全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1501−1506 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08012-004)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 路兴波, E-mail: luxb99@sina.com, Tel: 0531-83179095; 赵蕾, E-mail: zhaolei@sdu.edu.cn, Tel:
0531- 88177190
Received(收稿日期): 2013-01-21; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-05-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130520.1158.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01501
转植酸酶基因玉米 phyA2基因标准质粒分子构建及其
检测应用
张广远 1,2 孙红炜 1 李 凡 1 杨淑珂 1 路兴波 1,* 赵 蕾 2,*
1山东省农业科学院植物保护研究所 / 山东省植物病毒学重点实验室, 山东济南 250100; 2山东师范大学生命科学学院, 山东济南
250014
摘 要: 质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米 phyA2 基
因设计引物与探针, 并构建了一种包含 phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子 pPZ。选取不同
转基因模板 DNA作用于 phyA2特异性引物, PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现 131 bp的目的条带; 选取不同
转基因作物检测体系作用于质粒分子 pPZ, 只有以 pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和 88 bp)。同时采用 pPZ
质粒分子和转基因玉米阳性基因组 DNA 为标准对 4 个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和 0.1%)进行
定量检测, t检验表明, 2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明, pPZ质粒分子
可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。
关键词: 转植酸酶基因玉米; 质粒分子; TaqMan探针
Construction and Application of a Reference Plasmid Molecule Suitable for
phyA2 of Phytase Transgenic Maize
ZHANG Guang-Yuan1,2, SUN Hong-Wei1, LI Fan1, YANG Shu-Ke1, LU Xing-Bo1,*, and ZHAO Lei2,*
1 Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Shandong Key Laboratory of Plant Virology, Jinan 250100, China;
2 College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China
Abstract: Plasmid molecule based reference material has been shown to be a good alternative as the calibrator for genetically
modified organisms (GMOs) identification and quantification. In this study, primers and probe for qualitative and quantitative
PCR detection for phytase transgenic maize were designed, and a flexible plasmid pPZ containing phyA2 (243 bp) and zSSIIb (178
bp) sequences, was developed. Primers and plasmid were specifically tested through qualitative PCRs. Results showed that the
primers and pPZ plasmid were very specific for phytase transgenic maize since there were no other PCR products amplified using
different GMOs and primers except the specific main bands. Four different levels of genetically modified (GM) matrix samples
(3.0%, 1.0%, 0.5%, and 0.1%) were detected by real-time PCR when plasmid pPZ and phytase transgenic maize genomic DNA
were used as quantification standards, respectively. t-test showed the slop, linearity (R2) and quantification of the two standards for
phyA2 and zSSIIb were not significantly different. The results indicated that the pPZ plasmid can be used as standard for phytase
transgenic maize detection.
Keywords: Phytase transgenic maize; Plasmid; TaqMan
玉米是我国重要的饲料加工原料 , 其所含总磷的
50%以上是以植酸形式存在, 动物几乎不能消化利用, 同
时, 植酸是抗营养因子, 严重影响动物对钙、镁、铁、锌
等元素的吸收。植酸酶是催化植酸和植酸盐水解成肌醇和
磷酸(或盐)的一类酶的总称, 能水解植酸最终释放出无机
磷。在动物饲料中添加外源植酸酶可以改良磷酸盐的生物
利用度, 消除植酸的抗营养作用, 不仅能减少磷在环境中
的排泄, 降低农业生态的负担, 同时也能减少动物饲料中
无机磷的添加, 缓解我国磷资源匮乏的局面。植酸酶有微
生物、动物、植物 3种来源。迄今为止已有几十个植酸酶
1502 作 物 学 报 第 39卷

