全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(7): 1231−1239 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30960200), 国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD35B04), 国家重点基础研究发展计划(973计划)
前期研究项目(2011CB111500)和青海省应用基础研究项目(2011-Z-701)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 杜德志, E-mail: qhurape@126.com, Tel: 0971-5366520
第一作者联系方式: E-mail: 13897474887@126.com (赵志刚); fg1987120@163.com (富贵)
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-11-07; Accepted(接受日期): 2013-03-12; Published online(网络出版日期): 2013-04-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130423.1838.021.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01231
人工合成甘蓝型油菜早期世代基因组变异的 AFLP和MSAP标记
赵志刚** 富 贵** 邓昌蓉 杜德志*
青海大学农林科学院 / 青海省高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培育基地 / 青海省春油菜遗传改良重点实验室, 青海
西宁 810016
摘 要: 为了揭示人工甘蓝型油菜早期世代遗传和表观遗传变异规律, 以 A组合(大黄油菜×中花芥蓝) S0世代、B组
合(大黄油菜×中迟芥蓝) S0和 S1世代人工甘蓝型油菜为材料, 分别利用 AFLP 和 MSAP 技术检测基因组变化及甲基
化模式变化情况。 结果表明, 16对引物在 A组合 S0扩增到 523条带, 其中 4对引物扩增出 9条变异带, 包括 7条亲
本缺失带和 2 条新增带, 分别占 S0总条带的 1.33%和 0.38%; 45对引物在 B 组合双亲植株扩增到 1093条带, 只有 1
对引物检测到 1 条父本带型在所有 S0植株中缺失, 约占 S0总条带的 0.09%; 在 B9 子代 F19-1~F19-16 总共扩增得到
1092条带, 变异带有 10条, 占总条带的 0.915%, 其中包括 9条缺失带和 1条新增带, 9条缺失带全部位于 C基因组。
MSAP检测发现, B组合 S0植株中有 3个位点发生了甲基化模式的改变, 全部位于 A基因组, 甲基化模式改变位点占
总检测位点的 1.37%。研究还发现 B组合 S0世代一个植株出现可遗传的花色变异, 推测该表型变异与 B组合人工甘
蓝型油菜中 C基因组变异有关。
关键词: 人工合成甘蓝型油菜; 基因组序列变异; AFLP; MSAP
AFLP and MSAP Analysis on Genetic Variation in Early Generations of Artifi-
cially Synthesized Brassica napus
ZHAO Zhi-Gang**, FU Gui**, DENG Chang-Rong, and DU De-Zhi*
Academy of Agriculture and Forestry, Qinghai University / National Key Laboratory Breeding Base for Innovation and Utilization of Plateau Crop
Germplasm / Key Laboratory of Spring Rape Genetic Improvement of Qinghai Province, Xining 810016, China
Abstract: In order to reveal pattern of genetic and epigenetic changes following allopolyploidization of A and C genomes in
Brassica, AFLP (amplified fragment length polymorphism) was utilized to detect level of genome changes for S0 plants of cross A
(Qinghai Dahuang×Zhonghua Jielan) and S0, S1 plants of cross B (Qinghai Dahuang×Zhongchi Jielan). Moreover, MSAP (me-
thylation sensitive amplification polymorphism) was utilized to detect level of methylation changes for S0 plants of cross B. Five
hundred and twenty three bands were amplified in S0 plants of cross A with 16 pairs of primer, nine out of these bands amplified
showed significant differences between S0 and parents plants, mainly including deletion of seven parental restriction fragments
and gain of two new fragments, accounting for 1.33% and 0.38% of total fragments, respectively. One thousand and ninety three
bands were amplified in parental plants of B cross with 45 pairs of primer, only one from C genome out of these fragments lost in
all S0 plants, accounting for 0.09% of total bands. In 16 S1 plants from the B9 plant, 10 out of 1092 bands amplified showed varia-
tions, consisting of the deletion of nine fragments from C genome and the gain of one new fragment. By MSAP approach, three
loci with cytosine methylation changes were founded on A genome of S0 plants of B cross, which accounted for 1.37% of loci
detected. In addition, a plant with flower color mutation in S0 generation of B cross was observed; we speculated that the flower
color mutation was probably caused by genetic changes on C genome. This study provided theoretical informations for innovation
of rapeseed germplasm by resynthesizing Brassica napus.
