transcription factor. Trends Plant Sci, 2000,
5: 199–206
[2] 宋扬, 周军会, 张永强．植物组织特异性启动子研究. 生物技
术通报, 2007, (6): 21–24
Song Y, Zhou J H, Zhang Y Q. Research on plant tissue-specific
promoter. Biotechnol Bull, 2007, (6): 21–24 (in Chinese with
English abstract)
[3] 李志邈 , 杨悦俭 , 杨飞 , 叶青静 . 番茄根特异表达基因
LeGRP2启动子的克隆及其在拟南芥的表达分析. 中国农业科
学, 2010, 43: 1877–1882
Li Z M, Yang Y J, Yang F, Ye Q J. Cloning of LeGRP2 promoter
from tomato that shows root-specific expression in Arabidopsis.
Sci Agric Sin, 2010, 43: 1877–1882 (in Chinese with English
abstract)
[4] 杨学文, 任远, 田曾元, 张生学, 刘允军, 王国英. 玉米茎特
异启动子克隆及其在转基因烟草中的活性分析. 西北植物学
报, 2014, 34: 859–865
Yang X W, Ren Y, Tian Z Y, Zhang S X, Liu Y J, Wang G Y. Iso-
lation of a shoot-specific promoter in maize and its activity in
transgenic tobacco. Acta Bot Bor-Occid Sin, 2014, 34: 859–865
(in Chinese with English abstract)
[5] 颜彦, 林拥军. 一个水稻鞘叶特异表达启动子的克隆及功能
鉴定. 农业生物技术学报, 2013, 21: 757–763
Yan Y, Lin Y J. Cloning and functional analysis of a promoter
with tissue specific expression in rice (Oryza sativa L. ssp. japo-
nica) sheath and leaf. J Agric Biotech, 2013, 21: 757–763 (in
Chinese with English abstract)
[6] Ulker B, Somssich I. WRKY transcription factors: from DNA
binding towards biological function. Curr Opin Plant Biol, 2004,
7: 491–498
[7] 郝中娜, 王海华, 吴学龙, 郭泽建. 水稻 WRKY19 基因启动子
功能研究初报. 中国农学通报, 2007, 23(6): 99–103
Hao Z N, Wang H H, Wu X L, Guo Z J. Primary study of func-
tion of a rice WRKY19 gene promoter. Chin Agric Sci Bull, 2007,
23(6): 99–103 (in Chinese with English abstract)
[8] Paterson A H, Wendel J F, Gundlach H, Guo H, Jenkins J, Jin D,
Llewellyn D, Showmaker K C, Shu S, Udall J, Yoo M, Byers R,
Chen W, Doron-Faigenboim A, Duke M V, Gong L, Grimwood J,
Grover C, Grupp K, Hu G, Lee T, Li J, Lin L, Liu T, Marler B S,
Page J T, Roberts A W, Romanel E, Sanders W S, Szadkowski E,
Tan X, Tang H, Xu C, Wang J, Wang Z, Zhang D, Zhang L, Ash-
fari H, Bedon F, Bowers J E, Brubaker C L, Chee P W, Das S,
Gingle A R, Haigler C H, Harker D, Hoffmann L V, Hovav R,
Jones D C, Lemke C, Mansoor S, Rahman M, Rainville L N,
Rambani A, Reddy U K, Rong J, Saranga Y, Scheffler B E,
Scheffler J A, Stelly D M, Triplett B A, Deynze A V, Vaslin M F S,
Waghmare V N, Walford S, Wright R J, Zaki E A, Zhang T,
Dennis E S, Mayer K F X, Peterson D G, Rokhsar D S, Wang X,
Schmutz J. Repeated polyploidization of Gossypium genomes
and the evolution of spinnable cotton fibres. Nature, 2012, 492:
423–427
[9] Wang K B, Wang Z W, Li F G, Ye W W, Wang J Y, Song G L, Yue
Z, Cong L, Shang H H, Zhu S L, Zou C S, LI Q, Yuan Y L, Lu C
R, Wei H L, Gou C Y, Zheng Z Q, Yin Y, Zhang X Y, Liu K,
Wang B, Song C, Shi N, Kohel R J, Percy R G, Yu J Z, Zhu Y X,
Wang J, Yu S X. The draft genome of a diploid cotton Gossypium
raimondii. Nat Genet, 2012, 44: 1098–1103
[10] Cai C P, Niu E L, Du H, Zhao L, Feng Y, Guo W Z. Ge-
nome-wide analysis of the WRKY transcriptionfactor gene family
in Gossypium raimondii and theexpression of orthologs in culti-
