全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 6875 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31171578), 国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08004002-002), 黑龙江省高校科技创
新团队建设计划项目(2011TD005)和黑龙江省博士后基金项目(LBH-Z12353)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 才华, E-mail: caihuaneau@sohu.com
第一作者联系方式: E-mail: weizhengwei123@sina.com
Received(收稿日期): 2012-02-13; Accepted(接受日期): 2012-09-05; Published online(网络出版日期): 2012-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121114.1645.019.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00068
转 GsPPCK1基因苜蓿植株的获得及其耐碱性分析
魏正巍 朱延明 化 烨 才 华* 纪 巍 柏 锡 王臻昱 文益东
东北农业大学生命科学学院, 黑龙江哈尔滨 150030
摘 要: 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase, PPCK)是一种钙不依赖的丝氨酸/苏
氨酸(Ser/Thr)类蛋白激酶, 参与碳氮代谢等多个生物学过程, 然而其在碱胁迫反应中的作用尚未见报道。本研究在前
期野生大豆碱胁迫基因表达谱数据基础上, 采用同源克隆的方法分离野生大豆(Glycine soja) PPCK1基因, 该基因编
码的氨基酸序列与大豆(Glycine max) PPCK1蛋白(AAQ83695.1)具有 99%的相似性, 被命名为 GsPPCK1。在 50 mmol
L–1 NaHCO3 胁迫处理 3 h内, 根和叶中 GsPPCK1基因上调表达, 属碱胁迫早期应答基因。通过农杆菌介导法对肇东
苜蓿进行遗传转化, 并对 RT-PCR阳性的超表达转基因株系进行耐碱性分析, 在 100 mmol L–1 NaHCO3处理 15 d后转
基因株系生长状态良好, 而非转基因对照株系明显萎蔫、失绿、甚至死亡; 转基因株系的丙二醛含量和相对质膜透性
显著低于非转基因株系(P<0.05), 而叶绿素含量和根系活力显著高于非转基因对照(P<0.05), 说明超量表达 GsPPCK1
基因增强了苜蓿的耐碱能力。以上结果表明, GsPPCK1 参于植物耐碱胁迫反应过程, 在碱胁迫基因工程研究领域具
有良好的理论和实际应用意义。
关键词: 苜蓿; GsPPCK1; 转基因株系; 耐碱性分析
Transgenic Alfalfa with GsPPCK1 and Its Alkaline Tolerance Analysis
WEI Zheng-Wei, ZHU Yan-Ming, HUA Ye, CAI Hua*, JI Wei, BAI Xi, WANG Zhen-Yu, and WEN
Yi-Dong
College of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Environmental stresses, such as drought, high salty and alkali, adversely affect plant growth and productivity. Plants
adapt to these environmental stresses by inducing numerous genes at the transcriptional level and by protein phosphorylation.
Phosphoenolpyruvate carboxylase kinase (PPCK) is a Ca2+ independent kinase in response to a range of signals in different plant
tissues which plays a key role in the control of plant metabolism. As an important extension of our earlier studies summarized
above on global transcriptome profiling of wild soybean under NaHCO3 treatment, an alkaline (NaHCO3) related gene GsPPCK1
was identified and subsequently cloned from Glycine soja, which has 99% similarity with PPCK1 of Glycine max (AAQ83695.1),
named as GsPPCK1. Expression of GsPPCK1 mRNA was induced by NaHCO3 stress in roots and leaves. GsPPCK1 transcripts
increased during 3 hour exposures to NaHCO3 stress. These results indicated that wild soybean PPCK1 was an early responded
gene to alkaline stress. We transformed GsPPCK1 gene into alfalfa using a developed method, and transgenic alfalfa showed ob-
servably enhanced tolerance to NaHCO3 stress compared with wild-type plants. Transgenic alfalfa grew well in the conditions of
100 mmol L–1 NaHCO3, while wild type plants exhibited discoloration and stunted growth, or even death. There were significantly
changes in malondialdehyde content and relative membrane permeability caused by saline-alkaline stress in non-transgenic lines
compared to transgenic lines (P<0.05). Moreover, compared with non-transgenic, transgenic alfalfa had higher levels of chloro-
phyll content and root activity under alkali stress conditions. The result indicated that over-expression of GsPPCK1 in alfalfa
could enhance alkaline tolerance. All results showed that GsPPCK1 gene could improve the tolerance of transgenic alfalfa to al-
kali stress; therefore, the study on this field is of significance not only in theory but also in practice.
