全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 440448 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由上海市自然科学基金项目(12ZR1427700), 国家科技重大专项课题项目(2011ZX08001-003)和上海市启明星计划项目(11QA1405900)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 罗利军, E-mail: lijun@sagc.org.cn, Tel: 021-52230526
第一作者联系方式: E-mail: ysw@sagc.org.cn
Received(收稿日期): 2012-07-26; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2012-12-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121211.1708.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00440
分离和鉴定油菜 D型MAP激酶基因 BnMPK9
余舜武 1 张利达 2 刘国兰 1 罗利军 1,*
1 上海市农业科学院 / 上海市农业生物基因中心, 上海 201106; 2 上海交通大学农业与生物学院植物生物技术研究中心, 上海 200240
摘 要: 为了应对不良的外界环境, 植物形成了一整套复杂的信号网络体系以适应变化的外界环境。其中 MAPK 级
联是其中一个重要而保守的信号传导系统。采用 RT-PCR 策略, 从干旱处理的油菜 cDNA 中克隆出全长的细胞分裂
原激活的蛋白激酶基因。该基因被命名为 BnMPK9 (GenBank登录号为 AY737714), 包含一个蛋白激酶区和一个保守
的 CD区。该基因与拟南芥 AtMPK9高度同源, 其激酶的磷酸化位点为 TDY, 同为 D型 MAPK亚家族基因。Southern
blot结果表明该基因在油菜基因组中拷贝数不少于 2个。Northern blot结果显示该基因能在不同的植物组织中表达。
其表达受到甘露醇、紫外线和双氧水诱导上调表达, 但低温和水杨酸处理后下调表达。实时 RT-PCR分析表明, 甘露
醇和双氧水能长时间诱导该基因高表达。在油菜根中, 甘露醇也能促进其上调表达。BnMPK9 连接到 pYES2.1 酵母
表达载体中转化酵母, 发现增强了酵母对 600 mmol L–1 甘露醇和 0.2 mmol L–1 tBuOOH 的抗性。以上结果说明
BnMPK9是 MAPK基因家族中的一员, 涉及真核生物细胞渗透和活性氧胁迫, 并增强其抗性。
关键词: BnMPK9; 油菜; 非生物胁迫; 酵母表达
Isolation and Characterization of a Rape MAP Kinase BnMPK9 from Group D
YU Shun-Wu1, ZHANG Li-Da2, LIU Guo-Lan1, and LUO Li-Jun1,*
1 Shanghai Agrobiological Gene Center, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106, China; 2 Plant Biotechnology Research Cen-
ter, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China
Abstract: Under environmental stresses, plant has developed complex signaling networks to respond environmental signals and
adapt to unfavorable conditions. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways are one of the most important and
conserved system to control cellular response and growth. A gene encoding Mitogen-activated protein kinase was isolated from
oilseed rape (Brassica napus) treated with drought based on RT-PCR, designated as BnMPK9 (GenBank accession number
AY737714). The cloned gene contains a Pkinase domain and a conserved CD domain. BnMPK9 is highly homologous to AtMPK9
gene from Arabidopsis thaliana and belongs to the D-Subgroup of mitogen-activated protein kinase with phosphorylation motif
(TDY). Southern bolt analysis revealed that there were at least two copies in rape genome. Northern bolt analyses showed that
BnMPK9 could express in different tissues. The expression level of BnMPK9 transcript was up-regulated by mannitol, UV, and
H2O2, but down-regulated by low temperature and salicylic acid (SA). Through Real-time RT-PCR, mannitol and H2O2 treatments
could induce its high expression under different time. In root, mannitol treatment could enhance its expression. BnMPK9 was
ligated into pYES2.1 and transformed into yeasts, and BnMPK9’s expression enhanced yeasts’ resistance to mannitol and peroxide
in 600 m mol L–1 mannitol and 0.2 mmol L–1 tBuOOH drug assays. The present studies show that BnMPK9 is a member of MAPK
family involved in eukaryotic responses and resistance to osmotic and ROS stresses.