Keywords: Artificially synthesized Brassica napus; Genomic sequence variation; AFLP; MSAP
1232 作 物 学 报 第 39卷
多倍化现象在真核生物中尤其在被子植物中广
泛存在, 是植物起源的主要方式之一。多倍体分为
同源多倍体和异源多倍体。同源多倍体一般来自二
倍体的加倍, 而异源多倍体是由 2 个或 2 个以上不
同种、属二倍体间杂交再加倍后形成。尽管异源多
倍化现象在真核生物的进化过程中非常普遍, 但迄
今为止人们对于植物异源多倍化的分子机制仍然了
解不多[1]。很多研究表明, 异源多倍化过程会导致基
因组和基因表达的变异, 其中基因组水平的变异主
要包括染色体的重排、倒位、转座和片段消除; 基
因表达的变异包括基因沉默、基因激活、甲基化改
变、转座子激活、核仁显性等[2-5]。Shake 等[6]利用
AFLP 技术分析了山羊草和野生二粒小麦人工合成
的异源四倍体在进化过程中全基因组水平的序列丢
失情况, 表明序列消除是人工合成异源多倍体进化
过程中基因组变化的主要方式之一。Wang等[7]利用
不同亲本人工合成了 4个拟南芥株系, 在其 2个株系
中分别检测到 4%和 11%亲本基因在子代中沉默。
Kashkush等[8]发现大约有 0.4%的转录本是人工合成
小麦异源四倍体中新出现的, 其中大部分在人工合
成的异源多倍体中类似于反转座子。
自然界中多倍体祖先大多数是未知的或已消亡
的, 所以研究其进化过程比较困难, 而人工合成异
源多倍体, 因其亲本是已知的, 便于人们对合成种
和亲本材料进行基因组和基因表达的比较分析, 所
以是研究异源多倍化早期分子机制的理想材料。甘
蓝型油菜(Brassica napus, 2n=AACC=38)是由天然芸
薹属基本种甘蓝(Brassica oleracea, 2n=18, CC)和白
菜型油菜(Brassica rapa, 2n=20, AA)或白菜(Brassica
campestris, 2n=20, AA)经天然杂交和染色体自然加
倍进化而来, 为双二倍体(AACC)。人工合成甘蓝型
油菜是拓宽油菜资源的一个重要途径, 同时也是研
究芸薹属异源多倍体进化的有效手段[9]。
AFLP (amplified fragment length polymorphism)
是基于 PCR 技术扩增基因组 DNA 限制性片段的分
子标记技术, 可以在全基因组水平上检测 DNA 变
异[10]。MSAP (methylation-sensitive amplified poly-
morphism)技术是在 AFLP 技术的基础上建立起来的,
最初由 Reyna-lópez等报道, 并被用于检测双相型真
菌的DNA甲基化, 之后被广泛用于检测多种作物基
因组胞嘧啶甲基化的程度和模式[11-15]。MSAP 技术
采用 Hpa II和 Msp I两个同裂酶分别和 EcoR I组合
对DNA进行双酶切, Hpa II和Msp I酶都识别CCGG
位点, 但对甲基化敏感程度不同, 即在没有甲基化
的情况下, 这 2 个酶都能够切割 CCGG 位点, 随着
位点甲基化模式的不同, 2个酶表现出不同的识别反
应。Hpa II能切割 CCGG位点单链甲基化但不能切
割双链甲基化, 而 Msp I 可以识别内侧胞嘧啶被甲
基化, 但不识别外侧胞嘧啶被甲基化, 即不能酶切
含 mCCGG 的位点[16]。由于所采用的限制性内切酶
对DNA甲基化敏感性不同, 相同序列就可扩增出不
同的带型, 由此判断 DNA 甲基化状态, 而 DNA 甲
基化状态反映基因组重要的表观遗传修饰机制。
青海省农林科学院油菜所利用青海大黄油菜
(2n=20, AA)与几种不同的甘蓝(CC, 2n=18)正反杂交,
辅以幼胚抢救、子房培养及染色体加倍等技术, 人
工合成了一批甘蓝型油菜[17]。本研究分析人工合成
的甘蓝型油菜 S0代和 S1代形态学水平的变异, 并利
用 AFLP 和 MSAP 分子标记技术, 检测其基因组水
平的变异和甲基化变异, 通过与其亲本比较, 分析
变异的来源和可能原因。揭示人工合成甘蓝型油菜
早期世代遗传变异规律, 并为通过人工合成方式创
建甘蓝型油菜种质资源提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 试验材料
人工合成甘蓝型油菜的母本为青海白菜型油菜
地方品种大黄油菜(Brassica rapa, 2n=20, AA), 开黄
花, 植株编号分别为 58-6、60-8; 父本为中国农业科
学院油料作物研究所提供的中花芥蓝和中迟芥蓝
(Brassica oleracea, 2n=18, CC), 开白花, 编号分别
为 72-4、76-1。双亲均为自交高代材料, 用于分子标
记检测后代变异的亲本材料为各杂交组合双亲多个
自交子代。在 AFLP分析中 58-6有 7个自交子代、
60-8有 19个自交子代、72-4有 22个自交子代、76-1