Keywords: Medicago sativa L.; GsPPCK1; Transgenic alfalfa; Alkaline tolerance analysis
第 1期 魏正巍等: 转 GsPPCK1基因苜蓿植株的获得及其耐碱性分析 69
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)不仅产量高、分布
广, 而且营养价值高, 氨基酸组成均衡, 被誉为“牧
草之王”。黑龙江省地处“黄金奶源”地带, 是我国
苜蓿的主产区之一, 也是重要的畜牧业基地。然而,
该地区盐碱土总面积约为 188万公顷[1], 主要分布在
三肇、安达和大庆地区。所以在该地区培育出耐盐
碱转基因苜蓿, 对于发展畜牧业、改善生态环境以
及促进粮食安全, 将起到重大的积极作用。
PPCK (磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶 , phos-
phoenolpyruvate carboxylase kinase)是一个约 31 kD
钙不依赖的的丝氨酸 /苏氨酸(Ser/Thr)类蛋白激酶 ,
是已发现最小的、低丰度的蛋白激酶, 在 C4植物中
该蛋白含量的快速下降与蛋白泛素化的降解密切相
关。PPCK 磷酸化的底物为磷酸烯醇式丙酮酸羧化
酶(PEPC), 具有活性的 PEPC 参与不同的代谢调控
机制, 如 C4和景天酸代谢途径中催化 CO2的固定[2-3]
及豆科植物根瘤发育等[4-5]。研究表明, 干旱、盐胁
迫均能提高 PPCK 蛋白的活性。Monreal 等 [6]和
Echevarria等[7]发现, PPCK1基因在高粱叶肉组织中
表达, 并在盐胁迫下酶活性显著提高。周宝元等 [8]
发现 PEPC 基因在水稻中的超量表达降低了干旱胁
迫对光合作用的抑制。Garcia-Maurino等[9]发现盐胁
迫导致高粱叶片中 PEPC 磷酸化程度增强; 后期研
究表明, 在盐胁迫中, 离子胁迫为主导因素, ABA含量
增加并负向调控 PPCK蛋白的泛素化, 抑制 PPCK的降
解, 保持 C4和景天酸代谢以响应盐胁迫[10]。在碱胁迫
下, PPCK及 PEPC的响应作用尚未见报道, PPCK在
碱胁迫反应中的作用机理并不清楚, 其是否可以提
高转基因苜蓿对碱胁迫的耐性尚无研究。
本课题组前期利用基因芯片技术, 构建了野生
大豆碱胁迫基因转录谱[11], 发现在 NaHCO3 胁迫处
理后, 叶片中 PPCK 基因持续上调表达。为了明确
该基因是否在碱胁迫反应中起作用, 将其转入肇东
苜蓿, 分析转基因苜蓿在碱胁迫下的表型及生理生
化指标, 阐明 GsPPCK1 基因在苜蓿中的耐碱能力,
获得耐盐碱功能显著的转基因苜蓿, 并为豆科植物
耐碱基因工程提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
野生大豆 G07256, 来自吉林省白城市盐碱地[12]。
苜蓿(Madicago sativa L.)品种为肇东苜蓿, 由黑龙
江省农业科学院草业研究所提供。
1.2 GsPPCK1基因碱胁迫下表达特性分析
选取 21 日龄野生大豆幼苗, 分别将单株置 50
mmol L–1 NaHCO3溶液处理 0.5、1、3、6、12和 24
h, 取幼嫩叶片和根末端 3 cm 组织, 提取总 RNA,
进行半定量 RT-PCR。以野生大豆 actin基因为内参,
引物序列为 S: 5-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3;
AS: 5-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3。GsPPCK1
基因引物为 S: 5-CCACCGCACTTCAAACAA-3;
AS: 5-ACCGCTCATGCTACTCCC-3。参照 RNAprep