Keywords: BnMPK9; Brassica napus; Abiotic stress; Yeast expression
真核生物中广泛存在的细胞分裂原激活蛋白激
酶信号传导系统 (mitogen-activated protein kinase,
MAPKs), 是真核生物控制细胞生长和反应的重要
的信号传递系统。在植物研究中发现该 MAPKs 不
仅涉及植物的生长发育, 而且还能被一系列的环境
因子激活, 包括病原菌侵染、创伤、高低温、干旱、
盐、紫外线辐射和活性氧物质等[1-4]。在动物、植物
和酵母中都存在由三级蛋白激酶构成的 MAPK系统:
第 3期 余舜武等: 分离和鉴定油菜 D型 MAP激酶基因 BnMPK9 441
MAPKKK(MEKK)、MAPKK(MKK)和MAPK(MPK)。
上游的激酶通过共价键磷酸化下游激酶的丝氨酸、
苏氨酸或酪氨酸残基, 激活下游激酶使信号逐级放
大并传递下去[1]。2002 年通过瞬时表达鉴定了一个
完整的拟南芥三级信号传递链[5], 随着研究的深入,
发现植物 MAP 激酶信号传递系统的信号传递途径
比动物和酵母更复杂, 并非呈简单的线性并列。不
同的信号有可能通过同一条激酶传递, 而同一种胁
迫信号的转导可能通过不同的信号传递链, 即所谓
的交叉串连(cross-talk)[2-3]。有些 MAP激酶级联途径
还表现出组织特异性, 在不同类型的细胞中传递同
一种刺激的 MAP激酶级联途径可能不同[5]。大量的
实验也证明MPK通过直接或间接与转录因子、蛋白激
酶和细胞骨架蛋白等相互作用来行使一定的功能[5]。但
信号系统共享三级激酶, 上下级激酶之间如何通过
时空和蛋白之间互作来保证信号传递的特异性仍是
当前研究的挑战。MAPKs在植物反应和胁迫反应中的
如何发挥功能和传递信号仍需要大量的研究解析。
在三级 MAP 激酶中, 仅 MAPK 直接与转录因
子、蛋白激酶和细胞骨架蛋白相互作用, 表现出一
定的功能[2-3]。对 MAPK 的研究有助于理解 MAPK
级联系统的功能。目前, 植物的 MAPKs至少可以分
为 4 个亚族, 分别是 A、B、C和 D [1]。A、B和 C
亚族包含一个保守的 TEY磷酸化位点。不同于其他
MAPK, D 亚族的基因最显著的特征是激酶区拥有
TDY 磷酸化位点。与 A、B 和 C 亚族基因相比, D
亚族的基因的功能研究相对较少, 大部分还是处于
表达谱的研究 [6-7]。转录本分析初步揭示拟南芥
MAPK家族中不同亚家族基因在不同组织中的表达存
在差异, 但均能响应于非生物胁迫处理。其中 D 亚家
族中的 AtMPK9和 AtMPK17对 3种不同的非生物模拟
胁迫处理如干旱、甘露醇和盐均有较强的响应[6]。随
后的深入研究也发现 AtMPK9 倾向于在保卫细胞中表
达, 调控植物的气孔关闭[8]。同时人们也发现一个来源
于水稻的 D亚家族与抗病性有关系[9]。这些研究表明
D 亚家族在植物的生物胁迫和非生物胁迫中扮演了
重要角色。我们从油菜中克隆并鉴定了一个 D 亚族
MAPK基因, 命名为 BnMPK9, 分析了该基因在激素
处理和模拟环境下的表达模式, 并将其导入酵母中,
发现能改善酵母的抗逆性。
1 材料与方法
1.1 试验材料的准备和处理
甘蓝型油菜(Brassica napus)沪油 15由上海市农
业科学院提供。将种子放置在湿润的滤纸上暗培养
2 d, 期间换水一次, 然后将萌芽的幼苗转入含 1/5
大量元素(微量不变)的 MMS液体培养基中[10]。当生
长 10~14 d后, 分别进行不同处理, 其叶片或根用于
抽提 DNA或 RNA。
将种子萌发 10~14 d后的幼苗转入MMS液体培
养基中, 分别添加 200 mmol L–1甘露醇、100 mmol
L–1 NaCl、200 μmol L–1 H2O2、100 μmol L–1 ABA