有 19个自交子代; 在MSAP分析中, 58-6有 12个自
交子代, 76-1有 22个自交子代。A组合(60-8×72-4)
共获得 14 个 S0单株, 编号依次为 A1~A14。B组合
(58-6×76-1)共获得 10 个 S0单株, 编号依次为 B1~
B10。人工合成甘蓝型油菜大部分开白花, 而 B9 为
花色嵌合体, 其自交获得 16个 S1单株, 编号依次为
F19-1~F19-16, 其中 F19-1淡黄花, F19-2黄花, 其余
均为白花。
1.2 基因组变异检测
利用 AFLP 和 MSAP 两种分子标记检测人工合
成甘蓝型油菜早期世代基因组变异情况。按照
Saghai-Maroof 等[18]的 CTAB 法提取样品 DNA。参
照 Vos等[19]报道的方法进行 AFLP分析, 首先利用 5
第 7期 赵志刚等: 人工合成甘蓝型油菜早期世代基因组变异的 AFLP和 MSAP标记 1233
U EcoR I和 2 U Mse I限制性内切酶(反应体积为 25
µL)在 37℃水浴酶切 DNA, 酶切片段两端连接人工
接头(E-F:5-CTCGTAGACTGCGTACC-3、E-R: 5-A
ATTGGTACGCAGTC-3和 M-F: 5-GACGATGAGT
CCTGAG-3、M-R: 5-TACTCAGGACTCATC-3, 上
海生工)。用预扩增引物扩增连接产物, 将预扩产物
稀释后利用选择性扩增引物进行扩增。选扩产物变
性, 聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染显影, 照相保存并
统计标记。MSAP参照 Xiong等[20]的方法, EA接头
为 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3(E-F) 和 5-AAT
TGGTACGCAGTC-3 (E-R), H/M接头为 5-GATCA
TGAGTCCTGCT-3 (H/M-F)和 5-CGAGCAGGACT
CATGA-3 (H/M-R); EcoR I预扩引物为 5-GACTGC
GTACCAATTC-3, H/M I预扩引物为 5-ATCATGAG
TCCTGCTCGG-3; 所采用的 16 对选择性扩增引物
部分选自 Xu 等[21]对人工合成的甘蓝型油菜的研究,
而 E+CA、E+AG 和 E+AA 3 个引物为自行设计(表
1)。分别用 EcoR I/Hpa II、EcoR I/Msp I组合对基因
组 DNA 进行酶切, 连上接头, 应用 AFLP 扩增程序
进行预扩和选扩, 选扩产物加上上样缓冲液变性后,
在 6%的聚丙烯酰胺凝胶上检测。
1.3 条带统计和分析
量化处理电泳条带, 有带记为 1, 无带记为 0。
MSAP分析中同裂酶 Hpa II和 Msp I分别与 EcoR I
组合进行双酶切。因此每个样品同时拥有两条泳带,
其中第 1条泳带采用 EcoR I/Hpa II酶切, 记为H, 第
2条泳带采用 EcoR I/Msp I酶切, 记为 M。根据泳带
内条带的有无, 可将条带类型分为 3种: I型, H、M
都有带, 无甲基化; II型, H有带, M无带, 单链外甲
基化; III型, H无带, M有带, 为双链内甲基化。
2 结果与分析
2.1 形态学变异
人工甘蓝型油菜花色与父本芥兰相同, 都为白
花, 但 B组合 58-6×76-1的 S0世代的 B9植株在末花
期出现了黄白花色嵌合现象(图 1-A, B)。B9自交获
得 16个 S1植株, 其中 F19-1为淡黄花, F19-2为黄花,
其余 14个单株均为白花(图 1-C), 进一步自交后, 黄
花单株能够稳定遗传; 白花植株相对不稳定, 334个
S2代白花群体中, 有 1株又出现类似于 B9单株的花
色嵌合现象; 淡黄花单株 F19-1自交获得 63个子代,
其中有 11株黄花, 40株淡黄花, 12株白花, 适合性
χ2测验结果表明, 黄、淡黄、白 3 种花色植株分离
比符合 1∶2∶1; F19-1 和黄花单株 F19-2 杂交获得
85个后代, 其中 39株黄花, 46株淡黄花, 适合性χ2
测验结果表明, 黄、淡黄 2 种花色植株分离比符合
1∶1, 说明白花对黄花可能由一对不完全显性基因
控制。
表 1 MSAP选扩引物序列
Table 1 Selective primer used for MSAP analysis
EcoR I选扩引物 EcoR I selective primer H/M选扩引物 H/M selective primer
引物
Primer
EcoR I预扩引物+3个选择性碱基
EcoR I pre-selective primer + three selective bases
引物
Primer
Hpa II/Msp I预扩引物+3个选择性碱基
Hpa II/Msp I pre-selective primer + three selective bases
