全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(4): 532539 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央高校基本科研业务费专项资金项目 (DL09AB13)和哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目 (青年科技创新人才 )
(2013RFQXJ036)资助。
This study was supported by the Basic Scientific Research Expenses of the Higher Education Institutions of Central Government, China
(DL09AB13) and the Subject of Innovative Talents for Science and Technology research in Harbin (Youth Talents in Science and Technology
Innovation) (2013RFQXJ036).
 通讯作者(Corresponding author): 解莉楠, E-mail: linanxie@126.com
第一作者联系方式: E-mail: summerzhang@126.com
Received(收稿日期): 2015-07-21; Accepted(接受日期): 2015-11-20; Published online(网络出版日期): 2015-12-18.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20151218.0915.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00532
羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子萌发期 DNA甲基化的动态
变化
张 旸 1 胡中影 1 赵月明 1 李 娜 2 解莉楠 1,
1 东北林业大学生命科学学院, 黑龙江哈尔滨 150040; 2 黑龙江生物科技职业学院, 黑龙江哈尔滨 150025
摘 要: 自交不亲和系植株的种子往往出现退化现象, 为了研究种子的退化现象是否与甲基化相关, 因此本文采用
甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)技术, 以羽衣甘蓝自交不亲和系 9#种
子、自交亲和系 14#种子为研究对象, 对其生长发育过程种子基因组 DNA 甲基化水平变化情况进行研究。采用改良
的 CTAB 法提取种子萌发不同时期 DNA, 然后通过 MSAP 分析、统计扩增条带, 比较二者之间的差异。对 9#种子
DNA甲基化状态分析表明, 萌发前期(0~2 d)发生甲基化位点数目持续增多, 但萌发后期(2~8 d)发生去甲基化的数目
大量增加, 整个萌发期去甲基化位点数目是甲基化位点数目的 11 倍, 说明 9#种子萌发过程中 DNA 甲基化修饰是基
因表达的重要调控方式之一; 在相同发育时期, 9#在总甲基化、全甲基化、半甲基化水平上均不同程度高于 14#。随
着种子的萌发, 9#全甲基化水平明显上升, 半甲基化水平几乎不变, 而 14#变化趋势与 9#相反, 半甲基化水平明显上
升, 全甲基化水平几乎不变。
关键词: 羽衣甘蓝; 自交不亲和性; 自交亲和性; DNA甲基化
DNA Methylation Dynamic Analysis of Self Compatible Line and Self-Incom-
patible Line of Brassica oleracea var. acephala at Seed Germination Stage
ZHANG Yang1, HU Zhong-Ying1, ZHAO Yue-Ming1, LI Na2, and XIE Li-Nan1,
1 College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2 Heilongjiang Vocational College of Biology and Technology,
Harbin 150025, China
Abstract: The seed of self-incompatible line often degraded. This study aims to clarify the relationship between the degradation
of the seeds and methylation. In this experiment, methylation sensitive amplification polymorphism (MSAP) was used to study
the status and patterns of the DNA methylation at different periods in seed germination of self-incompatible line 9# and
self-compatible line 14#. The improved CTAB method is adopted to extract seed germination in different periods of DNA, and
then through the MSAP analysis, statistical amplification bands, compare the differences between 9# and 14#. The results are
shown as follows: DNA methylation modification throughout the whole process of seed germination of 9#, at the early stage of the
germination (0 to 2 days) methylation sites continued to increase; at the later stage (2 to 8 days) demethylation increased appar-
ently, and eventually the number of demethylation was 11 times more than methylation. It was proved that DNA methylation
modification was an important way to regulate the gene expression during seed germination of self-incompatible line 9#.
Self-incompatible line 9# and self-compatible line 14# had different DNA methylation status clearly at the respectively periods of 0
and 2 days after seed germination. The proportion of total methylation, full-methylation and semi-methylation of 9# was all higher
第 4期 张 旸等: 羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子萌发期 DNA甲基化的动态变化 533


than of 14# at the same period. As seedings continued to grow after germination, in 9#, the proportion of full-methylation increased
clearly and almost that of semi-methylation did not change, while in 14#, the proportion of semi-methylation increased clearly and
almost that of full-methylation did not change.
Keywords: Brassica oleracea var. acephala; Self-incompatibility; Self-compatibility; DNA methylation
羽衣甘蓝(Brassica oleracea var. acephala D.C.)