pure Plant Kit说明书提取植物总 RNA。参照 SMART
cDNA synthesis kit说明书合成 cDNA第一链。
1.3 全长基因的克隆及序列分析
通过同源克隆的方法克隆全长基因, 以野生大
豆 cDNA为模板, 全长基因扩增的引物为 S: 5-AGA
ATGTATAGAGAAGCAGCGGTGAAG-3; AS: 5-GC
AAATTAAGTGAGAAAATTGGATATAGTTG-3。通
过 BLAST 分析全长基因编码的氨基酸序列的相似
性 ; 并利用 DNAMAN 进行多重序列比对 , 利用
ClustalX 1.83完成系统进化树构建。
1.4 植物表达载体的构建及转 GsPPCK1 基因苜
蓿的获得
以 pCAMBIA3301 (http://www.cambia.org/)为载
体基本骨架, 在 Gus 基因 CaMV35S 启动子上游将
E12增强子[13]序列插入 EcoR I及 Hind III内, 替换
原始载体多克隆位点, 利用原始载体上 Bgl II及 Pml
I酶切位点, 将 Gus基因切除, 替换为烟草 omega序
列[13]及设计的多克隆位点, 构建双子叶植物表达载
体卡盒 pBEGO。该载体卡盒由研究室构建并保
存[14-15]。利用多克隆位点中的 EcoR V 和 Sac I 将
GsPPCK1 序列的编码区片段插入植物表达载体卡
盒中 , 构建 GsPPCK1 基因植物表达载体 pBEO-
PPCK1。该表达载体以 bar 基因作为植物筛选标记
基因, GsPPCK1基因受 E12-CaM35S组成型启动子
调控, 在其上游通过 omega 元件增强其翻译效率。
以重组质粒转化根癌农杆菌 EH105a, 在盛慧等 [16]
方法基础上略作改进, 对苜蓿进行转化, 子叶节作
为受体材料。
1.5 转基因苜蓿的分子检测
以抗性植株的总 DNA 为模板, 以植物表达载
体质粒DNA为阳性对照, 分别以水和未转基因植株
的总 DNA为阴性对照 I和阴性对照 II, 35S-bar特异
序列为引物, 对待测植株进行 PCR 扩增。根据 bar
基因序列, 设计用于抗性植株 PCR的检测引物。引
70 作 物 学 报 第 39卷
物为 S: 5-CCTGTGCCTCCAGGGAC-3; AS: 5-GCG
GTCTGCACCATCGTC-3。
通过 RT-PCR 检测获得转基因株系 , 称为
GsPPCK1-OXP。RT-PCR检测引物参见 1.2。以苜蓿
GAPDH (GenBank登录号为MTR_4g131180)为内参,
引物为 S: 5-GTGGTGCCAAGAAGGTTGTTAT-3和
AS: 5-CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG-3。
1.6 转基因苜蓿的扦插及碱胁迫处理
由于苜蓿的生长周期长, 又为开放式异花授粉,
不便于苜蓿种子的获得。因此采用无性扦插繁殖的
方式获得扦插苗, 对扦插苗进行耐碱性分析。在苜
蓿旺盛生长季节, 以每 2~3 个节点剪为一段, 在稀
释 1∶5000的生根粉溶液中浸泡 2 h后, 插入蛭石和
草炭土(1∶1)混合的基质中 , 定期喷灌 , 保持一定
的湿度和温度, 在温室中培养约 14 d至生根。将生
根的扦插苗移栽到蛭石和珍珠岩(1∶1)的混合基质
中, 每钵移栽一株, 并每 2 d浇一次 1/8 Hoagland营
养液壮苗。培养约 4周后, 苜蓿伸长并长出新枝, 选
取生长状态良好且长势一致的转基因苜蓿和野生型
苜蓿, 用 100 mmol L–1的 NaHCO3 (pH 8.5)胁迫处理,
15 d后观察照相。每个株系分别取 5株进行株高和
生理指标测定[12,17]。以上试验重复 2 个生长季, 分
别于 2010年 7月和 2011年 7月进行。
1.7 生理指标测定