EA 1 EA0+AAA H/M 1 H/M0+TAA
EA 2 EA0+AAT H/M 2 H/M0+ TCC
EA 3 EA0+AAC H/M 3 H/M0+TGG
EA 4 EA0+AAG H/M 4 H/M0+TAC
EA 5 EA0+ATA H/M 5 H/M0+TAG
EA 6 EA0+ATT H/M 6 H/M0+TCA
EA 7 EA0+ATC H/M 7 H/M0+TCG
EA 8 EA0+ATG H/M 8 H/M0+TGA
EA 9 EA0+ ACA H/M 9 H/M0+TGC
EA 10 EA0+ACT H/M 10 H/M0+TAT
EA 11 EA0+ACC H/M 11 H/M0+TCT
EA 12 EA0+ACG H/M 12 H/M0+TGT
EA 13 EA0+AGA H/M 13 H/M0+TTA
EA 14 EA0+AGT H/M 14 H/M0+TTC
EA 15 EA0+AGC H/M 15 H/M0+TTG
EA 16 EA0+AGG H/M 16 H/M0+TTT
1234 作 物 学 报 第 39卷
图 1 B组合出现的花色嵌合现象
Fig. 1 Mosaics flower color in B cross
A、B为 B9植株出现的花色嵌合现象, C为 B9单株自交产生的
白、淡黄和黄三种花色植株的花朵。
A, B: mosaics flower color on the plant “B9”; C: flowers of plants
with white, light yellow and yellow flowers, which derived from B9
selfing cross, respectively.
2.2 A组合基因组 AFLP检测
随机选取 16 对 AFLP 引物, 对 A 组合(60-8×
72-4)的亲本及子代 S0进行检测。在双亲共扩增得到
524 条带, 其中双亲共有带为 54 条, 母本大黄油菜
特有带 223条, 父本芥蓝特有带 247条, 在人工合成
甘蓝型油菜 S0世代 A1~A14 群体中获得 523 条带,
大多数位点都和双亲中对应, 个别材料在不同位点
出现了新增带和缺失带(图 2和图 3)。EA14MC09、
EA16MC11、EA13MC4、EA13MC8 和 EA9MC3 引
物在父本中花芥蓝自交子代群体扩增出 7条分离带,
占总扩增条带的 2.3%, 而该 7 条分离带型在 14 个
S0单株间也表现分离。通过卡平方测验发现, 7条杂
带中有带和无带在父本芥蓝中的比例为 3/1, 在 S0
中比例为 1/1, 符合孟德尔遗传规律(表2), 说明在芥
蓝亲本中这些位点处于杂合状态, 因此在分析 S0变
异时, 这样的位点不计入变异类型。所有引物在母
本大黄油菜自交子代没有扩增出分离条带, 说明该
研究中大黄油菜基因组较为纯合。有 4 对引物在 S0
中检测到变异, 变异类型有缺失和新增 2 种, 条带
缺失分为 2 种情况, 一种是普遍性缺失, 即某一亲
本条带在所有 S0材料中都缺失, 另一种是特异性缺
失 , 即亲本带只在个别 S0 材料中缺失。引物对
EA16MC11和 EA14MC09在所有 S0植株中检测到 3
条母本带缺失, 在植株 A14 各检测到 1 条双亲共有
带缺失。引物对 EA16MC11 在 A10 检测到 1 条约
600 bp 的父本缺失带, 在 A8 和 A12 检测到 1 条约
200 bp 的父本缺失带。该组合中, 出现新增带的频
率较低, 只有 A4单株在 EA13MC4和 EA13MC8引
物对的扩增中各出现一条新增带。综上所述, S0中缺
失带共 7 条, 占 S0总条带的 1.33%, 新增带仅 2 条,
占总带数的 0.38%, S0 变异条带占总条带的 1.71%
(表 3)。
2.3 B组合基因组 AFLP检测
随机选取 45 对 AFLP 引物, 检测 B 组合 S0
(B1~B10)和 S1 (F19-1~F19-16) 2个世代的遗传变化。
双亲共扩增得到 1093 条带, 其中双亲共有带为 98
条, 母本大黄油菜特有带为 463 条, 父本芥蓝特有
带为 532 条。父本芥蓝 76-1 自交后代中 11 条带出
现分离, 占芥蓝总条带的 1.75%, 这 11 条带在 S0群
体 B1~B10 间也表现分离, 卡方测验结果表明, 这
11 条带对应着父本 76-1 中的 11 个杂合位点, 因此
这些分离条带在研究中不计入变异带型。而母本大
黄油菜自交子代没有检测出分离带型, 说明本研究
中的母本基因组相对父本更为纯合。
表 2 父本(72-4)自交后代及 S0 带型分离的 χ2检测结果
Table 2 Analysis of χ2 of band patterns separation among progenies of male parent (72-4) selfing cross and S0 plants