别名牡丹草、花甘蓝、花菜、花苞菜等[1], 观赏期达
3~4 个月, 其叶型丰富, 叶色绚丽缤纷, 在我国作为
花坛、花境及盆栽的重要观赏花卉[2]。羽衣甘蓝原
产于地中海地区, 早在公元前 200 年古希腊和古罗
马就广为栽培, 目前已成为一种常见的园林绿化植
物[3]。近年来, 国家蔬菜工程技术研究中心从美国、
德国、荷兰等国引进优良羽衣甘蓝品种, 经过系统选
育, 培育出了叶色深绿、风味浓、品质优、抗逆性强、
产量高的新品种“开乐”, 其维生素、可溶性钙、类胡
萝卜素含量丰富, 是一种高营养价值的新型蔬菜。
被子植物在长期进化过程中形成了一种有利于
异花授粉、阻碍自体受精的生殖隔离机制——自交
不亲和性(self-incompatibility, SI)[4], 即指雌雄二性
配子均有正常生活受精能力, 在不同基因型的株间
授粉能正常结籽, 但花期自交不能结籽或结籽率极
低的特性[5]。目前普遍认为, 自交不亲和性由 S基因
控制, 当雌雄性器官具有相同的 S 基因时, 交配不
亲和, 雌雄双方的 S 基因不同时交配能亲和[6-7]。根
据花器官的形态, SI 可分为同型自交不亲和(homo-
morphic incompatibility)和异型自交不亲和(heteromor-
phic incompatibility)两大类[8]。在同型 SI中, 同一物
种内所有不同个体花形态相同, 此类型在被子植物
中较为普遍, 如白菜、甘蓝等[9]; 而在异型 SI中, 主
要表现在雌、雄蕊的相对长度上, 异型 SI 植物主要
分布于雨久花科、报春科、茜草科等[10], 同型 SI植
物分布较为广泛普遍。SI 作为植物自花授粉的遗传
屏障, 是植物采取的一种促进异交、避免自交、防
止物种退化的精密且有效的机制, 在植物进化过程
中起着非常重要的作用[11]。我们在育种过程中发现
羽衣甘蓝经过多代自交后, 自交不亲和系后代有严
重退化现象, 种子的千粒重几乎是亲和系种子的一
半, 且生长势衰退, 易感病。这些不利因素, 都给杂
交育种带来困难, 严重影响了羽衣甘蓝新品种的创
新。目前对羽衣甘蓝自交不亲和系种子退化这一现
象的研究非常少, 如何有效的保持自交后代的品质
是我们急需解决的难题。
DNA 甲基化(DNA methylation)是基因组 DNA
的一种重要表观遗传修饰方式, 也是最早发现的基
因修饰途径 , 其作用机制是在 DNA 甲基转移酶
(DNA methyltransferase, DNMT)的催化作用下, 以
S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)为甲基
供体 , 从而将甲基转移到特定碱基上的过程 [12]。
DNA甲基化现象广泛存在于细菌[13]、植物和动物[14]
中, 参与生物体的多种生物学过程, 包括复制、转
录、DNA 修复、转基因和细胞分化, 是调节基因功
能的重要手段之一[15]。在植物中, DNA甲基化主要
发生在对称序列 CG 中, 在 CHG 和 CHH (H=A、C
或 T)序列中也有发生, 异染色质区域的 DNA 甲基
化程度较高。植物基因组的 CpG 以及 CpNpG、
CpNpN序列上的 C会在 MET1 (Dnmt1同源蛋白)或
CMT3 DNA甲基转移酶的作用下发生甲基化修饰。
同时 MET1 和 CMT3 也参与 DNA 的甲基化, 含
MET1 和 CMT3 突变的拟南芥胚芽发育不良, 说明
DNA 的甲基化对于植物胚芽和种子发育起到了重
要的作用[16]。因此, 认为自交不亲和性的自交个体
后代易退化现象是由于自交使个体 DNA 甲基化程
度积累产生。
本研究从机理和研究技术都比较成熟的基因组
DNA 甲基化水平分析入手, 选用羽衣甘蓝自交不亲
和系 9# 与自交亲和系 14#种子为试材, 分析不同时
期DNA甲基化状态, 从总体上掌握自交不亲和系种
子在萌发过程中基因组DNA甲基化的动态变化, 探
讨 DNA 甲基化在种子萌发过程中控制基因表达的
作用, 以期了解自交不亲和系种子退化现象与甲基
化的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
东北林业大学花卉生物工程研究所从日本引
进的羽衣甘蓝“赤兔”和“白波”两个品种 , 经九
代自交纯化选育 , 从“赤兔”品种的自交后代中选
育出自交不亲和系 9#; 从“白波”品种的后代中
选育出自交亲和系 14#。9#和 14#经多代严格套袋