(abscisic acid)、500 μmol L–1 SA (salicylic acid)和 500
μmol L–1 m-JA (methyl jasmonate)处理不同时间后立
刻放入液氮中用于抽提 RNA。对于脱水处理, 直接
将液体培养基中的幼苗放在干燥的滤纸上保持 30
min, 然后放入液氮中。
1.2 DNA和 RNA抽提
总基因组DNA抽提方法采用 SDS抽提方法[11]。
总 RNA 抽提使用上海华舜生物技术公司提供的
RNA抽提试剂盒。
1.3 BnMPK9全长 cDNA克隆
先根据 D 型 MAPK 家族基因的保守多肽序列,
设计简并引物扩增油菜 cDNA。简并引物分别为 A01
(5-ATGGANTCAGANCTTCACCAAG-3)和 A02 (5-
TANGGATCTGCCAGTGCNTCTTC-3)。然后根据扩
增的片段设计嵌套引物 3A01 (5-GCTGAAGANGCA
CTGGCAGATC-3)和 5A02 (5-GAAAGAGCCACAA
AGTTCTGGNGC-3)。全长 cDNA 克隆的克隆采用
RACE 克隆试剂盒 (Rapid Amplification of cDNA
Ends system, Invitrogen Co., California, 美国)。对于
RACE扩增, RNA反转录使用的引物为 AP (5-GGC
CACGCGTCGACTAGTAC(T)16-3)。引物 A01和 3A01
用于 3端巢式 PCR扩增, 引物 A02 和 5A02用于 5
端巢式 PCR扩增。具体操作参照试剂盒说明书。最
后将巢式 PCR 产物装入 pMD18-T 载体中测序。为
了扩增全长编码 cDNA, 分别合成特异性引物 MK9F-
FULL (5-ATGGATCCTCATAAAAAGGTTACAC-3)
和 MK9R-FULL (5-ATAATCAAGTGTGGAGAGCC
G-3)用来 PCR扩增, 其 PCR产物装入 pMD18-T载
体中测序。
1.4 Southern blot和 Northern blot分析
参照 Amersham Pharmacia提供的试剂盒说明书
进行 Southern blot。约 30 µg的油菜基因组 DNA经
Bgl II、BamH I、EcoR I和 Hind III酶切过夜, 利用
1%琼脂糖凝胶电泳分离和毛细管转膜将 DNA 转移
到 Hybond N+尼龙膜(Amersham Pharmacia)上, 参照
442 作 物 学 报 第 39卷
试剂盒 Gene Images Random Prime Labeling Module
(Amersham Pharmacia)提供的方法对基因全长编码
序列进行探针标记, 随后利用试剂盒 CDP-Star De-
tection Module (Amersham Pharmacia) 进行杂交信
号检测。60℃进行预杂交和杂交, 随后对杂交后的尼
龙膜进行清洗, 即60℃下用0.1SSC (sodium chloride/
sodium citrate), 0.1% SDS 分别清洗 2 次, 每次 15
min。最后用 X光片(Fuji, Kanagawa, Japan)进行曝光
显示。Northern blot方法类似于 Southern blot, 取 20
µg 的油菜总 RNA 进行电泳分离转移到 Hybond N+
尼龙膜上, 预杂交、杂交和清洗过程同 Southern blot,
但温度升高为 65 , ℃ 最后通过 X光片显色。上样量
参照以相同条件下的小麦 18S rRNA 为探针的
Northern blot结果为参照。
1.5 定量 RT-PCR分析
在反转录前, 使用 1 U Deoxyribonuclease I (In-
vitrogen, USA) 反应 20 min除去 RNA中 DNA污染,
然后取 2 μL RNA用于反转录。根据 Progmega公司