编码基因被分离克隆。Zinin 等 [1]从 Obesum bacterium
proteus中分离出的植酸酶最适 pH 4.9, 温度 40~45℃, 酶
活 435 U mg−1, Xiong等[2]从 A. niger中又分离得到一种新
型植酸酶 phyI1, 与 phy的核酸序列有 90%左右的同源性,
有 2个最适 pH值, 分别为 2.0和 5.0, 最适温度为 60℃, 酶
活为 9.5 U mg−1。
利用植物生物反应器生产植酸酶的研究由来已久 ,
比如来源于 WT 烟曲霉的植酸酶和经过改造的热稳定植
酸酶已经在小麦和大麦中成功表达 [3]; 来源于无花果曲
霉的植酸酶也已在烟草、苜蓿和马铃薯叶片中成功表
达 [4-6]。我国科学家通过分离来自黑曲霉的植酸酶基因
phyA2 并构建到玉米特异表达载体上, 得到了 27 个表达
植酸酶并能稳定遗传的转基因玉米纯合系[7]。其种子中植
酸酶活性均在 1000 U kg−1以上, 最高达到 120 000 U kg−1,
完全达到中国饲料工业标准(1 kg玉米添加 1000 U植酸酶)
的要求, 可以替代传统工业生产的植酸酶添加剂。以玉米
为载体生产的植酸酶直接用于饲料加工, 实现了以环保、
节能的农业生产方式生产“绿色磷”的梦想 , 具有巨大的
产业优势和应用前景。
我国将转基因植物的研究分为 5个阶段, 即实验研究
阶段、中间试验阶段、环境释放阶段、生产性试验阶段、
申请安全证书与商业化生产阶段。转植酸酶基因玉米是我
国自主研发, 具有自主知识产权的玉米品系, 目前, 该转
基因玉米于 2009年 11月获得农业部正式颁发的转基因生
物生产应用安全证书 , 成为我国首例获得安全证书的粮
食作物, 也是国际上首例研制成功的转植酸酶基因玉米,
标志着转植酸酶基因玉米在我国即将进入大规模商业化
生产阶段。根据《农业转基因生物标识管理办法》规定, 转
基因产品必须进行标识管理 , 因而需要加强转植酸酶基
因玉米相关的检测技术。
质粒分子(plasmid molecule)作为一种新的 DNA标准
物质具有容易获得、使用方便、纯度易控制和均匀性好
等 [8]优点 , 被越来越多地应用在转基因产品定量检测
中[9-12]。研究、构建转植酸酶基因玉米阳性质粒分子, 对
于加强该品种的安全管理, 保护消费者利益, 消除公众对
于转基因作物安全性的疑虑 , 营造良好的转基因作物产
业化氛围具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品材料 转植酸酶基因玉米 BLVA430101, 其
他转基因玉米 Bt11、Bt176、GA21、MON810, 转基因大
豆 MON89788、A2704-12, 转基因水稻 TT51-1, 转基因油
菜 MS1、MS8和非转基因玉米由本实验室提供。
1.1.2 主要试剂 植物基因组 DNA 提取试剂盒、凝胶
回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自美国 Sigma 公司 ,
Premix Ex Taq、rTaq Mastermix、pMD19-T等购自宝生物
工程有限公司(TaKaRa, 大连), 定量 PCR 试剂盒购自罗
氏(Roche)公司, DNA Marker I、ddH2O等购自北京天根生
化公司。
1.1.3 主要仪器 BIO-RAD PCR扩增仪, 实时荧光定
量 PCR仪(美国 ABI, 型号 ABI Prism stepone plus), 紫外
分光光度计(美国 Beckman 公司)及台式高速冷冻离心机
(德国 Hettich)等。
1.1.4 引物和探针 根据 GenBank 数据库中植酸酶基
因 phyA2序列[7], 应用 Primer Express3.0软件设计引物和
探针并在 NCBI 数据库中进行 BLAST 比对确定其对
phyA2 基因特异性, 玉米内标基因引物和探针参照杨立桃
等[13-14]报道。所有引物与探针均由生工生物工程(上海)股
份有限公司合成, 其中探针 5′端标记 FAM荧光报告基团,
3′标记 TAMRA荧光淬灭基团, 序列见表 1。
1.2 方法
1.2.1 目的片段的获取 质粒分子构建过程中 PCR 所
用 引 物 为 C-phyA2-1F/C-phyA2-2R 和 C-zSSIIb-1F/C-
zSSIIb-2R, 扩增体系为 Premix Ex Taq (TaKaRa) 20 μL, 上、
下游引物(10 μmol L−1)各 2.5 μL, 植酸酶玉米模板 DNA (50
ng μL−1) 2 μL, 加水补足至 50 μL。反应程序为 95℃ 5 min;
95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃ 7 min。

表 1 转植酸酶基因玉米 phyA2基因和内标基因 zSSIIb扩增所用引物与探针
Table 1 List of primers and probes for phytase transgenic maize phyA2 gene and zSSIIb gene
目的
Object
扩增对象
Target
名称
Primer name
序列
Sequence (5–3)
扩增大小
Amplicon (bp)
C-phyA2-1F CCAATTTCACCGCCACG phyA2
C-phyA2-2R GCGGGCTCTGGCTTCAGGTTACCTGCACCATGGCC
259
C-zSSIIb-1F GGCCATGGTGCAGGTAACCTGAAGCCAGAGCCCGC
质粒构建
Construction of
plasmid zSSIIb
C-zSSIIb-2R ACGACGACGTTCATCACATTAGG
197
phyA2-1F CACAGACACAGAAGTGACCTACCTC
phyA2-2R GGTAGTCGTAGTTGATCCATTCGTC
phyA2 基因分析
phyA2 analysis
phyA2
phyA2-P CGACACCATCTCCACCAGCACCGT
131
zSSIIb-1F CGGTGGATGCTAAGGCTGATG
zSSIIb-2R AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC
zSSIIb 基因分析
zSSIIb analysis
zSSIIb
zSSIIb-P TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG
88


第 8期 张广远等: 转植酸酶基因玉米 phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用 1503