自交后 , 收获成熟种子 , 挑取饱满籽粒 , 实验室 4
℃保存。
在干净的培养皿中加2层滤纸 , 用蒸馏水充分
浸湿, 将9#与14#种子分别放入培养皿中, 每皿30粒,
534 作 物 学 报 第 42卷

在全自动光照培养箱内培养(22℃ , 光 /暗为16 h/8
h)。取9#种子萌发过程中的第0、第0.5、第1、第2、
第4和第8天的种子或幼苗 , 用液氮冷冻后放入–80
℃冰箱保存。取9#与14#种子及萌发2 d的幼苗, 用液
氮冷冻后放入–80℃冰箱保存。
MSAP试验所用接头和引物均由华大基因合成。
MSAP试验所用酶类包括T4连接酶, EcoR I、Hap II、
Msp I、rTaq Mix和rATP, 均购自TaKaRa公司。聚丙
烯酰胺凝胶电泳所有试剂 : 三羟甲基氨基甲烷
(tris)、尿素(urea)、丙烯酰胺(acrylamide)、N’-N’甲
叉双丙烯酰(bis-acrylamide)、四甲基乙二胺(TEMED)、
亲和硅烷(bind-silane)、剥离硅烷(repel-silane)均购自
MYM公司 ; 苯酚、β-巯基乙醇、聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA·Na2H2O)、过硫酸
铵(AP)、溴酚蓝(bromophenol blue)、二甲苯青(xylene
cyanol FF)、甲酰胺(formamide)均购自哈尔滨伊事
达生物有限公司 ; 氢氧化钠、冰醋酸、无水乙醇均
为分析纯试剂 , 购自天津市永大化学试剂有限公
司 ; 硼酸、硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)购自天津市
光复科技发展有限公司 ; 无水碳酸钠购自天津市
科密欧化学试剂有限公司 ; 氯仿、异戊醇购自北京
化工厂 ; 甲醛购自北京益利精细化学品有限公司 ;
十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)购自Amresco公司 ;
硝酸银购自上海试一化学试剂有限公司 ; RnaseA、
柱式DNA纯化回收试剂盒 , 购自北京天根生化技
术有限公司。
1.2 羽衣甘蓝基因组总 DNA提取
采用改良的CTAB法 , 提取羽衣甘蓝自交不亲
和系9#种子萌发过程不同时期(0、0.5、1、2、4和8 d)
的基因组DNA及自交亲和系14#种子及萌发2 d种子
的基因组, 采用NanoDrop ND-2000微量核酸测定仪
测定DNA浓度和纯度, 并用0.8% (w/v)琼脂糖凝胶
电泳检测DNA质量, 若主带明亮并且没有拖尾和杂
带的现象, 则DNA可用于后续试验。
1.3 MSAP体系的建立
MSAP分析参考Xiong等的方法[17]。试验采用的
接头序列、预扩增引物及选择性扩增引物见表1。
(1)双酶切反应体系25 μL (EcoR I+Hpa II酶切体
系): 5×R/L缓冲液5 μL, 基因组DNA 1 μg, EcoR I (10
U) 0.63 μL, Hpa II (10 U) 0.67 μL, ddH2O补充体积至
25 μL。EcoR I+Msp I酶切体系: 5×R/L缓冲液5 μL,
基因组DNA 1 μg, EcoR I 0.63 μL, Msp I 0.72 μL,
ddH2O补充体积至25 μL。37℃酶切2 h, 取10 μL酶切
产物用0.8% (w/v)琼脂糖凝胶电泳检测 , 成功的酶
切条带成完全弥散状。
(2)连接反应体系25 μL: 5 pmol μL–1 EcoR I接头
0.5 μL, 50 pmol μL–1 Hpa II/Msp I接头0.5 μL, rATP 1
μL, 5×R/L缓冲液2 μL, ddH2O 0.5 μL, 1 U μL–1 T4
DNA连接酶0.5 μL; 酶切产物5 μL。在16℃酒精浴中
过夜连接16 h后4℃保存。EcoR I接头5-CTCGTAGA
CTGCGTACC-3, 3-CATCTGACGCATGGTTAA-5;
Hpa II/Msp I 接 头 5-GATCATGAGTCCTGCT-3,
3-AGTACTCAGGACGAGC-5。
(3)预扩增反应体系25 μL: 稀释好的模板DNA
2.5 μL, EcoR I预选引物(8.3 μm) 1 μL; Hpa II/Msp I
预选引物(8.3 μm) 1 μL, rTaq Mix 12.5 μL, ddH2O 8