vated tetraploid cotton. Crop J, 2014, 2: 87–101
[11] Paterson A H, Brubaker C, Wendel J F. A rapid method for ex-
600 作 物 学 报 第 41卷
traction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for
RFLP or PCR analysis. Plant Mol Biol Rep, 1993, 11: 122–127
[12] 马雪梅, 胥晓, 李晓波, 肖向文. 农杆菌介导快速、高效获得
转基因烟草纯合株系. 中国烟草学报, 2012, 18(4): 66–71
Ma X M, Xu X, Li X B, Xiao X W. Rapid and efficient produc-
tion of homozygous transgenic tobacco plants Agrobacterium
tumefaciens. Acta Tob Sci, 2012, 18(4): 66–71 (in Chinese with
English abstract)
[13] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method.
Methods, 2001, 25: 402–408
[14] Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene
fusion system. Plant Mol Biol Rep, 1987, 5: 387–405
[15] 王雪, 谭艳平, 周杰, 王春台, 刘学群. 一个烟草糖基转移酶
启动子在转基因烟草植株中的表达分析. 安徽农业科学, 2010,
38: 9426–9428
Wang X, Tang Y P, Zhou J, Wang C T, Liu X Q. Expression of a
tobacco Glycosyl transferase gene’s promoter in transgenic to-
bacco. J Anhui Agric Sci, 2010, 38: 9426–9428 (in Chinese with
English abstract)
[16] 付永平, 周海涛, 王丕武. 大豆种子特异性启动子的克隆及功
能分析. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2009, 37(12):
105–111
Fu Y P, Zhou H T, Wang P W. Cloning and identification of the
seed specific promoter from soybean. J Northwest Sci Tech Univ
Agric For (Nat Sci Edn), 2009, 37(12): 105–111 (in Chinese with
English abstract)
[17] 崔同霞, 白江平, 魏桂民, 赵旭, 王蒂, 张金文. 马铃薯 SGT3
基因表达及其启动子功能分析 . 草业学报 , 2014, 23(2):
196–206
Cui T X, Bai J P, Wei G M, Zhao X, Wang D, Zhang J W. Gene
expression and function analysis of SGT3 promoter from potato.
Acta Pratacult Sin, 2014, 23(2): 196–206 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[18] 许兰珍, 彭爱红, 何永睿, 姚利晓, 雷天刚, 刘小丰, 姜国金,
邹修平, 陈善春. 异源韧皮部特异启动子在转基因枳中的表
达. 园艺学报, 2014, 41: 1–8
Xu L Z, Peng A H, He Y R, Yao L X, Lei T G, Liu X F, Jiang G J,
Zou X P, Chen S C. Expression analysis of three phloem-specific
promoters in transgenic Poncirus trifoliate. Acta Hort Sin, 2014,
41: 1–8 (in Chinese with English abstract)
[19] 房孝良 , 刘炜 , 安静 , 王庆国 . 水稻种胚特异性启动子
OsESP1的克隆及其表达特性. 作物学报, 2011, 37: 1904−1909
Fang X L, Liu W, An J, Wang Q G. Isolation and characterization
of an embryo-specific promoter OsESP1 from rice. Acta Agron
Sin, 2011, 37: 1904−1909 (in Chinese with English abstract)
[20] Antonio A, Rodrigo R, Luciane M, Naiara P, Osmundo B, Sinara
A, SarahM N, Marcio A, João A, Maria C, Maria F. Isolation and
functional characterization of a cotton ubiquitination-related
promoter and 5UTR that drives high levels of expression in root
and flower tissues. BMC Biotechnol, 2011, 11: 115
[21] Lightfoot D J, Orford S J, Timmis J N. Identification and charac-
terisation of cotton boll wall-specific gene promoters for future
transgenic cotton varieties. Plant Mol Biol Rep, 2013, 31: 174–184
[22] Zahur M, Maqbool A, Irfan M, Younas M, Barozai K, Qaiser U,
Rashid B, Husnain T, Riazuddin S. Functional analysis of cotton
small heat shock protein promoter region in response to abiotic
stresses in tobacco using Agrobacterium-mediated transient assay.