72-4的自交后代 Progeny of 72-4 selfing cross 60-8×72-4合成的 S0代 S0 from the cross of 60-8×72-4
引物名称
Primer
条带大小
Size of
band (bp)
有带株数
Number of plants
with band
无带株数
Number of plants
without band
χ2
α=0.05
有带株数
Number of plants
with band
无带株数
Number of plants
without band
χ2
α=0.05
EA14MC09 220 15 7 0.2424 8 8 0.0625
EA16MC11 500 16 6 0 6 10 0.5625
EA13MC4 160 17 5 0 9 7 0.0625
EA13MC8 120 15 7 0.2424 6 10 0.5625
EA13MC8 335 16 6 0 10 6 0.5625
EA13MC8 120 14 8 0.9697 9 7 0.0625
EA9MC3 190 16 6 0 7 9 0.0625
第 7期 赵志刚等: 人工合成甘蓝型油菜早期世代基因组变异的 AFLP和 MSAP标记 1235
图 2 引物 EA13MC4扩增结果
Fig. 2 Amplification result of AFLP primer pair EA13MC4
1~19: 母本大黄油菜; 20~41: 父本中花芥兰; 42~55: 子代 S0; 箭头所指为 S0中出现的新增带。
1–19: female parent Dahuang rape; 20–41: male parent Zhonghua jielan; 42–55: S0; Arrows indicate novel band in S0.
图 3 引物 EA16MC11的扩增结果
Fig. 3 Amplification result of AFLP primer pair EA16MC11
箭头所指母本 60-8在约 280 bp处的条带在子代 S0中缺失。
Arrows indicate female parent absent band at 280 bp loci in S0.
表 3 A组合不同变异类型分析
Table 3 Analysis of different variation in A combination
变异类型
Type of variation
变异材料
Materials with variation
变异条带数
Number of varied band
各类变异条带占 S0总条带比例
Ratio of varied band (%)
母本缺失 Deletion of bands from female parent A1–A14 3 0.57
A10 1 0.19 父本缺失 Deletion of bands from male parent
A8, A12 1 0.19
双亲共有带缺失 Deletion of shared bands A14 2 0.38
新增带 New bands A4 2 0.38
合计 Total 9 1.71
S0 群体中检测到的基因组变异很少, 只有引物
EA16MC14 扩增出的 1条约 400 bp的父本带在所有
S0植株中缺失, 约占 S0总条带的 0.09%, 其他带型
完全与双亲带型一致。B9自交 S1株系总共扩增得到
1092条带, 发生变化的条带总共有 10条, 占总条带
的 0.915%。S1群体与其上一代 B9 单株扩增带型比
较, 除 F19-8 外, 其余材料均出现了不同程度的变
异。一对引物在 3 个单株 F19-3、F19-13 和 F19-14
扩增出同 1条新增带, 占 S1总条带的 0.09% (图 4)。
其余变异单株都为条带缺失变异, 在 7 对引物中共
发现 9 条缺失带, 不同单株间缺失带的数量和片段
大小不尽一致, 其中 F19-4、F19-5、F19-6、F19-7、
F19-9、F19-10、F19-11、F19-12、F19-15和 F19-16
这几个单株在所有引物扩增中变异一致, 共有 6 条
缺失带, 占 S1总条带的 0.55%, F19-1有 8条缺失带,
占 S1总条带的 0.73%, F19-2有 2条缺失带, 占 S1总
条带的 0.183%。如表 4所示, B9的 S1植株的所有条
带缺失变异都发生于 C基因组。
2.4 B组合 MSAP分析
随机选取 18对 MSAP引物对 B组合双亲自交
子代及 S0植株进行甲基化检测, 母本大黄油菜(58-6)
自交子代有 12 个单株, 父本芥蓝(76-1)自交子代有
22个单株。母本大黄油菜子代中总共扩增出 155条
HM带型(1 1, 0 1, 1 0), 其中有 1条带表现为(0 1)和
(0 0)的分离, 分离比符合 3∶1, 说明母本 58-1在该
位点处于杂合状态, 本研究中不作为有效条带数统
计。在父本芥蓝子代中总共扩增出 177 条 HM 带型