提供的操作说明, 使用 AMV Reverse Transcription
System 进行反转录。根据 BnMPK9 基因(GenBank
登录号为AY737714)设计特异性引物MF: 5-TGATG
TTGGAGAGGGGAGTGA-3, MR: 5-CATACAACT
TGAACCGTTGAGCA-3用于荧光定量 PCR, 油菜
Actin1基因, 其引物为 AF: 5-CTCTCGACTACGAG
CAAGAGC-3, AR: 5-GGCAACGGAATCTCTCAG
C-3用于参照基因的荧光定量 PCR。PCR 反应使用
美国 ABI PRISM 7000定量 PCR仪, 具体操作按照
TaKaRa公司试剂盒提供的说明。反应体系包含 SYBR
Premix Ex Taq (2×) 10 μL, 正反向引物各 0.5 μL, 各
种处理的 cDNA模板 1 μL, 加水补足体积至 20 μL。
反应条件如下: 95 30 s, ℃ 然后在 95 10 s, 60 35 ℃ ℃
s下循环 40次。
1.6 转基因酵母的抗性鉴定
将 BnMPK9 全长编码序列装入酵母表达载体
pYES2.1-TOPO 中, 转化酵母菌株 INVSc1 (MATα
his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52) (Invitrogen), 具体操作
方法参见 pYES2.1-TOPO (Invitrogen)试剂盒说明
书。在缺乏尿嘧啶的筛选培养基上挑取转化的单克
隆酵母菌株, 加入到 10 mL的 YPD培养基中, 在摇
床上 30℃过夜。在 OD600值为 0.45, 取 100 μL的酵
母分别稀释为 1/3、1/9、1/27、1/81 和 1/243, 然后
依次取 10 μL 点到含 600 mmol L–1 甘露醇和 0.2
mmol L–1 t-BuOOH的 YPGR培养基平板上, 30℃培
养过夜。包含有 pYES2.1 空载体的 INVSc1 菌株作
为对照。
1.7 序列分析
序列分析使用 GenBank 中的 BLAST 工具(http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行分析, 蛋白激酶结构位点
分析在Pfam (http://pfam.janelia.org/)数据库中进行, 锚
定位点(CD)分析参照 Dóczi等提供的数据进行[12]。
2 结果与分析
2.1 BnMPK9全长 cDNA克隆
根据拟南芥和油菜 MAPK-like 基因保守区域设
计一对简并引物 A01和 A02。以来源于沪油 15干旱
脱水处理 30 min的总RNA为模板, 利用简并引物扩
增出长度为 620 bp片段(图 1-A), 经测序验证发现与
拟南芥 AtMPK9基因高度同源。以该片段为基础, 分
别设计巢式特异性引物分离出 5和 3末端(图 1-B)。
最后与 620 bp片段序列拼接成 1897 bp cDNA片段。
两端设计特异性引物进行编码 cDNA的 PCR扩增, 也
证实了该拼接片段的可靠性(图1-C), 并提交GenBank
(登录号为 AY737714)。
图 1 BnMPK9全长 cDNA的克隆
Fig. 1 Cloning full length cDNA of BnMPK9
A: MPK9保守片段的克隆; B: MPK9的 5和 3cDNA末端的克隆;
C: BnMPK9编码 cDNA克隆。箭头所示为相应克隆的片段。
M: DL2000 DNA marker。
A: conserved fragment of MPK9; B: 5 and 3 cDNA ends of BnMPK9;
C: coding DNA of BnMPK9. Arrows indicate the cloned fragments.