Mol Biol Rep, 2009, 36: 1915–1921
[23] Wu A M, Hu J S, Liu J Y. Functional analysis of a cotton cellu-
lose synthase A4 gene promoter in transgenic tobacco plants.
Plant Cell Rep, 2009, 28: 1539–1548
[24] Ryu H S, Han M, Lee S K, Cho J I, Ryoo N, Heu S, Lee Y H,
Bhoo S H, Wang G L, Hahn T R, Jeon J S. A comprehensive ex-
pression analysis of the WRKY gene super family in rice plants
during defense response. Plant Cell Rep, 2006, 25: 836–847
[25] Wu X L, Shiroto Y, Kishitani S, Ito Y, Toriyama K. Enhanced
heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings over-
expressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter.
Plant Cell, 2009, 28: 21–30
[26] Qiu Y P, Yu D Q. Over-expression of the stress induced Os-
WRKY45 enhances disease resistance and drought tolerance in
Arabidopsis. Environ Exp Bot, 2009, 65: 35–47
[27] 付乾堂, 余迪求. 拟南芥 AtWRKY25、AtWRKY26和 AtWRKY33
在非生物胁迫条件下的表达分析. 遗传, 2010, 32: 848–856
Fu Q T, Yu D Q. Expression profiles of AtWRKY25, AtWRKY26
and AtWRKY33 under abiotic stresses. Hereditas (Beijing), 2010,
32: 848–856 (in Chinese with English abstract)
[28] 王磊, 高晓清, 朱苓华, 周永力, 黎志康. 植物 WRKY 转录因
子家族基因抗病相关功能的研究进展. 植物遗传资源学报,
2011, 12: 80–85
Wang L, Gao X Q, Zhu L H, Zhou Y L, Li Z K. Advances in re-
search on function of WRKY transcription factor genes in plant
resistance. J Plant Genet Res, 2011, 12: 80–85 (in Chinese with
English abstract)
[29] Wu K L, Guo Z J, Wang H H, Li J. The WRKY family of tran-
scription factors in rice and Arabidopsis and their origins. DNA
Res, 2005, 12: 9–26
[30] 范荣伟, 谢华, 姚磊, 马荣才. 大白菜 BrWRKY33 基因上游调
控序列的克隆及功能分析 . 农业生物技术学报 , 2010, 18:
670–675
Fan R W, Xie H, Yao L, Ma R C. Cloning and expression analysis
of the up-stream regulatory sequence of transcription factor gene
BrWRKY33 from Chinese cabbage. J Agric Biotech, 2010, 18:
670–675 (in Chinese with English abstract)
[31] 张春晓, 王文棋, 蒋湘宁, 陈雪梅. 植物基因启动子研究进
展. 遗传学报, 2004, 31: 1455–1464
Zhang C X, Wang W Q, Jiang X N, Chen X M. Review on
plant gene promoter. Acta Genet Sin, 2004, 31: 1455–1464 (in
Chinese with English abstract)