(1 1, 0 1, 1 0), 其中 5条带型表现分离, 在本研究中
不计入有效条带。母本大黄油菜检测到甲基化位点
为 42个, 甲基化比例为 27.27%, 全甲基化和半甲基
化位点分别占总扩增位点的 26.62%和 0.65%, 父本
芥蓝中甲基化位点为 40 个, 甲基化比例为 23.12%,
全甲基化和半甲基化比例分别为 18.50%和 4.62%。
双亲共有 68条同样的非甲基化条带, 12条同样的全
1236 作 物 学 报 第 39卷
甲基化条带, 没有检测到相同的半甲基化条带。子
代 S0 10个单株共扩增得到 219条有效带型(已去除
杂合带型), 来自于一个亲本的甲基化位点(H, M 带
型为 0 1或 1 0)往往被另一个亲本的非甲基化带型
(H, M带型为 1 1)所掩盖, 因此检测到的甲基化位
点仅有 41 个, 检测到的甲基化比例为 18.72%, 其
中全甲基化和半甲基化比例分别为 15.98%和
2.74%。在人工甘蓝型油菜 S010个植株基因组中检
测到 3 个位点发生了甲基化模式的改变, 引物组合
EA3HM4 和 EA2HM4 中各有来自母本大黄油菜的
一条(0 1)带型在 S0中变为(0 0), 推测人工合成甘蓝
型油菜后, A 基因组该位点发生了甲基转移, 即由
双链内甲基化变为双链外甲基化, 也不排除相应位
点 CCGG序列发生了改变; 引物组合 EA5HM14在
母本中扩增的带型为(0 1), 在父本中扩增的为(1 0),
在 S0 中扩增的带型与父本中的相同为(1 0), 说明
杂种中 A 基因组相应位点没有被 MspI 切割, 有可
能由内甲基化变为外甲基化, 或者 CCGG序列发生
改变。除了这 3 个 A 基因组上的甲基化改变之
外 , 在杂种 C 基因组上没有检测到甲基化模式的
改变, B 组合 S0 中检测到的变异条带占总条带的
1.37%。表 5所示 S0及双亲间 MSAP带型组成总体
上分为 14类, 其中第 4、第 7类为甲基化模式改变
类型。
图 4 EA16MC4的扩增结果
Fig. 4 Amplification result of AFLP primer pair EA16MC4
B8、B9和 B10为 B组合 S0植株; 1~16为 F19-1~F19-16; 箭头 1指 F19-3、F19-13和 F19-14在 720 bp处的新增带;
箭头 2指 F19-2在 500 bp处缺失带。
B8, B9, and B10: S0 plants of B cross; 1~16: F19-1~F19-16; Arrow 1: novel fragment of F19-3, F19-13, F19-14 at 720 bp locus;
Arrow 2: absent fragment of F19-2 at 500 bp locus.
表 4 B9植株自交 S1株系条带缺失模式
Table 4 Mode of fragments absence within S1 line following B9’s selfing cross
S1 offsprings 引物组合
Combination
of primes
条带大小
Seize of
band (bp)
母本
Female
parent
父本
Male
parent
B9
F19-1 F19-2 F19-4 F19-5 F19-6 F19-7 F19-9 F19-10 F19-11 F19-12 F19-15 F19-16
EA1MC8 430 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EA2MC7 470 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EA8MC12 530 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EA11MC12 700 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EA16MC4 400 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
EA2MC16 500 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
EA5MC13 360 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
EA5MC13 200 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
EA15MC4 600 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
0: 无带; 1: 有带。0: band absence; 1: band presence.
