全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(2): 269279 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由广东省自然科学基金项目(10151064001000016), 广东省科技计划项目(2010B050300012, 2009A020102003)和广州市民生科
技重大专项(12B124070011)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 胡建广, E-mail: jghu2003@163.net, Tel: 020-85514234
第一作者联系方式: E-mail: yl.lee@126.com
Received(收稿日期): 2012-05-04; Accepted(接受日期): 2012-08-05; Published online(网络出版日期): 2012-10-08.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121008.1258.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00269
高温胁迫下甜玉米雌穗发育基因差异表达谱分析
李余良 刘建华 郑锦荣 胡建广*
广东省农业科学院作物研究所, 广东广州 510640
摘 要: 利用数字化基因表达谱技术, 对高温胁迫下优良甜玉米杂交种粤甜 13雌穗发育相关基因的表达谱进行分
析。结果表明, 在高温胁迫和适温下差异表达基因达 949个, 其中有上调表达基因 705个, 下调表达基因 244个, 上
调表达 10倍以上的基因 108个, 下调表达 10倍以上的基因 40个。对差异表达基因功能注释分析表明, 它们主要集
中在细胞内组分和膜上, 主要具催化活性、结合活性、水解酶活性、氧化还原酶活性等, 参与代谢、细胞结构与功能、
胁迫应答、物质运输和生物调节等生物学过程, 推测对雌穗发育过程中籽粒和果穗的形成具有重要作用。这些基因
中有一半以上的基因功能未知, 下一步将对其开展克隆和功能方面的分析。
关键词: 甜玉米; 高温胁迫; 数字化基因表达谱; 基因表达; 实时定量 RT-PCR
Gene Expression Profile of Sweet Corn Ears under Heat Stress
LI Yu-Liang, LIU Jian-Hua, ZHENG Jin-Rong, and HU Jian-Guang*
Crop Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: Sweet corn is an important vegetable crop around the world. Heat stress is one of the limiting factors in the production
of maize in southern China. Therefore, digital gene expression profile was used to investigate the global gene expression profiles
in ear development of maize cultivar Yuetian 13 widely planted in Guangdong under heat stress. The results indicated that, in the
distribution of total Clean Tags, high-expression tags with copy numbers larger than 100 were in absolute dominance whereas
low-expression tags with copy numbers smaller than five occupy the majority of distinct tag distributions. In total, 949 differen-
tially expressed genes were detected, including 705 and 244 of genes up- and down-regulated, respectively. Among them, 108 and
40 genes were up- and down-regulated at least 10-fold. Using maize Gene Ontology database, we categorized these genes into
three main categories: cellular component, molecular function and biological process. A large proportion of differentially ex-
pressed genes distributed in cell, intracellular and membrane, related to catalytic, binding, hydrolase and oxidoreductase activities,
and involved in metabolic, cellular structure and function, response to stimulus, transport and biological regulation, were valuable
for investigating kernel and ear development. Under heat stress, the genes related to cell structure maintenance, photosynthesis,
signal transduction, transcription factor, and response to stress had higher expression levels in ear. And six genes were randomly
selected for confirming their expression patterns by quantitative RT-PCR. The result showed these expression patterns basically
consistent with the digital gene expression data. Further research should concentrate on characterizing the unknown function ones
among differentially expressed genes.
Keywords: Sweet corn; Heat stress; Digital Gene expression profile; Differentially expressed genes; Real-time quantitative
RT-PCR
甜玉米(Zea mays L. saccharata sturt)是玉米胚
乳淀粉合成途径相关基因发生突变形成的特殊类型,
享有蔬菜、水果玉米之称[1]。我国种植的主要是 sh2
基因控制的超甜玉米, 截至目前, 广东年种植面积
占我国甜玉米总面积的 50%以上, 是广东乃至华南
地区的优势和高效作物。甜玉米雌穗生长发育对果
穗性状和籽粒产量的形成具有重要的作用, 然而该
区 6 月至 8 月正是抽雄开花和灌浆时期 , 气温高
270 作 物 学 报 第 39卷