2.2 BnMPK9结构分析
推导的 BnMPK9蛋白编码阅读框包含 502个氨
基酸(图 2)。Pfam蛋白结构分析发现 23~314氨基酸
区域为 Pkinase结构域。其磷酸化位点为 TDY, 具有
D型 MAPK亚家族的典型特征。锚定位点(CD)的同
源性分析[12]表明 BnMPK9 的 CD 紧邻 Pkinase 结构
域(图 2 下画双线)。与拟南芥 MAPK 家族的进化树
分析也发现该基因为 D 型 MAPK 蛋白(图 3), 并与
拟南芥 AtMPK9最为相似, 故命名为 BnMPK9。
第 3期 余舜武等: 分离和鉴定油菜 D型 MAP激酶基因 BnMPK9 443
图 2 BnMPK9全长 cDNA序列和蛋白结构
Fig. 2 Full-length cDNA of BnMPK9 and putative protein structure
下画单线表示蛋白激酶区, 下画双线表示锚定位点, 方框表示磷酸化位点
Underlines indicate Pkinase domain. Double underlines indicate common docking sites. Square frame indicates phosphorylation motif.
2.3 基因拷贝数分析
为了鉴定 BnMPK9 在油菜基因组中的拷贝数,
分别用 EcoR I、Hind III、BamH I和 Bgl II酶切基因
组 DNA进行 Southern blot分析。结果显示每一个酶
切都有 2~5条带型(图 4), 说明油菜基因组中至少存
在 2 个拷贝。这个结果与油菜为多倍体物种是相
444 作 物 学 报 第 39卷
图 3 BnMPK9在 MAPK家族中进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of BnMPK9 among MAPK family
A、B、C和 D分别表示 MAPK家族的亚家族。>50%的 Bootstrap值在图中百分比标注。横线间距为 10%。
A, B, C, and D indicates the subfamilies of MAPK, respectively. Bootstrap values >50% are indicated as percentages. Bar=10%.
吻合的。
2.4 基因表达分析
从 Northern 杂交结果来看, BnMPK9 在油菜根
茎花和叶中都有表达, 相对而言, 在花中的表达最
强(图 5-B)。模拟胁迫和激素处理显示 MPK9被甘露
醇、紫外线、双氧水等处理诱导增强表达, 但低温、
ABA和水杨酸诱导减弱表达(图5)。不同时间段不同
处理的反转录定量 PCR分析也显示 BnMPK9在甘露
醇和双氧水处理下被快速诱导并保持较高的表达水
平(图 6)。ABA处理诱导表达不明显, 但随着时间的
延长, 其表达量略有升高。盐处理显示其表达量随
时间波动。为了显示在根中是否被甘露醇诱导表达,
200 mmol L–1浓度的甘露醇处理的表达量略高于对
照。这些结果说明 BnMPK9 的表达是受渗透类、活
性氧等胁迫诱导表达, 在油菜抗逆性中扮演一定的
角色。
2.5 转基因 BnMPK9增强酵母抗逆性
为了解 BnMPK9是否能调控真核细胞的抗旱和
抗氧化能力, 将 BnMPK9 全长编码 cDNA 装入酵母
表达载体 pYES2.1-TOPO 中, 转化酵母进行抗逆性
筛选。2 个转化酵母菌株的抗药性试验结果发现
BnMPK9 基因能明显改善转基因酵母在添加 600
mmol L–1甘露醇的培养基上的生长, 在添加 0.2 mmol
L–1 tBuOOH培养基上生长也好于转化 pYES2.1空载
体的酵母 INVSc1菌株对照(图 7)。
3 讨论
植物在生长的整个生命周期中经常会遭遇到不
良的外界环境的影响, 如高温、干旱、盐和病虫害
等侵袭。为了能够生存下来, 植物发展了一整套复
杂的信号网络系统探测并保护自己来应对变化的外
界环境。其中 MAPK级联系统是其中一个重要而保
第 3期 余舜武等: 分离和鉴定油菜 D型 MAP激酶基因 BnMPK9 445
图 4 BnMPK9在油菜基因组中 Southern blot分析
Fig. 4 Southern blot analysis of BnMPK9 in oilseed genome
取 30 µg基因组 DNA进行 Hind III、EcoR I、BamH I和 Bgl II
酶切, 在 1%琼脂糖凝胶上分离, 随后转移到 Hybond N+尼龙膜
上, 用 BnMPK9编码区 cDNA探针进行杂交。
Aliquots of genomic DNA (30 µg) are digested with Hind III, EcoR
I, BamH I, and Bgl II, respectively, separated on a 1% agarose gel,
and blotted onto a Hybond N+ membrane followed by hybridization
full-coding cDNA fragments of BnMPK9 as the probe.