第 7期 赵志刚等: 人工合成甘蓝型油菜早期世代基因组变异的 AFLP和 MSAP标记 1237
表 5 S0与双亲间 MSAP带型组成类型
Table 5 Type of MSAP band patterns of parents and S0 plants
S0与双亲间带型组合 Combination of band patterns between S0 and parents (H M)带型组合类型
Combination of
band patterns
58-6自交子代
Selfing cross offsprings of
58-6
76-1自交子代
Selfing cross offsprings of
76-1
S0植株
S0 plants
条带数
Number
of bands
不同带型组合比例
Ratio of different band
patterns of S0
(%)
1 0 0 0 1 0 1 13 5.88
2 0 0 1 0 1 0 4 1.81
3 0 0 1 1 1 1 50 22.62
4 0 1 0 0 0 0 2 0.90
5 0 1 0 0 0 1 10 4.52
6 0 1 0 1 0 1 12 5.43
7 0 1 1 0 1 0 1 0.45
8 0 1 1 0 1 1 1 0.45
9 0 1 1 1 1 1 15 6.79
10 1 0 0 0 1 0 1 0.45
11 1 1 0 0 1 1 35 15.84
12 1 1 0 1 1 1 7 3.17
13 1 1 1 0 1 1 2 0.90
14 1 1 1 1 1 1 68 30.77
总条带数 Total 154 173 219 221
3 讨论
3.1 异源多倍化后基因组变化情况
多倍化是植物进化的重要机制, 也是促进植物
发生变异的重要力量。近年来随着分子生物学技术
的发展, 有关异源多倍化过程中基因组的一些变化
已得到证实[22-25]。根据 AFLP技术原理, 杂交子代相
对其亲本出现了新增或缺失条带, 可能的原因是新
合成的异源多倍体中发生了 DNA序列消除、基因组
重排或转座子激活等遗传学事件导致原有酶切位点
的消失或者移位[26-28]。因此只要人工甘蓝型油菜与
亲本出现差异条带, 即认为基因组相应酶切位点附
近发生了某种变异。本研究发现 2个组合 S0都发生
了扩增条带的丢失, Ａ组合 S0植株发生变化的条带
占总条带的 1.71%, Ｂ组合 S0植株只有在一个位点
检测到了父本条带丢失, 仅占总条带的 0.09%, 同
时在Ａ组合也发现 0.38%的新增条带。说明人工甘
蓝型油菜在合成当代即可发生基因组变异, 但是变
异频率较低。Ozkan 等[29]在人工合成小麦的研究中
发现来自 B 基因组的几个特异序列在 F1代即丢失,
序列消除事件主要发生于前 3个世代, 他们推测, 亲
本基因组特异序列的消除有利于人工合成种在遗传
上的快速稳定, 是生物进化方面的一种适应机制。
本研究 B 组合 S0代发生的基因组变异频率非常低,
而 S0代 B9 植株自交获得的 16 个 S1单株中, 有 15
个单株扩增出与 B9不同的条带, 其中 3个植株出现
一条同样的新增带, 另外 12个单株出现缺失带, 产
生变化条带的频率为 0.915%, 远远高于其 S0 的变
异。Lukens 等[25]和 Gaeta 等[30]对 50 个不同的人工
甘蓝型油菜株系的 S0和 S5世代基因组变异分析发现,
在 S0世代 DNA 序列上的变异非常少, 而在 S5世代
的 47个植株中, 检测到的遗传变异频率非常高, 33%
的 RFLP标记和 71%的 SSR标记都检测到变异位点,
其中大多数片段的缺失是由于非同源染色体
(A1-C1、A2-C2、A3-C3等)之间的单向易位引起的。
Gaeta和 Pires [31]将这种人工合成异源多倍体后遗传
变异随着世代的发展而递增的现象称为“多倍化齿
轮效应”, 即异源多倍化后部分同源染色体之间发生
遗传重组或者单向易位事件会导致下一代植株部分
同源染色体之间在减数分裂前期发生更高频率的错
配, 从而引发后代更高频率的基因组变异。
3.2 人工合成种遗传及表观遗传变异的基因组
来源
本研究中 AFLP扩增结果表明, 在 A组合 S0植
株中既检测到了 A 基因组的变异, 也检测到了 C 基
因组的变异, 不同之处是 A 基因组的变异在所有检
测植株中发生, C 基因组的变异只在个别植株中发