μL。充分混匀后进行PCR预扩增, 反应程序如下: 94
℃ 2 min, 94℃ 30 s; 56℃ 60 s, 72℃ 60 s, 21个循
环; 72℃ 7 min, 10℃+∞。取预扩增PCR产物, 用
0.8% (w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳检测 , 理想扩增
效果为DNA条带成弥散状分布, –20℃保存。
(4)选择性扩增体系25 μL: 稀释好的预扩增产
物, 0.5 μL; EcoR I选择引物(10 μm) 1 μL, Hpa II/Msp
I选择引物(10 μm) 1 μL, rTaq Mix 12.5 μL, ddH2O 10
μL。充分混匀后进行PCR扩增, 反应程序如下: 94℃
10 s, 65℃ 30 s (–0.7℃/cycle), 72℃ 60 s, 13个循环;
94℃ 10 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s, 25个循环。72℃ 7
min, 10℃+∞。选择扩增产物变性后进行6% (w/v)聚
丙烯酰胺凝胶电泳分离, 硝酸银染色后进行泳道条
带数及带型统计分析。
1.4 MSAP差异条带的统计分析
同裂酶 Hpa II和Msp I对基因组 DNA的 CCGG
位点甲基化敏感性不同, Hpa II 能识别并切割非甲
基化和单链甲基化位点, 但不能切割双链甲基化位
点; 而 Msp I 可以切割单链或双链上内甲基化位点,
但不能切割外甲基化位点。所以在变性聚丙烯酰胺
凝胶上, 同一基因组 DNA序列分别用 EcoR I/Hpa II
(记为 H)和 EcoR I/Msp I (记为 M)酶切后, 都可能出
现以下 4种谱带情况: I型(H+M+, 记为 11): 均有带,
代表该位点无甲基化; II型(H+M–, 记为 10): H有带,
而 M 无带, 代表该位点为单链外侧胞嘧啶甲基化;
III型(H–M+, 记为 01): M有带, 而H无带, 代表该位
点为双链内侧胞嘧啶甲基化。IV型(H–M–, 记为 00):
均无带, 代表无 CCGG 位点或该位点为双链外侧胞
嘧啶甲基化或双链内外侧胞嘧啶甲基化。
由于Hpa II和Msp I两个同裂酶对CCGG位点胞
第 4期 张 旸等: 羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子萌发期 DNA甲基化的动态变化 535


表 1 接头和引物序列
Table 1 Sequences of adaptors and primers
序列 Sequence (5′–3′) 接头与引物
Adapter and primer EcoR I Hpa II/ Msp I
接头 Adaptors

CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGGTACGCAGTCTAC
GATCATGAGTCCTGCT
CGAGCAGGACTCATGA
预扩增引物 Pre-amplification primer GACTGCGTACCAATTCA ATCATGAGTCCTGCTCGGT
GACTGCGTACCAATTCAAC(E+AAC) ATCATGAGTCCTGCTCGGTAA(HM+TAA)
选择性扩增引物
Selective-amplification primer







GACTGCGTACCAATTCACG(E+AAG)
GACTGCGTACCAATTCACT (E+ACT)
GACTGCGTACCAATTCAGT (E+AGT)
GACTGCGTACCAATTCACA(E+ACA)
GACTGCGTACCAATTCAGC(E+AGC)
GACTGCGTACCAATTCAGG(E+AGG)
GACTGCGTACCAATTCAAG(E+AAG)
GACTGCGTACCAATTCACC(E+ACC)

ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC(HM+TCC)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTTC(HM+TTC)