守的应对多种胁迫的植物信号传导系统[4]。本研究
中, 我们采用 RT-PCR 策略克隆了油菜 MAPK 级联
系统中基因 BnMPK9。该基因与拟南芥 AtMPK9 同
源性最高, 具有 TDY磷酸化位点, 属于典型的 D型
MAPK 亚家族(图 2), 但相对于其他亚家族, 该亚家
族相关信息了解较少[1]。最近的研究进展显示 AtMPK9
参与到拟南芥活性氧调控的 ABA 信号传递系统和
生物胁迫反应[8,13]。这说明 D型 MAPK亚家族也参
与到植物的抗生物和非生物胁迫反应。尽管
BnMPK9 蛋白象 AtMPK9 一样也具有 CD 位点, 但
无法推知该位点的特异性结合蛋白。在众多的 D型
MAPK 亚家族中, 无论是拟南芥和水稻研究中, 均
未发现控制MPK9上游的MKK蛋白[12,14], 其下游的
磷酸化底物也无法得知。
MAPK 级联系统被认为在应对环境胁迫中发挥
着重要的作用[3-4]。通过 Northern blot和 qRT-PCR试
验证明 BnMPK9也涉及多种逆境胁迫。紫外线辐射、
渗透胁迫和氧化损伤能明显诱导该基因的表达量增
强(图 5)。拟南芥同源基因 AtMPK9在胁迫处理后也
明显受到脱水、甘露醇和盐处理诱导 [6]。BnMPK9
和 AtMPK9 在甘露醇处理下表现类似, 均迅速被诱
图 5 BnMPK9基因转录组分析
Fig. 5 Transcriptional pattern of BnMPK9
在液体培养基中添加相应的化学试剂进行模拟胁迫处理。A: 不
同处理下 BnMPK9的表达。Con: 对照(仅液体培养基); Man: 200
mmol L–1甘露醇处理 0.5 h; NaCl: 100 mmol L–1 NaCl处理 3 h;
Cold: 4℃低温 48 h; UV: 1500 μJ m–2紫外线照射后在黑暗中 30
min; H2O2: 200 µmol L–1 H2O2 3 h; ABA: 100 µmol L–1脱落酸 4 h;
JA: 200 µmol L–1甲基茉莉酸 12 h; SA: 500 µmol L–1水杨酸 12 h。
B: BnMPK9在叶(L)、根(R)、茎(S)和花(F)中的表达。C: 甘露醇
处理幼苗 1 h后 BnMPK9在叶(L)和根(R)中的表达。幼苗的根或
叶在各种处理后进行总 RNA抽提, 然后用 BnMPK9 cDNA进行
杂交。每个泳道总 RNA量为 20 μg, 同时用 rRNA探针杂交样量
为对照。
Every treatment consisted of relevant chemicals being added into
the liquid medium. A: expression of BnMPK9 under different
treatments. Con: control (liquid medium only); Man: 200 mmol L–1
mannitol for 0.5 h; NaCl: 100 mmol L–1 NaCl for 3 h; Cold: 4 for ℃
48 h; UV: 1500 μJ m–2 UV irradiation before 30 min dark; H2O2:
200 µmol L–1 H2O2 for 3 h; ABA: 100 μmol L–1 abscisic acid for 4 h;
JA: 200 µmol L–1 salicylic acid for 12 h; SA: 500 µmol L–1 salicylic
acid for 12 h. B: comparison of BnMPK9 expression in the leaf (L),
root (R), stem (S), and flower (F). C: comparison of BnMPK9 ex-
pression of in leaf (L) and root (R) with mannitol treatment. Man-
nitol: 200 mmol L–1 mannitol for 1 h. Total RNAs were extracted
from leaves or roots following different treatment for various dura-
tions and hybridized with BnMPK9 cDNA. Twenty μg total RNA
was loaded per lane. rRNA was used as a loading control.