生; 在 B 组合 S0所有植株中只检测到一处来自于 C
1238 作 物 学 报 第 39卷
基因组的变异, 而在 S1植株中检测到的 9 处变异全
部发生于 C基因组; 对 B组合MSAP分析结果表明,
3 个甲基化模式改变的位点全部位于 A 基因组。前
人对于异源多倍化后的遗传变异是否有偏向某一亲
本基因组的情况进行了大量的研究, Song 等[26]在正
反交合成的人工甘蓝型油菜(AACC 和 CCAA)中没
有发现哪一个基因组更倾向于发生变异, 说明他们
所检测的人工甘蓝型油菜组合具有较好的质核兼容
性。Gaeta等[30]在以甘蓝为母本人工合成的甘蓝型油
菜 S0中也发现, Ａ和Ｃ基因组的片段丢失频率分别
为 0.2%和 0.3%, 没有显著差异, 这一点和我们 A组
合的研究结果相似, 但是他们在同一个组合的 S5世
代发现 C基因组上的 DNA水平变异更加频繁, 而 A
基因组上的甲基化模式改变频率更高, 这一点与我
们的 B 组合研究结果相似。在其他作物中也发现异
源多倍化后遗传变异具有一定的基因组倾向性 ,
Chen 等[32]在栽培黄瓜(C. sativus, 2n=2x=14)和野生
酸黄瓜(C. hystrix, 2n=2x=24)之间合成的异源四倍体
中发现, 不论正交还是反交, 栽培黄瓜基因组片段
缺失更为频繁, 大约是野生酸黄瓜基因组的 2 倍,
说明这种基因组定向变异不受细胞质影响, 而受亲
本染色体数目影响, 即染色体数目少的亲本基因组
更容易变异。综上所述, 引起基因组定向变异的机
制可能涉及到细胞质影响、双亲染色体数目差异、
双亲遗传差异等多个方面。本研究 B 组合检测到的
变异全部来源于 C 基因组, 可能由于受到细胞质和
染色体数目两种因素的双重影响。
3.3 异源多倍化后的表型变异及可能原因
前人的研究结果表明, 人工合成异源多倍体的
花期、育性、植株高度、主茎叶数、花瓣大小等表
型性状往往会出现可遗传的变异[33-35]。本研究在 B
组合 S0代 B9 植株发现黄白花色嵌合现象, B9 自交
获得的 16个子代中有一株淡黄花、一株黄花, 其余
为白花, 对淡黄花植株自交、与黄花植株杂交后代
的初步遗传分析显示该花色受单基因控制。花色嵌
合发生于 S0代, 说明变异不是由于异源多倍体减数
分裂中部分同源染色体的重组导致的, 而在 S2代白
花群体又出现花色嵌合植株, 似乎预示着 B 组合植
株白花基因具有易变倾向。我们用于人工合成甘蓝
型油菜的母本“大黄油菜”(AA)开黄花, 而父本“中迟
芥蓝”(CC)开白花, 合成的异源四倍体甘蓝型油菜开
白花, 说明异源多倍化之后, 位于 C 基因组上的白
花基因相对 A基因组上的黄花基因具有上位效应。
本研究利用 AFLP技术在 B组合 S0和 S1植株检测到
的变异全部来源于 C 基因组, 在一定程度上说明在
这个组合中 C基因组相对于 A基因组更容易发生变
异。综上所述, 推测本研究中花色突变发生的可能
原因是, C 基因组上的某些变异发生于白花基因附
近, 导致其失去转录活性, 而位于 A 基因组上的黄
花基因得以表达。我们在 S0代的 AFLP分析中只检
测到 1 条父本带在所有 S0植株中缺失, MSAP 分析
中 3个甲基化模式改变位点存在于所有 S0植株 A基
因组, 说明以上检测到的变异位点和花色突变无关,
在 S1代的 AFLP分析中检测到 9条位于 C基因组上
的缺失条带, 其中有多个位点在黄花与白花植株之
间表现出多态性, 目前还不能确定这些具有多态性
的位点与花色突变是否有直接关系。下一步的工作
重点是构建作图群体, 定位并克隆该突变系的花色
相关基因, 深入解析该组合人工甘蓝型油菜花色基
因调控网络和异源基因组之间遗传互作机制。
4 结论
人工合成的甘蓝型油菜在早期世代即发生了
DNA序列、胞嘧啶甲基化模式以及花色的变异。在
A、B两个组合 S0代都检测到较低频率的 DNA水平
的变异, 但 B 组合变异频率更低。B 组合 S1 世代
DNA水平变异频率显著提高, 且以 C基因组上的扩
增片段缺失为主。对 B组合 S0代的 MSAP分析结果
表明, 胞嘧啶甲基化模式改变较少, 仅有的 3个改变
位点位于 A 基因组上。B 组合出现的花色变异与
AFLP 和 MSAP 检测到的变异没有明确的联系, 推
测其与该组合中 C基因组的不稳定性有关。
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