ATCATGAGTCCTGCTCGGAAC(HM+AAC)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTCG(HM+TCG)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTCT(HM+TCT)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTGT(HM+TGT)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTGA(HM+TGA)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTTG(HM+TTG)
ATCATGAGTCCTGCTCGGTTA(HM+TTA)

嘧啶的甲基化敏感存在差异, 将限制性内切酶不能
识别、切割且没有扩增产物标记为“0”, 而能被同裂
酶识别、切割且有扩增产物标记为“1”。对 9#种子萌
发过程中的后一个生长阶段 DNA 甲基化状态与前
一个生长阶段DNA甲基化状态进行比较, 根据带型
的有无, 将 DNA甲基化位点模式分为两大类: 一类
是单态性位点, 即同一 CCGG 位点带型相同, 甲基
化模式保持不变, 包括 D1~D2; 一类是多态性位点,
即带型有差异, 显示多态性条带。将多态性位点又
细划分为五类: A类为去甲基化类型, 包括从甲基化
状态到非甲基化状态, 以及从双链外侧、双链内外
侧甲基化状态到单链外侧、双链内侧甲基化状态; B
类为甲基化类型, 即从非甲基化状态到甲基化状态,
以及从单链外侧、双链内侧甲基化状态到双链外侧、
双链内外侧甲基化状态; C类为不定向变异类型, 包
括从单链外侧甲基化到双链内侧甲基化和从双链内
侧甲基化到单链外侧甲基化。
本试验甲基化条带计算公式 : (1)扩增条带总
数 : I+II+III 型条带数 ; 表示引物扩增出的 CCGG
位点总数。 (2)甲基化条带总数 : II+III 型条带数 ,
表示 CCGG 位点中发生了甲基化的位点总数。(3)
甲基化比率(MSAP%): II+III 型条带数占总扩增条
带数的比例 , 表示基因 DNA 的整体甲基化水平。
(4)半甲基化条带数及半甲基化比率 : II 型条带数;
II 型条带数占总扩增条带数的比例 , 表示半甲基
化水平。全甲基化条带数及全甲基化比率 : III 型条
带数 ; III 型条带数占总扩增条带数的比例 , 表示
全甲基化水平。
2 结果与分析
2.1 羽衣甘蓝自交不亲和系种子萌发过程基因
组 DNA甲基化水平
提取种子萌发不同时期基因组 DNA, 建立6个
DNA 反应体系 , 分别用限制性内切酶组合 EcoR
I/Hpa II和 EcoR I/Msp I进行消化、连接、预扩增和
选择性扩增等步骤, 从90对引物组合中筛选出20对
扩增结果多态性高、重复性好、可获得清晰条带的
引物组合, 对大小位于200~1000 bp 范围内的 DNA
片段进行谱带统计(表２)。I为 H、M酶切均有位点;
II为 H酶切有位点, M酶切无位点; III为 M酶切有
位点, H酶切无位点。
9 #种子在萌发过程中扩增出的条带总数为
676~712, 其中甲基化条带总数为 162~202, 全甲基
化条带数为 91~130, 半甲基化条带数为 62~80, 由
此可见, 萌发过程中双链内侧胞嘧啶甲基化程度始
终高于单链外侧胞嘧啶甲基化程度。9# 种子萌发过
程中各个时期的DNA甲基化水平有差异, 总甲基化
水平呈现出先缓慢上升再明显下降的趋势, 在萌发
2 d 时达到最高为 28.9%, 萌发 8 d 时达到最低为
22.7%, 且低于 0 d 时的总甲基化水平 25.4%; 双链
全甲基化水平变化趋势与总甲基化水平变化相似 ,
也是先上升再下降, 不同的是在萌发 1 d 时达到最
高为 18.7%; 单链半甲基化水平变化较为复杂, 在
0~1 d 半甲基化水平逐渐降低, 1 d 时达到最低为
8.9%, 随后在 2 d时明显升高到 11.4%, 然后又缓慢
下降到萌发 8 d 时为 9.9%, 且比 0 d 半甲基化水平
536 作 物 学 报 第 42卷

表 2 9#种子萌发过程不同时期基因组 DNA甲基化水平
Table 2 Methylation levels of 9# at different development stages during seeding germination
时间 Time (d) MSAP扩增条带类型