达 32~36 , ℃ 持续时间长, 范围广。高温影响花粉花
丝结构和功能, 使玉米花粉质量下降, 花丝吐出紊
乱, 籽粒发育不良, 还会出现果穗异常导致品质变
劣减产, 高温胁迫已成为甜玉米生产的主要灾害性
气候因素之一。已有的研究表明, 高温使植物光合
作用受抑制、细胞膜损伤、细胞老化和死亡, 最终
导致作物结实率降低和减产[2]。近年来研究发现, 植
物对高温胁迫响应并不只是被动的, 它们会通过一
些机制维持基本代谢, 降低胁迫造成的伤害, 通过
调控某些基因的表达抵抗高温[3-5]。
基因表达的变化是调控细胞生命活动的核心机
制, 比较同一类细胞或不同类细胞在不同生理状态
或生长发育阶段下的基因表达差异, 对研究生物生
长发育调控及代谢机制有着重要的意义[6]。当前基
因组学的研究方向正由结构基因组学向功能基因组
学转变。基因转录表达水平的检测和分析是功能基
因组学研究的一个主要内容, 近年来利用 mRNA 差
异显示技术和基因芯片对玉米雌穗发育基因表达研
究发现, 玉米雌穗发育初期器官的形成和发育对产
量性状和杂种优势的形成具有密切关系, 某些基因
在杂种中的沉默表达可以促进籽粒的发育和抑制幼
穗中小花的发育[7]。雌穗发育过程中许多基因表现
出明显的时空特性, 差异表达的基因主要表现出 4
种不同的表达模式, 涉及代谢、发育、刺激应答、
细胞信号转导、物质运输等多个方面。细胞分裂基
因、细胞壁结构和修饰蛋白基因在雌穗发育过程中
大多表现为上调表达, 可能对雌穗细胞的分化和果
穗性状的形成产生重要影响[8-10]。
高通量测序的数字化基因表达谱(Digital Gene
Expression Profile, DGE)技术是新发展起来的分析
生物转录组基因表达的方法, 它具有 3 个明显的优
势: 一为数字化信号 , 其定量敏感性水平达到 1个
拷贝, 定性敏感性能够区分单碱基不同的序列, 从
而更加真实地评价细胞中全部基因的表达; 二为具
有极强检测能力, DGE 一次实验可以检测 500 万条
mRNA 分子的表达, 可以涵盖细胞中几乎所有表达
的基因, 是已知技术中通量最高的; 三为实验步骤
简单, 无背景噪音, 可以最大限度地检测低丰度基
因。不需事先知道或获得目标基因序列, 可以检测未
知基因的表达, 并且是发现新基因的一种方法[11-12]。
本研究利用高通量测序的数字化基因表达谱技
术, 分析了高温胁迫下优良甜玉米杂交种粤甜 13雌
穗发育基因的表达谱, 得到了一些差异表达的基因,
并运用生物信息学方法进行功能分析, 对进一步认
识甜玉米耐热机制, 挖掘耐热基因和指导甜玉米育
种具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料及处理
甜玉米杂交种粤甜 13, 由广东省农业科学院作
物研究所选育, 2011年 8月 19日播于直径 35 cm, 高
35 cm的花盆中, 在四叶期每盆定苗 1株, 土壤肥力
中上等, 生长期不喷药防治病虫, 其他按常规管理。
随机选取生长状况一致的数盆植株为处理组, 每种
处理设置相应的对照。在 10月 2日开花授粉前 1 d
将处理组移入温室, 进行高温处理 2、3、4和 5 d, 每
天 11:00~14:00 35℃处理 3 h, 对照置最高温度
25~28℃的自然条件下生长 , 其他条件与处理组相
同。随后分别将幼穗取下, 进行等量混合, 形成处理
组和对照组, 将其放入锡纸中以液氮速冻, 转移至
80℃超低温冰箱中储存备用。
1.2 样本制备和数字基因表达谱测序(DGE)
由深圳华大基因科技有限公司制备样本和测
序。相关试剂耗材为 Illumina Gene Expression Sam-
ple Prep Kit和 Solexa测序芯片(flow cell), 主要仪器
是 Illumina Cluster Station和 Illumina Genome Ana-
lyzer系统。主要操作包括: 从–80℃冰箱中同时取出
处理组和对照组样品 , 加液氮碾磨成细粉 , 采用
TRIzol (Invitrogen)试剂, 按操作手册方法提取甜玉
米雌穗样品 6 μg 总 RNA, 利用 Oligo(dT)磁珠吸附
纯化 mRNA, 并以 Oligo(dT)引导反转录合成双链
cDNA。用 Nla III内切酶产生标签 5末端, 它识别并
切断 cDNA 上的 CATG 位点, 利用磁珠沉淀纯化带
有 cDNA 3端的片段, 将其 5末端连接 Illumina接头
1。Illumina接头 1与 CATG位点的结合处是 Mme I
的识别位点, Mme I 是一种识别位点与酶切位点分
离的内切酶, 酶切 CATG位点下游 17 bp处, 就产生
了带有接头 1 的 Tag。通过磁珠沉淀去除 3片段后,
在 Tag 3末端连接 Illumina接头 2, 获得两端连有不
同的接头序列的 21 bp标签 library。经过 15个循环
的 PCR 线性扩增后, 通过 6%TBE PAGE 胶电泳纯
化 105 bp 的碱基条带, 解链后, 单链分子被加到
Solexa测序芯片(flow cell)上并固定, 每条分子经过
原位扩增成为一个单分子簇(cluster)的测序模板, 加
入 4 色荧光标记的 4 种核苷酸, 采用边合成边测序
法(sequencing by synthesis, SBS)测序[13]。测序得到
第 2期 李余良等: 高温胁迫下甜玉米雌穗发育基因差异表达谱分析 271