采用硫代巴比妥酸法[18]测定丙二醛含量; 参照
Zhang 等[19]的方法, 略有改动, 测定相对质膜透性;
参照陈小龙等[20]的方法测定叶绿素含量; 采用氯化
三苯基四氮唑(TTC)法[21]测定根系活力。
2 结果与分析
2.1 GsPPCK1全长基因的克隆及序列分析
根据大豆 GmPPCK1 (AY374445)的全长序列设
计引物, 扩增并测序获得野生大豆GsPPCK1全长基
因 CDS区。该基因由 808个核苷酸组成, 编码由 268
个氨基酸组成的蛋白质 , 推测蛋白质的分子量为
30.0 kD。对其氨基酸序列的多重序列比对结果(图
1)表明 , 该基因编码的氨基酸序列与大豆 (Glycine
max)、百脉根(Lotus japonicus)及蒺藜苜蓿(Medicago
truncatula)的 PPCK蛋白分别具有 99%、69%及 68%
的相似性。根据 GsPPCK1所编码的氨基酸序列的保
守结构域分析(图 2), GsPPCK1 蛋白含有 Ser/Thr 蛋
白激酶超家族特异的催化结构域(S/TKc, 12~268 氨
基酸), 可催化底物的 γ-磷酸基团从ATP转移到丝氨
酸 /苏氨酸或酪氨酸残基上。另包含 ATP 结合区
(18~41 氨基酸)、磷酸化位点(96~99 氨基酸)和保守
的 Ser/Thr 蛋白激酶激活位点(131~143 氨基酸), 因
此可将其归为 Ser/Thr 激酶蛋白家族。此外 ,
GsPPCK1 还含有 1 个 N-肉豆蔻酰基化位点(N-myr-
istoylation motif [MGXXXS/T(K/R)])(163~168 氨基
酸), 已有报道表明该位点与植物的膜定位和抗逆功
能有关[22]。结合以上分析结果及 GmPPCK1 结构特
点, 该蛋白属于 Ca2+/CaM 蛋白激酶家族成员, 但是
在结构上缺少自抑制区和 EF手型结构域。
图 1 GsPPCK1与已知其他物种 PPCK蛋白氨基酸序列相似性
的进化树
Fig. 1 Phylogenetic tree of similarity of GsPPCK1 and
reported PPCKs
2.2 碱胁迫下基因表达特性分析
图 3 表明, GsPPCK1 基因受碱胁迫诱导, 在叶
和根中 1~3 h内 GsPPCK1基因表达量均有显著上调,
6 h下调, 24 h又上调。根和叶中碱胁迫下基因的表
达趋势相同, 推测该基因在根和叶中以相同的方式
参与植物对碱胁迫的反应, 属于碱胁迫反应中较早
期应答的基因。
2.3 植物表达载体的构建及转 GsPPCK1 基因苜
蓿的获得
构建了 GsPPCK1 的植物超量表达载体 pBEO-
PPCK1 (图4), 采用农杆菌介导的方法进行苜蓿的遗
传转化, 经过种子萌发、无菌苗获得、子叶节农杆
菌共培养、抗性不定芽诱导及筛选 (草铵膦
glufosinate, 0.5 mg L–1)、诱导生根等过程, 最终获得
大量的抗性苜蓿材料(图 5)。
2.4 转基因植株的分子生物学检测
对转基因抗性苜蓿进行 PCR 检测(图 6), 阳性
对照和转基因植株均扩增出大小为 287 bp的目的片
段, 而阴性对照 I 和阴性对照 II 无扩增带。56 株抗
第 1期 魏正巍等: 转 GsPPCK1基因苜蓿植株的获得及其耐碱性分析 71
图 2 GsPPCK1基因编码产物的结构域分析
Fig. 2 Analysis of the protein conserved domains of GsPPCK1
ATP-BS: ATP-binding site; CK2: CK2-PHOSPHO_SITE; S/T Kinase: Ser/Thr kinase activation loop; N-myristoylation motif
[MGXXXS/T(K/R)]; S/TKc: Serine/Threonine protein kinases, catalytic domain.