Types of MSAP bands 0 0.5 1 2 4 8
I 504 506 502 497 532 550
II 75 68 62 80 75 71
III 97 117 130 122 94 91
扩增条带总数 Total amplified bands 676 691 694 699 701 712
甲基化条带总数及比率
Total methylated bands and ratio
172 (25.4%) 185 (26.7%) 192 (27.6%) 202 (28.9%) 169 (24.1%) 162 (22.7%)
全甲基化条带总数及比率
Full methylated bands and ratio
97 (14.3%) 117 (16.9%) 130 (18.7%) 122 (17.4%) 94 (13.4%) 91 (12.7%)
半甲基化条带总数及比率
Half methylated bands and ratio
75 (11.1%) 68 (9.8%) 62 (8.9%) 80 (11.4%) 75 (10.7%) 71 (9.9%)

11.1%低。从整个萌发阶段比较, 9#种子在萌发 2 d
时总甲基化、半甲基化水平最高, 在萌发 8 d时甲基
化、半甲基化、全甲基化水平最低。
2.2 羽衣甘蓝自交不亲和系种子萌发过程中相
邻发育时期基因组 DNA甲基化模式
对 9#种子萌发过程中的后一个生长阶段 DNA
甲基化状态与前一个生长阶段 DNA 甲基化状态进
行比较, 统计甲基化模式变化类型的数目(表 3)。多
态性位点占甲基化位点比例越高, 说明在此发育阶
段内甲基化模式发生变化越多, 也就是在此发育阶
段内发生甲基化和去甲基化过程越多。9#种子在萌
发过程中, 相邻发育时期多态性比例分别为 15.0%、
16.4%、20.3%、22.6%和 10.0%, 表明大部分甲基化
位点并未发生甲基化模式变异。其中 0~4 d 发育阶
段内, 多态性比例逐渐升高, 并在萌发 4 d时比例达
到最高, 表明在 0~4 d 内随着种子的萌发甲基化模
式发生变异增多, 暗示发生甲基化和去甲基化过程
增多; 而在 4~8 d这一发育阶段, 多态性比例快速下
降(29.1%、13.3%), 表明甲基化模式变异减少。种子
萌发过程中, A类型在多态性位点数的比例分别为
65.7%、54.7%、50.8%、72.3%和 91.7%, 呈现先缓
慢减小再快速增大的趋势, 可以看出在 0~2 d 这一
阶段发生甲基化数目持续增多, 但在 2~8 d 这一阶
段发生去甲基化的数目大量增加, 最终导致去甲基
化位点数目是甲基化位点数目的 11倍。无论是种子
萌发过程中的哪一个时期, A 类型都是多态性位点
的最主要类型, 发生去甲基化的位点数高于发生甲
基化的位点数, 可见 9#种子在萌发过程中同时存在
DNA 的甲基化和去甲基化作用, 从整体上来看, 以
去甲基化为主。羽衣甘蓝自交不亲和系 9#种子发育
过程中的同一位点甲基化的反复变化可以说明部分
基因在其发育过程中经历了反复的表达和沉默, 这
些位点高频率的变化可能与发育有关, 这些位点的
具体功能还需要后续测序并对其进行功能性的验证。
2.3 羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子基
因组 DNA甲基化差异分析
对羽衣甘蓝自交不亲和系 9#种子萌发过程不同
时期的基因组 DNA甲基化水平研究发现, 9#种子在
萌发 2 d时基因组 DNA甲基化水平达到最高。为探
究自交不亲和系与自交亲和系种子萌发过程中基因
组 DNA甲基化水平的差异, 选取萌发 2 d这一特殊
的发育时期, 以 9#与 14#种子萌发 0 d和 2 d为试材,
进行 MSAP分析, 统计扩增条带(表 4)。
由表可知, 相同发育时期的 9#与 14#相比较, 9#
总甲基化、全甲基化、半甲基化水平均高于 14#; 无
论是 9#还是 14#, 萌发 2 d时的总甲基化、全甲基化、
半甲基化水平均高于 0 d。从 0~2 d, 9#总甲基化水平
上升幅度(25.4%~28.9%)与 14#总甲基化水平上升幅
度 (21.3%~24.4%)接近 , 9#全甲基化水平上升幅度
(14.3%~17.4%)明显高于 14# (13.6%~14.1%), 而 14#
半甲基化水平上升幅度 (7.7%~10.3%)明显高于 9#
(11.1%~11.4%)。在 9#和 14#种子发芽 0 d和 2 d这 2