的原始图像数据经 base calling转化为序列数据, 每
个通道产生数百万条原始 Read, Read的测序读长为
49 bp。对测序得到的原始标签首先去除 3′adaptor
序列、低质量标签(含未知碱基 N)以及拷贝数为 1
的标签, 得到 Clean Tag。将 Clean Tag跟基因序列
比对, 确定 Clean Tag代表的基因。在 Clean Tags数
据中, Tags的拷贝数反映了相应基因的表达量, To-
tal Tag Number是拷贝数在某一区间内的所有 Tags
的总数, 提示表达量的信息; Distinct Tag Number是
除去冗余的所有唯一标签的总数, 即拷贝数在某一
区间内的所有 Tags的种类。
1.3 基因功能注释
根据玉米参考基因数据库(http://ftp.maizesequ-
ence.org/current/filtered-set/)和基因组数据库 (http://
ftp.maizesequence.org/current/assembly/), 利用软件
检索 mRNA上所有的 CATG位点, 生成 CATG＋17
nt 碱基的参考标签数据库。通过 NCBI BLAST 中
Blastnr 程序将全部 Clean Tag 与参考标签数据库比
对, 允许最多一个碱基错配, 对其中唯一比对到一
个基因的标签 (Unambiguous Tags)进行基因注释 ,
统计每个基因对应的原始Clean Tag数, 然后对原始
Clean Tag数作标准化处理, 获得标准化的基因表达
量。标准化方法为: 每个基因包含的原始 Clean Tags
数/该样本中总 Clean Tags数×1 000 000, 计算每种
Clean Tag 的相对数值。以 FDR (False Discovery
Rate)≤0.001 且存在 2 倍以上表达差异作为判断基
因表达差异显著的阈值[14]。然后, 利用 GO功能显著
性富集分析把所有差异表达基因向 Gene Ontology
数据库(http://www.geneontology.org/)的各 term 映射,
计算每个 term的基因数目, 与整个基因组背景相比,
在差异表达基因中显著富集的 GO 条目, 从而获取
该基因的 GO功能分类注释信息。
1.4 定量 RT-PCR
采用基于 SYBR Green 的荧光实时定量 PCR
(quantitative real-time PCR)验证基因表达谱测序数
据的可靠性。利用 Primer Premier 5.0软件设计 PCR
引物, 扩增产物长度 80~300 bp, 通过 qRT-PCR 对
引物进行检测, 以玉米组成型表达基因 β-actin 作为
定量分析的内参基因。每个样品中取 1 μg 总 RNA
进行反转录, 反转录酶 SuperScript RT, 反应体积 20
μL, 在反转录产物中加水稀释后用于 qRT-PCR 分
析。应用 Roche SYBR Green PCR Master Mix试剂
盒反应体系, 反应所用仪器为 Roche LighterCycler
480 (Roche, Switzerland), 反应扩增条件为 95℃变
性 3 min; 95 30 s, 58 30 s, 72 30 s, ℃ ℃ ℃ 共 40个循
环; 72℃延伸 4 min。
2 结果与分析
2.1 测序质量评估
处理 HS5B 和对照样品总标签 Total Tags 中
Clean Tag 的分布分别为 95.81%和 95.71%, 它们在
Distinct Tag number 中 Clean Tag 的分布分别为
46.78%和 44.18%, 说明样品制备和测序质量良好,
在此基础上可以进行下一步数据分析。Clean Tags
拷贝数分布统计(图 1)表明, 不均一性、冗余性是细
胞中 mRNA 的显著特征, 少量种类的丰度极高, 而

图 1 Clean Tags拷贝数的分布
Fig. 1 Distribution of Clean Tags copy number
272 作 物 学 报 第 39卷