图 3 碱胁迫处理下叶和根中基因的表达特性分析
Fig. 3 Expression patterns of genes in leaf and root under different stresses
图 4 植物表达载体 T-DNA区
Fig. 4 T-DNA used for alfalfa transformation
GsPPCK1 genes were under the control of E12-CaM35S promoter.
E: EcoR V; S: Sac I; LB: left border; RB: right border.
图 5 转 GsPPCK1基因苜蓿的再生
Fig. 5 Regeneration of alfalfa transformed with the expression
vector pBEO-PPCK1
A: 种子萌发; B: 8日龄无菌苗; C: 子叶节农杆菌共培养;
D: 抗性芽诱导; E: 诱导生根; F: 移栽。
A: seed germination; B: 8-day-old seedling shoot apical node;
C: co-culture; D: induction of glufosinate-resistant shoot;
E: formation of adventitiious root; F: transgenic plants in soil.
图 6 转 GsPPCK1基因再生植株的 PCR鉴定
Fig. 6 PCR identification of transgenic alfalfa lines with
GsPPCK1 gene
M: DL5000; +: 阳性对照(pBEO-PPCK1); –I: 阴性(空白)对照 I
(ddH2O); –II: 未转基因植株阴性对照; 1-4~1-41: 抗性植株。
M: DL5000; +: positive control (pCEPPCK1); –I: negative control I
(ddH2O); –II: negative control II (untransformed plant); 1-4 to 1-41:
resistant lines.
性植株中, 经 3次检测 PCR阳性 20株, PCR阳性率
为 35.7%, 由此表明, 使用 0.5 mg L–1草铵膦在苜蓿
子叶节分化不定芽阶段进行筛选, 筛选压力及筛选
时间是最佳的。为了筛选 GsPPCK1基因超量表达的
转基因苜蓿, 进行 RT-PCR检测。20株 PCR阳性植
株均为 RT-PCR 阳性, GsPPCK1 基因的表达丰度远
远高于对照的未转化植株(图 7)。
72 作 物 学 报 第 39卷
图 7 转 GsPPCK1基因植株的半定量 RT-PCR检测
Fig. 7 RT-PCR identification of transgenic lines with
GsPPCK1 gene
CK: 阴性对照(未转基因植株); 1-18~1-33: 抗性植株;
GPDH: 内参基因。
CK: negative control (untransformed plant); 1-18 to 1-33: resistant
plant; GPDH: the alfalfa GPDH (glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase) gene, used as an internal control.