导表达并随处理延长均能保持较高的表达; 但盐处
理上存在差异, BnMPK9在早期有上升表达, 但随着
时间的延长 , 其表达得到恢复 (图 5-A, D) , 而
AtMPK9正相反, 早期表达不明显, 但随时间的延长,
表达会升高, 但也未到达甘露醇处理后表达升高的幅
度[6]。另外紫外线照射和双氧水处理易造成体内细胞
活性氧物质的上升, 这 2个处理明显诱导 BnMPK9表
达, 说明该基因对植物体内活性氧物质变化非常敏
感, 并与植物的抗渗透胁迫紧密相连(图 5)。但用单
细胞进行高渗胁迫处理, AtMPK9没有明显被诱导表
达, 说明单细胞和整株表达之间存在差异[6]。已有的
研究表明 AtMPK9 倾向于在气孔保卫细胞中表达, 由
活性氧物质介导调控 ABA 信号传导[8], 同时还涉及
生物胁迫响应[13]。本试验中, BnMPK9能明显被双氧
446 作 物 学 报 第 39卷
图 6 不同处理下的反转录定量 PCR分析
Fig. 6 Expression analysis of BnMPK9 under different treatments using quantitative RT-PCR
每一个处理在液体培养基中进行。1~12柱分别表示 100 µmol L–1脱粒酸(ABA) 处理 0 min、30 min和 12 h, 200 mmol L–1甘露醇处理
0 min、20 min和 12 h, 100 mmol L–1盐处理 0 min、20 min和 12 h, 200 mmol L–1双氧水处理 0 min、20 min和 12 h。
Every treatment was performed in the liquid medium. Lanes 1–12: the control (no treatment), 100 μmol L–1 abscisic acid for 30 min, 12 h, the
control, 200 mmol L–1 mannitol for 20 min, 12 h, the control, 100 mmol L–1 NaCl for 20 min, 12 h, the control, 200 μmol L–1 H2O2 for 20 min,
12 h, respectively.
图 7 转 BnMPK9基因酵母的抗甘露醇和 tBuOOH胁迫分析
Fig. 7 Tolerance to mannitol and tBuOOH of yeasts by overproduction of BnMPK9
酵母菌株 INVSc1胁迫抗性的评估是在生长细胞达到稳定生长期时进行的。空载体 pYES2.1和包含 BnMPK9的 pYES2.1转化酵母。
酵母菌株浓度培养到 OD600值为 0.45时进行梯度稀释(1/3、1/9、1/27、1/81、1/243), 各取 10 μL点在含有 600 mmol L–1甘露醇和 0.2 mmol
L–1 tBuOOH的 YPD平板上。在 30℃培养 3 d后观察。三角型表示细胞浓度梯度变化方向, 即用黑灰色到亮灰色表示酵母细胞浓度由
高到低。
The tress tolerance of the yeast strain INVSc1 is assessed by growing cells to logarithmic (log) or to stationary phase (stat). Yeasts are trans-
formed with the empty vector pYES2.1 and with the vector pYES2.1 carrying the full-coding cDNA of BnMPK9. Cell cultures corresponding
to an OD600 of 0.45 are diluted serially (1/3, 1/9, 1/27, 1/81, 1/243) and aliquots (10 μL) of the dilutions are spotted onto YPD medium sup-
plemented with 600 mmol L–1 mannitol and 0.2 mmol L–1 tBuOOH. Drug tolerance is recorded after 3 days’ growth at 30 . The triangles ℃
indicate the gradation from higher (dark gray) to lower (light gray) cell density aliquots.