大部分种类的表达水平很低。图 1 显示拷贝数大于
100的高表达 Tags在 HS5B和对照中分别占 60%左
右, 在数量上占绝对优势, 而拷贝数小于 5 的低表
达 Tags在种类上非常丰富, 达到 55%左右。说明占
mRNA总量 60%的是种类不到 5%的少数mRNA, 而
占种类 55%的 mRNA 全部加起来占到 mRNA 总量
的 6%左右, 从整体上评估数据是正常的。
2.2 高温胁迫下雌穗发育基因表达谱分析
根据基因在样品间的 |log2 ratio|≥1 筛选标准,
并且 FDR≤0.001, 在处理 HS5B和对照之间雌穗差
异表达基因共有 949 个, 其中上调表达基因 705 个,
下调表达基因 244个(图 2), 上调表达 200倍以上的
基因有 87个, 10~25倍之间的基因有 21个。下调表
达的基因 ratio值小于 0.005的基因有 20个, ratio值
小于 0.025的基因有 1个, ratio值小于 0.05的基因有
3 个。图 3 表示粤甜 13 幼穗中小于 0.01 到大于 50
的不同 ratio范围所对应的下调和上调表达基因数量
的分布, 其中差异在 2.0~3.0 及 3.0~5.0 的上调基因
和差异在 0.4~0.5 的下调基因分别占上调和下调基
因的 46%、27%和 32%。

图 2 高温胁迫下雌穗差异表达基因
Fig. 2 Differentially expressed genes under heat stress

图 3 粤甜 13幼穗 ratio值与差异表达基因分布
Fig. 3 Distribution of differentially expressed genes corresponding to different ratios for Yuetian 13 under heat stress

2.3 差异表达基因功能注释
通过 GO 功能显著性富集分析能确定差异表达
基因行使的主要生物学功能, 发掘与基因差异表达
相关联的特征功能分类, 在上述对基因表达谱总体
分析的基础上, 通过 Gene Ontology (简称 GO)基因
功能分类体系将高温诱导粤甜 13 幼穗中差异表达
的基因进行功能分类注释 , 共查询到 665 个 Gene
Ontology分类条目。在细胞位置组分、基因发挥的
分子功能和参与的生物学过程所占的比例分别为
13.7%、26.6%和 59.7%, 生物学过程所占的比例大
于细胞组分和分子功能。在细胞组分中, 主要包括
细胞成分(cell)、细胞内成分(intracellular)、细胞器
(organelle)、细胞质(cytoplasm)、膜(membrane)。在
分子功能中差异表达基因主要分为催化活性(cata-
lytic activity)和结合活性 (binding)、水解酶活性
(hydrolase activity)、转移酶活性(transferase active-
ty)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)。在生
物学过程中差异表达基因主要包括代谢过程(meta-
bolic process)、细胞过程(cellular process)、刺激应
答(response to stimulus)、物质运输(transport)和生物
学调控(biological regulation)。图 4 仅列出以 P 值
<0.5时筛选的差异表达基因功能分类注释。在细胞
组分中主要涉及细胞质及组分(cytoplasm)、光合系统
及组分(photosystem)、叶绿体及组分(chloroplast)。在
第 2期 李余良等: 高温胁迫下甜玉米雌穗发育基因差异表达谱分析 273


分子功能中主要为氧化还原酶活性(oxidoreductase
activity)及钙通道活性(calcium channel activity)。在
生物学过程中差异表达基因主要包括光合作用调
节(regulation of photosynthesis)、代谢和能量调节
(regulation of generation of precursor metabolites
and energy)、茉莉酸生物合成过程 (jasmonic acid
biosynthetic process)和羟脂生物合成过程(oxylipin
biosynthetic process)。

图 4 高温胁迫雌穗差异表达基因 GO功能分类
Fig. 4 Analysis of Yuetian 13 differentially expressed genes under heat stress assigned to GO functional categories