2.5 碱胁迫对苜蓿生长的影响
5 个转化株系均表现耐碱性 , 对其中 1-18 和
1-19表型和株高的分析(图 8)表明, 在正常生长条件
下, 转基因扦插苗(PPCK1-OXP)与野生型肇东苜蓿
(对照 )的株高差异不大 (P>0.05)(图 8-b), 说明
GsPPCK1基因的超量表达并未影响植株的生长。在
100 mmol L–1 NaHCO3处理 15 d后, 独立转化事件
的 2 个株系幼苗生长状态一致, 株高均显著高于野
生型(P<0.05), 而对照植株出现叶片变黄、萎蔫、植
株矮小等现象。说明 GsPPCK1基因的超量表达提高
了转基因苜蓿对碱胁迫的耐受能力。
2.6 碱胁迫对苜蓿生理指标的影响
调查了转基因株系和对照在正常生长情况下和
100 mmol L–1 NaHCO3胁迫处理 15 d后植株叶片中
的丙二醛含量、相对质膜透性、叶绿素含量及根系
活力, 以分析转基因苜蓿的耐碱能力(图 9)。在正常
生长情况下, 转基因和非转基因苜蓿以上 4 种生理
生化指标均无明显差异 (P>0.05)。由此表明 ,
GsPPCK1 基因的超量表达不但未影响植株的生长,
也未改变苜蓿的生理生化特性。碱胁迫处理 15 d后,
MDA含量、相对质膜透性明显上升, 叶绿素含量和
根系活力明显下降, 而转基因株系的变化幅度均明
显低于对照。其中转基因株系 1-18中丙二醛含量、
质膜透性、根系活力与对照存在显著性差异(P<0.01),
转基因株系 1-19叶绿素含量与对照存在显著性差异
(P<0.01)。以上结果表明, GsPPCK1基因的超量表达
能降低苜蓿在碱胁迫下膜脂的氧化程度[23-24], 防止
植物细胞内有机溶质外渗, 更有利于保护细胞质膜
免受胁迫所造成损伤[25], 并仍能保持较高的光合作
用和根系活力, 提高了苜蓿对碱胁迫的耐受性。
3 讨论
目前国内外关于 PPCK 和 PEPC 的研究多集中
在光合效率和生理代谢等方面, 仅有少数的研究将
图 8 碱胁迫对转基因及野生型苜蓿生长的影响
Fig. 8 Effects of alkaline-stress on transgenic lines and wild
type of alfalfa
A: 转 GsPPCK1基因苜蓿碱胁迫表型分析。a: 相同条件下转
GsPPCK1基因苜蓿和受体植株的表型; b: 100 mmol L–1 NaHCO3
处理 14 d后 GsPPCK1转基因苜蓿和受体植株的表型。
B: NaHCO3胁迫对苜蓿株高的影响。
A: alkali stress phenotype analysis of GsPPCK1 transgenic alfalfa.
a: phenotypes of transgenic alfalfa with GsPPCK1 gene grown in
normal condition; b: phenotypes of transgenic alfalfa with
GsPPCK1 gene grown in NaHCO3 treatment for 14 days.
B: changes of shoot growth of NT and trangenic alfalafa under
NaHCO3 stress. Data are means ±SE of five experiments.
“a” P <0.05 versus control (t-test).
干旱、盐胁迫与光合作用联系起来。方立锋等[26]将
玉米 PEPC基因导入水稻, 使转 PEPC基因水稻在干
旱胁迫下具有较强的渗透调节能力。Monreal等[6]和
Echevarria等[7]发现, PPCK1基因在高粱盐胁迫处理
下酶活性显著提高, 其净光合效率也显著提高, 而
PPCK2 基因在维管束鞘细胞中表达, 并在黑暗中上
调表达。在碱胁迫下, PPCK及 PEPC的作用尚未见
报道。研究表明, GsPPCK1 基因在碱胁迫处理下上
调表达, 该基因的超量表达提高了转基因苜蓿对碱
第 1期 魏正巍等: 转 GsPPCK1基因苜蓿植株的获得及其耐碱性分析 73
图 9 转 GsPPCK1基因苜蓿生理指标分析
Fig. 9 Changes of physiological characteristics of wild-type and transgenic alfalfa under NaHCO3-stress treatments
数据为 5个植株的平均值(±SE), a表示 t-test差异显著(P<0.05), 而 b则是差异极显著(P<0.001)。CK: 非转基因对照; 1-18, 1-19: 超表
达 GsPPCK1基因抗逆转基因苜蓿株系。
Data are means ±SE of five experiments, “a” indicates significant difference at P<0.05; “b” indicates significant difference at P<0.001 (t-test).