水诱导表达, 也说明该基因也参与了活性氧信号通
路(图 5)。在 AtMPK9研究中, 还发现属于 B亚家族
的MPK12功能类似于MPK9, 说明MAPK亚家族间
的功能没有被严格区分开来, 相互之间存在一定的
功能冗余[8]。在本研究中, BnMPK9也在花和根中有
表达, 并且在甘露醇处理后其根中的表达量提升(图
5), 说明 BnMPK9 在其它器官组织中也具有信号调
控作用。
MAPK 级联系统广泛存在于真核生物中, 均具
有 3 级级联激活激酶。酵母细胞具有独立的 MAPK
系统来调控自身的生理以适应不同环境胁迫[15]。单
细胞生物酵母是筛选植物中的耐盐和抗氧化基因很
好的载体。将拟南芥 cDNA 文库导入酵母中筛选抗
氧化基因, 成功地发现 NADPH 氧化还原酶、CEO1
第 3期 余舜武等: 分离和鉴定油菜 D型 MAP激酶基因 BnMPK9 447
等蛋白能够保护酵母忍受氧化损害[18-19]。来源于拟
南芥的 SAL1和 GSK3等基因也能增强酵母的耐盐胁
迫能力[17-18]。利用油菜 MPK3 基因导入到酵母中能
同时提高酵母的耐甘露醇抗氧化性[20], 说明作为单
细胞真核生物的酵母可以用来验证部分抗非生物胁
迫的基因的功能。为了了解 BnMPK9 在不同环境胁
迫下的功能, BnMPK9导入到酵母菌株 INVSc1中。
异源表达能有效地抵抗 tBuOOH 和甘露醇对细胞的
破坏 , 从而提高酵母的抗胁迫能力 (图 6), 说明
BnMPK9 积极参与了真核生物的逆境胁迫响应。与
BnMPK3 导入酵母的效果进行比较, 在相同的浓度
梯度稀释条件下, BnMPK9 增强抗渗透胁迫的能力
更强[19]。但 BnMPK9在不同的逆境胁迫中的响应是
有差异的。比如水杨酸和长时间的冷处理, 其表达
量降低, 说明 BnMPK9 的响应涉及多个逆境信号传
递系统。通过本试验表明通过 RT-PCR 策略和酵母
表达验证基因功能, 能快速克隆基因并初步了解基
因的功能。该方法高效快捷, 结合基因的表达模式
分析, 能快速低成本克隆功能基因。但该方法使用
具有一定的局限性, 只能适用于抗非生物胁迫类且
需酵母中存在直向同源基因的情况; 同时酵母为单
细胞生物, 在多细胞生物中的功能也会存在未知的
差异。本文描述了油菜 MPK9 的快速克隆和表达模
式分析, 发现该基因具有逆境胁迫诱导表达和抗渗
透氧化能力, 采用恰当的基因表达启动模式应用于
农作物的转基因育种, 将有利于培育抗旱性明显提
高的品种。
4 结论
通过 RT-PCR 方法克隆了油菜 BnMPK9 全长
cDNA, 该基因为 D 型 MAPK 家族基因。Southern
blot 和 Northern blot 结果表明该基因在油菜基因组
中至少存在 2 个拷贝, 能被甘露醇、紫外线和双氧
水等胁迫处理诱导表达, 而且该基因在酵母中异源
表达能增强酵母对甘露醇和氧化剂的抗性。结果表
明 BnMPK9 能积极响应油菜的活性氧和渗透胁迫,
并能提高真核生物细胞的抗逆性。
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