对高温影响雌穗发育上调或下调在 10倍以上
的基因进行分析, 能够更明确地了解差异显著基因
的具体功能。上调表达 10 倍以上的基因有 108 个,
其中有 75个是假定蛋白基因(hypothetical protein),
有 21个基因是已知功能蛋白, 可分为 4类: (1)参与
细胞结构形成的基因, 如可能的DNA促旋酶亚单位
A 基因 GRMZM2G095865 (probable DNA gyrase
subunit A), 对促进 DNA 合成起作用; 二硫化物异
构酶基因 GRMZM2G110742 (protein disulfide isom-
erase7), 在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面
起重要作用[15]; β 松弛蛋白基因 GRMZM2G169967
(beta-expansin 3)是参与植物细胞壁伸展的蛋白。(2)
参与细胞信号转导基因, 丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因
GRMZM2G120202 (serine/threonine-protein phos-
phatase PP1), 与胁迫条件下玉米细胞的信号转导有
关[16]; 电压依赖性钙通道蛋白基因GRMZM2G080767
(voltage-dependent calcium channel protein TPC1),
在生物体内随着膜电位的改变而出现通道的开放、关
闭和失活, 调节细胞内 Ca2＋浓度, 完成信号转导[17];
细胞分裂素脱氢酶基因 GRMZM5G817173 (cyto-
kinin dehydrogenase 4), 通过调节体内细胞分裂素
水平而参与调控玉米生长发育过程, 对于抗逆性等
重要农艺性状改良有重要意义[18]; 富亮氨酸重复序
列跨膜蛋白激酶 GRMZM2G153393 (leucine-rich
repeat transmembrane protein kinase 1)参与 G-蛋白耦
联及钙离子等信号转导的作用 [19]。 (3)转录因子 ,
MYB 类转录因子 GRMZM2G017730 (MYB tran-
scription factor), MYB 类转录因子是指含有一段与
DNA 相结合的高度保守序列 MYB 基序, 且其普遍
存在于植物中, 并广泛参与植物的生长发育和代谢
274 作 物 学 报 第 39卷

调控, 如细胞形态与模式建成、次级代谢的调控以
及生物和非生物胁迫的应答等[20]; 参与光周期调控
途径的 CO基因GRMZM2G092363(CONSTANS-like
protein CO8)。(4) 胁迫应答基因, 无色花色素双加
氧 酶 基 因 GRMZM2G345717 (leucoanthocyanidin
dioxygenase); II 类热激蛋白基因 GRMZM2G034157
(17.8 kD class II heat shock protein); 非特异性脂质
转移蛋白 GRMZM2G004909 (nonspecific lipid-transfer
protein), 非特异性脂质转移蛋白(nsLTP), 是植物中
大量存在的小分子脂类结合蛋白, 具有多种生物学
功能, 如胁迫防御、信号传导、胞壁松弛、蛋白酶
抑制等 [21]; 甘氨酰肽 N-十四 (烷 )酰转移酶基因
GRMZM2G108318 (glycylpeptide N-tetradecanoylt-
ransferase 1), 与植物的抗逆性有关; 液泡分选蛋白
16 GRMZM2G369047 (vacuolar protein sorting-
associated protein VPS16-like), 与玉米种子贮藏蛋
白质的分类、运输和加工有关 [22]; 引导蛋白基因
(DIR) GRMZM2G015333 (dirigent-like protein
pDIR3), 编码蛋白质参与木质素的形成, 与植物体
的病菌防御有关; 与花青素合成代谢相关的花青素
5,3-O-葡萄糖苷转移酶基因 GRMZM2G036409 (an-
thocyanidin 5,3-O-glucosyltransferase), 参与 RNA剪
接的前体 mRNA 剪接蛋白因子 GRMZM2G478709
(pre-mRNA-splicing factor prp45), 水通道蛋白基因
GRMZM2G081843和 GRMZM2G154628 (aquaporin
PIP1-5 和 aquaporin PIP2-4), 是一种小分子跨膜蛋
白质, 其在渗透压和静水压的驱动下能促进水分子
跨细胞膜转运, 参与介导多个植物生长发育的生理
活动, 如细胞伸长、种子发育及逆境胁迫等[23]; 光
系统 I 反应中心 GRMZM2G012397 (photosystem I
reaction center 6), 转移酶基因 GRMZM2G387394
(transferase), 生物钟调节胚轴伸长晚期蛋白基因
GRMZM2G014902 (late elongated hypocotyl protein,
LHY protein), 与植物的昼夜节律调节有关。有 10
个基因功能未知, 其中 2个在 Uniprot数据库中没有
匹配基因。
下调 10倍以上的基因有 40个, 其中 23个基因
的功能是假定的, 有 7个是已知功能基因 , 有核糖
核酸酶基因 GRMZM2G141322 (ribonuclease 1), 谷
胱甘肽 S-转移酶基因 GRMZM2G042040 (micro-
somal glutathione S-transferase 3), GST与植物的抗
逆性有关。依赖 NAD(P)H的氧化还原酶基因 GRM-
ZM2G415579 (NAD(P)H-dependent oxidoreductase)
也与植物的抗逆性有关。皮质细胞轮廓蛋白基因
GRMZM2G059964 (cortical cell-delineating protein),
在玉米中参与胁迫早期信号传导过程[24]。赤霉素调节
基因 GRMZM2G164090 (gibberellin-regulated protein
2), 内在膜蛋白基因 GRMZM2G434557 (integral
membrane protein), 这种类型的膜蛋白又称跨膜蛋
白, 与膜结合非常紧密, 在维持细胞膜结构中起重要
作用。与光周期反应和花发育相关的基因 GRMZM-
2G158809 (ZCN18 protein), 影响玉米成花诱导和雌
雄穗的发育。有 6 个基因功能未知 , 其中 4 个在
Uniprot数据库中没有匹配基因。表 1和表 2中仅列
出雌穗中差异表达 50倍以上的基因, 其中上调表达
基因 87 个, 下调表达基因 20 个, 在 87 个上调表达
基因中 60个基因(68.97%)为假定蛋白功能, 8个基因
(9.20%)功能未知。在下调表达基因中 , 12个基因
(60.0%)为假定蛋白功能, 3个基因(15.0%)功能未知。
上述结果表明, 在高温影响雌穗发育的基因中有许多
基因需要进一步确定其功能, 目前这些基因很难通过
生物信息学的序列相似性分析并注释其生物学功能。
2.4 荧光定量验证差异表达基因
为了验证数字化基因表达谱数据的可靠性, 随
机挑取 6个差异表达基因 (GRMZM2G004909、
GRMZM2G511318、GRMZM2G023711、GRMZM-
2G428130、GRMZM2G427815和 GRMZM2G006287),
它们分别编码玉米 nonspecific lipid-transfer protein、
hypothetical protein、hypothetical protein LOC100384570、
unknown、 hypothetical protein LOC100383323 和
hypothetical protein LOC100192099蛋白基因。试验
以玉米 β-actin 基因作为内参基因。结果表明 ,
qRT-PCR 与数字化基因表达谱结果虽然在基因上调
和下调表达倍数上存在较大的差异, 但是其上调或
下调的趋势却是一致的, 说明表达谱检测结果较为
可靠(图 5)。
3 讨论
作物在生长发育的整个时期会受到各种逆境胁
迫的危害, 在各种胁迫因子中, 温度对作物的生长
发育有着十分重要的作用。近年来, 随着温室效应
的加剧, 高温天气在全球的频率不断增加, 对作物
生产造成了巨大的影响[25]。虽然通过 DNA-RNA杂
交技术、差异显示技术、表达序列标签技术(EST)
等可获得并比较不同生长发育阶段和处理条件下的
基因表达图谱[26], 但是这些传统的方法由于技术方
面的缺陷只能获得有限的基因表达模式信息, 也不
能对细胞内基因表达进行准确的定量研究。高温胁
第 2期 李余良等: 高温胁迫下甜玉米雌穗发育基因差异表达谱分析 275