个时期, 全甲基化水平均高于半甲基化水平, 表明
在这一发育阶段中, 双链内侧胞嘧啶甲基化为 9#和
14#基因组 DNA甲基化主要方式。
3 讨论
DNA 甲基化在植物的生长发育及基因表达调
控等过程中发挥着重要作用[18], 是植物表观遗传修
饰的主要方式之一[19-20]。大量的证据表明, 在植物
第 4期 张 旸等: 羽衣甘蓝自交不亲和与自交亲和系种子萌发期 DNA甲基化的动态变化 537


表 3 9#种子萌发过程中相邻发育时期 DNA甲基化变化模式
Table 3 DNA methylation patterns of adjacent developmental stages in seed germination
类型
Pattern
0.5 d对照 0 d
0.5 d vs 0 d
1 d对照 0.5 d
1 d vs 0.5 d
2 d对照 1 d
2 d vs 1 d
4 d对照 2 d
4 d vs 2 d
8 d对照 4 d
8 d vs 4 d
A1 5 2 5 9 10
A2 2 5 6 19 4
A3 3 4 3 13 6
A4 13 10 5 0 1
A5 0 2 11 6 1
B1 1 9 8 4 1
B2 0 0 8 2 1
B3 7 6 3 0 0
B4 0 0 8 6 0
B5 2 2 0 3 0
C1 2 2 0 0 0
C2 0 0 2 3 0
多态性位点数 Total polymorphic bands 35 42 59 65 24
A型比例% Percentage of band pattern A (%) 65.71 54.76 50.85 72.31 91.67
B型比例% Percentage of band pattern B (%) 28.57 40.48 45.76 23.08 8.33
D1 68 60 59 64 69
D2 95 112 114 94 87
单态性位点数 Singleton polymorphic bands 198 214 232 223 180
甲基化位点数 Methylation polymorphic bands 233 256 291 288 204
多态性比例% Total polymorphic bands ratio (%) 15.02 16.41 20.27 22.57 10.00

表 4 9# 与 14#种子在萌发 0 d、2 d基因组 DNA甲基化水平
Table 4 Methylation levels of 0 h and 48 h at seeding stages of 9# and 14#
试验材料
Materials
I II III
扩增条带数
Total amplified
bands
甲基化条带数及比率
Total methylated bands
and ratio (%)
全甲基化条带数及比率
Full methylated bands
and ratio
半甲基化条带数及比率
Half methylated bands
and ratio
9﹟ 0 d 504 75 97 676 172 (25.44%) 97 (14.35%) 75 (11.09%)
14﹟0 d 508 50 88 646 138 (21.36%) 88 (13.62%) 50 (7.74%)
9﹟2 d 497 80 122 699 204 (28.90%) 122 (17.45%) 80 (11.44%)
14﹟2 d 489 67 91 647 169 (24.42%) 91 (14.06%) 67 (10.36%)

发育不同阶段, 植物主要以胞嘧啶甲基化来调控基
因表达 [21], 与其他植物一样, 羽衣甘蓝种子的生长
发育实际上就是基因有序调控表达的过程, 因此本
试验采用MSAP方法对羽衣甘蓝种子胞嘧啶甲基化
水平进行研究。在植物种子胚胎发生早期, 正确的
甲基化模式是确保合子正常分裂并最终发育成有生
命活力种子的基础[22]。为了研究羽衣甘蓝自交不亲
和系种子退化与DNA甲基化的相关性, 就要明确种
子萌发过程中DNA甲基化的变化规律和特点。从本
文研究结果中可看到, 羽衣甘蓝9# 种子在萌发过程
中, 其甲基化水平变化明显, 模式变化频繁、样式众
多、涉及位点也较多。
在高等植物中, 种子胞嘧啶甲基化水平因植物
种类而异 , 油菜种子甲基化水平为15.7%[23], 大麦
种子甲基化水平为60.5%[24], 不同生态型的拟南芥