CK: non-transgenic controls; 1-18 and 1-19: transgenic plants stress-inducible expressing GsPPCK1.
的耐性。说明 GsPPCK1基因在碱胁迫信号传导途径
中起重要的表达调控作用。
GsPPCK1 基因编码的氨基酸序列与大豆
(Glycine max)、百脉根(Lotus japonicus)及蒺藜苜蓿
(Medicago truncatula)的 PPCK蛋白分别具有 99%、
69%和 68%的相似性。GmPPCK1 (AY374445)基因在
根瘤中表达, 但在根瘤发育过程中表达量并不发生
变化, 与 GmPPCK2 (AY373465)不同, 并不是根瘤
诱导和光合成调控的基因[5]。Nakagawa等[27]报道了
百脉根 PPCK (BAC20362)基因的功能, LjPPCK基因
在根瘤中大量表达。原位杂交发现, PEPC 和 PPCK
蛋白的表达模式在成熟根瘤中相一致, 而在根瘤生
长初期并不相同; 并且发现百脉根幼苗在黑暗条件
下, 根瘤中 PPCK蛋白活性下降, PEPC和 PPCK转
录水平下降, 而在光照条件下, 受茎中光合产物的
调节, PEPC和 PPCK蛋白活性及转录水平得以恢复,
根瘤的发育与光合作用存在必然的联系。如果
GsPPCK1基因与大豆 GmPPCK1基因一样在根瘤的
发育中无相应功能, 则可以推测, 转 GsPPCK1基因
苜蓿耐碱性提高的生理机制可能与光合效率的提高
有关。
另外, 需要指出的是, 植物除了可以通过代谢
物质的合成来适应盐碱胁迫外, 还能通过改变自身
的代谢途径来提高光合效率 , 以适应高盐分的生
境。如一年生盐生植物滨藜, 在盐胁迫下可以从 C3
转变成 C4光合途径, 通过增强光合效率以提高耐盐
性[28]。PPCK 蛋白是 C4和 CAM 光合代谢途径中关
键限速酶 PEP 羧化酶 (phosphoenolpyruvate car-
boxylase, PEPC)的激酶, 可调控 PEPC磷酸化, 参与
光合代谢。转 GsPPCK1基因苜蓿耐碱性提高的生理
机制可能与光合效率的提高有关, 但是碱胁迫是否
能向盐胁迫一样诱导光合途径的转换还有待进一步
研究。
在碱胁迫条件下, 植物体内会发生了一系列的
生理生化变化。细胞膜的结构和功能会出现微弱的
变化 , 细胞内离子平衡被打破 , 叶绿素含量降低 ,
光合作用减弱, 最终导致植物体死亡[29-30]。综合以
上生理指标的结果可以推断, GsPPCK1 参与的蛋白
激酶级联途径中还可能涉及许多与胁迫相关基因的
表达。如调节过氧化酶的表达, 清除碱胁迫下的活
性氧 , 防止膜质过氧化产生丙二醛 , 降低膜损伤 ,
维持膜的稳定性和离子平衡; 调节酶或激素的表达,
74 作 物 学 报 第 39卷
维持较高的叶绿素含量和根系活力, 保持一定的光
合效率和根系活力, 以维持植株的正常生长。
GsPPCK1 基因的超量表达, 激活 PEPC 及其他
蛋白, 启动了蛋白激酶的磷酸化级联反应, 最终引
起一些特定基因表达, 从而维持植株适应不利环境
正常生长。而 GsPPCK1使哪些蛋白磷酸化, 最终又
有哪些基因被调控表达还有待进一步研究 ; 另外 ,
如何将基因的超量表达与表型及相应的生理生化指
标建立相关性也是未来需要研究的重点。
4 结论
从野生大豆中克隆了 GsPPCK1。该基因受碱胁
迫诱导上调表达, 在苜蓿中的超量表达提高了苜蓿
对碱胁迫的耐性。
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