表 1 雌穗中上调 50倍以上的差异表达基因功能注释
Table 1 Functions of up-regulated expressed genes (ratio>50) in maize ears
基因 ID
Gene ID
log2 ratio
假定功能
Putative function
GRMZM2G401147 13.6452 hypothetical protein
GRMZM2G058057 12.2497 hypothetical protein
GRMZM2G511318 10.7838 hypothetical protein
GRMZM2G357660 10.4788 hypothetical protein
GRMZM2G335242 9.7415 hypothetical protein
GRMZM2G466265 9.6546 hypothetical protein
GRMZM2G095865 9.3923 probable DNA gyrase subunit A
GRMZM2G004909 9.3174 nonspecific lipid-transfer protein
GRMZM2G154685 9.3174 hypothetical protein
GRMZM2G017730 9.1997 MYB transcription factor
GRMZM2G545483 9.1573 unknown
GRMZM2G345717 9.1137 leucoanthocyanidin dioxygenase
GRMZM2G165631 9.0251 hypothetical protein
GRMZM2G057522 8.9278 hypothetical protein
GRMZM2G002915 8.8765 hypothetical protein
GRMZM2G034157 8.8765 17.8 kDa class II heat shock protein
GRMZM2G127754 8.8234 hypothetical protein
GRMZM2G071977 8.7142 hypothetical protein
GRMZM2G081462 8.6546 hypothetical protein
GRMZM2G092363 8.6546 CONSTANS-like protein CO8
GRMZM2G178815 8.6546 hypothetical protein
GRMZM2G446213 8.5925 hypothetical protein
GRMZM2G031004 8.5275 unknown
GRMZM2G319573 8.5275 hypothetical protein
GRMZM2G053004 8.5275 hypothetical protein
GRMZM2G120202 8.5275 serine/threonine-protein phosphatase PP1
GRMZM2G105419 8.5275 hypothetical protein
GRMZM2G001820 8.4635 hypothetical protein
GRMZM5G891371 8.4635 hypothetical protein
GRMZM2G110742 8.4635 protein disulfide isomerase 7
GRMZM2G007933 8.4635 hypothetical protein
GRMZM2G044553 8.3923 hypothetical protein
GRMZM2G046679 8.3923 hypothetical protein
GRMZM2G377539 8.3923 hypothetical protein
GRMZM2G460396 8.3923 hypothetical protein
GRMZM2G008353 8.3923 hypothetical protein
GRMZM2G319402 8.3923 hypothetical protein
GRMZM2G438438 8.3174 hypothetical protein
GRMZM2G301485 8.3174 hypothetical protein
GRMZM5G832672 8.3174 hypothetical protein
GRMZM2G070475 8.3174 hypothetical protein
GRMZM2G356198 8.3174 hypothetical protein OsJ_24360
AC202011.3 8.3174 hypothetical protein
GRMZM2G523169 8.3174 hypothetical protein
276 作 物 学 报 第 39卷