中为35.0%~43.0%[25]。这些不同物种间种子DNA甲
基化水平的差异, 一方面可能与检测方法、试验条
件有关, 另一方面可能是遗传控制的结果。本研究
结果显示 , 无论在9#种子萌发的哪一个时期中 , 全
甲基化水平均高于半甲基化水平, 表明双链内侧胞
嘧啶甲基化程度始终高于单链外侧胞嘧啶甲基化程
度, 9#种子在萌发过程中CCGG位点发生甲基化的方
式主要是以双链内侧胞嘧啶甲基化为主, 这与甘蓝
型油菜种子萌发过程一致[23]。从甲基化模式变化上
来看, 在萌发早期(0~2 d), 发生甲基化的多态性条
带占多态性条带比例逐渐升高, 并在萌发48 h时比
538 作 物 学 报 第 42卷

例达到最高, 表明在0~2 d内随着种子的萌发, 甲基
化发生增多; 在萌发后期(2~8 d), 发生甲基化的多态
性条带比例快速下降并在萌发8 d时比例达到最低,
表明在2~8 d内随着种子的萌发, 去甲基化发生增多,
从而可能导致在植物生长发育中部分必要的基因表
达关闭, 这可能与自交不亲和系种子退化现象有关;
在萌发后期(2~8 d)主要发生大量去甲基化过程, 激
活部分基因的表达, 整体上来看, 9#种子萌发过程中,
主要发生去甲基化事件。这一结果和陆光远等在油菜
种子萌发过程中DNA甲基化的MSAP分析一致[24]。
前人的研究资料表明, 植物在发育过程中, 胞
嘧啶的甲基化对基因具有重要的表达调控作用, 在
基因的内部或邻近区域发生甲基化可以抑制这些基
因的表达 , 而去甲基化后又可以激活基因的表达 ,
因此, 对于这些基因而言, 去甲基化似乎是基因表
达的必须步骤。羽衣甘蓝种子萌发过程中检测到大
量的去甲基化事件, 是与种子萌发后启动了大量基
因的表达相一致的。在种子萌发过程中同时还观察
到少量的甲基化事件, 暗示部分基因正在关闭。这
表明, 植物通过DNA甲基化和去甲基化的方式实现
基因的有序表达。
成长于相同环境下的2个羽衣甘蓝品种自交不
亲和系9# 和自交亲和系14#在种子活力、幼苗长势、
植株表型等方面有着不同的表现, 尽管大多数的表
型变异来自于自然遗传变异, 但是否与种子萌发过
程中甲基化变化情况有关, 这仍需我们研究探索。
目前已有对相同植物种属的不同品种间甲基化修饰
水平的研究报道, 如在对大麦2个品种Steptoe (六棱
饲草大麦, 高度休眠)和Morex (六棱啤酒大麦, 无休
眠)种子成熟和萌发过程中全基因组DNA甲基化多
样性的研究发现 , 表观遗传变异(15%)高于基因组
遗传变异(6.9%), 在大麦种子成熟和萌发不同时期,
Morex的DNA甲基化水平略高于相应时期StePtoe的
DNA甲基化水平[25]。对4个烟草品种云烟85、北卡
89、K326、云烟87的基因组DNA甲基化研究发现[26],
同一地点同一取样时间的不同品种间甲基化情况有
很大差异, 表明相同植物种属的不同品种间甲基化
修饰水平不同。本试验对相同种属的2个不同品种9#
与14#种子萌发0 d和2 d全基因组DNA甲基化情况进
行研究, 旨在探索自交不亲和系9#种子退化现象与
甲基化的相关性。试验结果表明, 羽衣甘蓝自交亲
和系与自交不亲和系这两个品系之间所表现出来的
较大的甲基化状态差异, 可能会影响基因在种子发
育过程中经历表达和沉默, 而这些基因表达的开启
和关闭 , 可能是自交不亲和9#种子退化 , 植株发育
退化的原因之一。
4 结论
利用 MSAP 技术, 对羽衣甘蓝自交不亲和系 9#
种子萌发过程不同时期基因组 DNA 甲基化差异的
研究中得到: 萌发过程中总甲基化水平呈现出先缓
慢上升再明显下降的趋势; 同时发生甲基化与去甲
基化, 但是去甲基化占主导地位; 此外在种子发育
过程中还发现同一位点甲基化模式的反复变化现
象。对羽衣甘蓝自交不亲和系 9#种子与自交亲和系
14#种子的 DNA 甲基化差异研究中得到: 在相同发
育时期, 9#的总甲基化、半甲基化、全甲基化水平在
不同程度上均高于 14#, 二者CCGG位点发生甲基化
的方式都主要以双链内侧胞嘧啶甲基化为主; 随着
种子的萌发, 9#全甲基化水平明显升高, 半甲基化水
平几乎无变化; 而 14#半甲基化水平明显升高, 全甲
基化水平几乎无变化。这些结果为进一步探讨羽衣
甘蓝生长发育及器官分化过程中甲基化与去甲基化
对相关基因表达调控的作用奠定了基础。
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