(续表 1)
基因 ID
Gene ID
log2 ratio
假定功能
Putative function
GRMZM2G108318 8.2384 glycylpeptide N-tetradecanoyl transferase 1
GRMZM2G047681 8.2384 hypothetical protein
GRMZM5G833699 8.2384 unknown
GRMZM5G845736 8.2384 hypothetical protein
GRMZM2G097286 8.2384 unknown
GRMZM2G080767 8.2384 voltage-dependent calcium channel protein TPC1
GRMZM2G389015 8.2384 hypothetical protein
GRMZM2G410710 8.2384 unknown
GRMZM2G058685 8.1548 hypothetical protein
GRMZM2G087507 8.1548 hypothetical protein
GRMZM2G069458 8.1548 hypothetical protein
GRMZM2G056629 8.1548 hypothetical protein
AC213654.3 8.1548 hypothetical protein
GRMZM2G389769 8.1548 hypothetical protein
GRMZM2G137593 8.1548 unknown
GRMZM2G070013 8.0715 hypothetical protein
GRMZM2G360023 8.0715 hypothetical protein
GRMZM2G145201 8.0715 hypothetical protein
GRMZM2G102572 8.0715 LOC100286087
GRMZM2G438524 8.0715 hypothetical protein
GRMZM2G057514 8.0715 hypothetical protein
GRMZM5G817173 8.0715 cytokinin dehydrogenase 4
GRMZM5G827496 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G120740 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G459746 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G129781 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G162749 7.9773 unknown
GRMZM2G369047 7.9773 vacuolar protein sorting-associated protein VPS16-like
GRMZM2G174310 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G045154 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G043238 7.9773 hypothetical protein
GRMZM2G351347 7.8765 unknown
GRMZM5G841343 7.8765 —
GRMZM2G015333 7.8765 dirigent-like protein pDIR3
GRMZM2G079661 7.8765 hypothetical protein
GRMZM2G153393 7.8765 leucine-rich repeat trans-membrane protein kinase 1
GRMZM2G036409 7.8765 anthocyanidin 5,3-O-glucosyl-transferase
GRMZM2G113423 7.8765 hypothetical protein
GRMZM2G055880 7.8765 hypothetical protein
GRMZM2G169967 7.8765 beta-expansin 3
GRMZM2G478709 7.8765 pre-mRNA-splicing factor prp45
GRMZM2G030636 7.8765 hypothetical protein
AC177831.3 7.8765 —

第 2期 李余良等: 高温胁迫下甜玉米雌穗发育基因差异表达谱分析 277


表 2 雌穗中下调 50倍以上的差异表达基因功能注释
Table 2 Functions of down-regulated expressed genes (ratio<0.02) in maize ears
基因 ID
Gene ID
log2 ratio
假定功能
Putative function
基因 ID
Gene ID
log2 ratio
假定功能
Putative function
GRMZM2G023711 –10.6018 hypothetical protein GRMZM2G042040 –8.3264 microsomal glutathione S-transferase 3
GRMZM2G011394 –10.4252 hypothetical protein GRMZM2G492768 –8.2479 hypothetical protein
GRMZM2G020840 –10.0888 hypothetical protein GRMZM2G061088 –8.1599 unknown
GRMZM2G171328 –9.6511 hypothetical protein GRMZM2G101584 –8.0661 —
GRMZM2G428130 –9.4429 unknown GRMZM2G120008 –8.0661 hypothetical protein
GRMZM2G325296 –9.3287 Os07g0139400 GRMZM2G327266 –7.9658 unknown
GRMZM2G149289 –8.9129 hypothetical protein GRMZM2G035712 –7.9658 unknown
GRMZM2G427815 –8.7448 hypothetical protein GRMZM2G156486 –7.9658 hypothetical protein
GRMZM2G006287 –8.6184 hypothetical protein GRMZM2G415579 –7.8580 NAD(P)H-dependent oxidoreductase
GRMZM2G141322 –8.4798 ribonuclease 1 GRMZM2G141152 –7.8580 hypothetical protein


图 5 差异表达基因的 qRT-PCR验证
Fig. 5 Validation for the differentially expressed genes by qRT-PCR

迫响应可能受到多个基因的调控, 在 mRNA 水平上
的实验证据也表明, 植物热胁迫后大量的基因表达
发生了变化, 这些基因对植物耐热性的获得可能起
至关重要的作用[27-28]。基因芯片作为一种研究基因
表达差异的高通量技术得到广泛应用, 我们能够大
规模地开展基因表达研究。虽然基因表达芯片能同
步、快速、高通量地同时对众多的基因进行分析, 但
必须首先分离大量 cDNA 片段(靶基因)或寡核苷酸
序列, 再采用特殊方法固定或原位合成在支持物上
制成, 即只能使用已知基因的分子探针与样品进行
杂交, 然后对选定的基因进行表达模式分析[29]。基
于测序技术的数字化基因表达谱具有高通量和高灵
敏性的优势, 不需要获得目标基因序列, 可从全转
录组水平同时研究成千上万个基因的表达 , 能正
确、全面、高效地反映生物在生长发育过程中整个
基因组的基因表达变化情况[30-31]。本研究通过数字
化基因表达谱技术分析高温胁迫影响粤甜 13雌穗
发育早期的基因差异表达, 从 Clean Tags 拷贝数反
映的基因表达量分布看出, 少量种类的 mRNA 表达
丰度极高, 而大部分种类的 mRNA 表达水平很低。
也说明了细胞中 mRNA分布的不均一性、冗余性特
征(图 1), 而且发现了大量上调和下调差异表达基因,
其中表达量在 10倍以上的基因有 148个。
差异表达基因功能分类表明, 它们主要集中在
细胞和细胞内组分及膜上, 分子功能主要分为催化
活性、结合活性、水解酶活性等, 主要参与代谢过
程、细胞过程、刺激应答、物质运输和生物调节等
生物学过程, 其中生物学过程所占的比例大于细胞
组分和分子功能, 可能对雌穗发育过程中籽粒和果
穗的形成具有重要的作用。基因功能注释表明, 影
278 作 物 学 报 第 39卷

响粤甜 13 品种雌穗发育差异的显著上调或下调基
因中部分基因功能已知, 主要是参与细胞结构形成
的基因、蛋白激酶及细胞信号转导基因、转录因子
及抗逆相关蛋白, 表明玉米在高温下通过诱导产生
抗性蛋白而适应或抵御环境胁迫。还有较大部分差
异基因为假定功能和未知功能基因, 它们的作用尚
需进一步研究。
运用 qReal-time PCR法验证差异表达基因, 发
现雌穗中差异表达基因在 qRT-PCR检测与 DGEs检
测之间上调或下调倍数存在较大差异, 但其上调或
下调变化的趋势基本一致, 进一步证明数字化基因表
达谱技术检测结果的可靠性, 两组数据之间的差异可
能与所取的材料及数据分析方法不同有关[32](图 5)。
本研究获得了一批与耐热相关的基因, 初步明
确了高温胁迫诱导甜玉米雌穗发育的一些基因及功
能, 为甜玉米耐热功能基因克隆及分子机制的研究
奠定了基础, 也为研究利用耐热基因资源以提高甜
玉米在高温逆境中的抗逆能力和产量提供了借鉴。
4 结论
甜玉米雌穗发育阶段对高温胁迫较为敏感。检
测到杂交种粤甜 13雌穗差异表达基因 949个, 其中
上调表达基因 705个, 下调表达基因 244个, 这些基
因涉及与逆境相关的代谢、发育、光合作用、抗氧
化、胁迫应答、细胞信号转导、物质运输等多个方
面。上调和下调 10倍以上的差异表达基因中分别有
21 个和 7 个是已知功能蛋白, 还有许多假定功能和
未知功能的基因, 对其进一步研究将揭示高温胁迫
对雌穗分化发育和果穗形成方面的影响。
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