1.2.2 阳性质粒的构建 将 2个目的片段产物回收, 以
此为模板采用引物 C-phyA2-1F/C-zSSIIb-2R 进行重叠
PCR 扩增, 得到的 PCR 产物回收后通过连接酶连接到
pMD19-T 载体(2692 bp)上。连接后的产物转化至大肠杆
菌 DH5α。
1.2.3 凝胶电泳验证及测序 将得到的克隆产物大量
培养后提取质粒, 采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒, 分别送
上海生工生物工程有限公司和大连宝生物公司测序。将质
粒分子 pPZ酶切线性化后用于 PCR分析。
1.2.4 定性 PCR 扩增 反应体系含 2×rTaq Mastermix
10 μL, 上下游引物(10 μmol L−1)各 1 μL, 植物基因组
DNA (100 ng μL−1) 1 μL, 加水补足至 20 μL。反应程序为
95℃ 5 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环;
72℃ 7 min。
1.2.5 定量 PCR 扩增 反应体系含 2×FastStart Uni-
versal Probe Master (Rox) 12.5 μL, 上、下游引物(10 μmol
L−1)各 1 μL, 探针(10 μmol L−1) 0.5 μL, 植酸酶玉米或质
粒模板DNA 1 μL, 加水补足至 25 μL。反应程序为 95℃ 10
min; 95℃ 15 s, 60℃ 1 min (收集荧光信号), 40个循环。
1.2.6 标准曲线的建立 提取的质粒 DNA 和基因组
DNA 用紫外分光光度计测量浓度并依照公式(1) [15]换算
成拷贝数, 用 Easy Dilution缓冲液(TaKaRa, 大连)按 5倍
倍比将质粒 DNA稀释至 25 000、5000、1000、200和 40
copies μL−1, 基因组 DNA稀释至 62 500、12 500、2500、
500和 100 copies μL−1, 分别对植酸酶基因 phyA2和内标
基因 zSSIIb扩增并建立标准曲线。
拷贝数(copies μL−1)= 6×1023 (copies mol−1)×DNA质
量浓度(g L−1)/摩尔质量(g mol−1)
1.2.7 质粒分子转换系数 根据质粒分子标准曲线计
算植酸酶玉米标准品(0.1、0.5、2.5、5、25 和 150 ng)外
源基因和内标基因拷贝数 , 两者比值即为转换系数
(conversion factor, Cf)。每个模板浓度设置 3个重复, 最终
Cf值为 6个浓度所得 Cf值的平均值。
2 结果与分析
2.1 质粒分子验证及定性 PCR分析
2.1.1 质粒分子测序结果 两家公司测序结果一致 ,
与实际碱基序列也完全符合, 克隆序列共 421 bp (结果
如图 1), 1~243为 phyA2基因序列, 244~421为 zSSIIb基因
序列。
2.1.2 特异性验证 引物 phyA2-1F/phyA2-1R 特异性
扩增结果如图 2, 只有植酸酶玉米能够扩增出 131 bp大小
的特异性片段, 其他对照样品(转基因玉米 Bt11、Bt176、
GA21、MON810, 转基因大豆 MON89788、A2704-12, 转
基因水稻 TT51-1, 转基因油菜MS1、MS8, 非转基因玉米)
和空白对照均无目的条带出现 , 说明该引物对具有较高
的准确性和特异性。
应用 8 种转基因品系特异性检测体系 (Bt11 [9]、
MON810 [16]、GA21 [9]、MON89788 [17]、A2704-12 [18]、
TT51-1 [19]、MS1 [20]、MS8 [21])、4 种内标基因检测体系
(Sad1-1F/2R[10]、SPS-1F/2R[19]、Lec-1F/2R[17]、hmg-1F/2R [9])
和 phyA2-1F/2R、zSSIIb-1F/2R检测体系对质粒分子进行
特异性验证 , 结果如图 3, 质粒分子能特异性扩增出
phyA2 基因(131 bp)和 zSSIIb 基因(88 bp)特异性片段, 其
他检测体系则无目的条带出现 , 表明本研究构建的质粒
分子具有良好的特异性。


图 1 重组 DNA序列测序结果
Fig. 1 Nucleotide sequences of recombinant fragment
图中横线和箭头表示引物、探针的位置和方向。
The lines and arrows indicate the location and direction of primers and probes.
1504 作 物 学 报 第 39卷


图 2 植酸酶玉米检测体系特异性扩增
Fig. 2 Specificity assays for the employed detection system for
phytase transgenic maize
M: DNA marker I; 1~11: 分别为转基因玉米 Bt11、Bt176、GA21、
转植酸酶基因玉米、MON810, 转基因大豆 MON89788、
A2704-12, 转基因水稻 TT51-1, 转基因油菜 MS1、MS8和非转
基因玉米; 12: 空白对照。
M: marker I; 1–11: GM maize Bt11, Bt176, GA21, phytase trans-
genic maize, MON810; GM soybean MON89788, A2704-12; GM
rice TT51-1, GM rapeseed MS1, MS8 and conventional maize;
12: no template control (NTC).


图 3 质粒分子 pPZ特异性测试
Fig. 3 Specificity test for the plasmid pPZ
M: DNA marker I; 1~14: 分别为 phyA2-1F/2R、zSSIIb-1F/2R、
Bt11-1F/2R、MON810-1F/2R、GA21-1F/2R、MON89788-1F/2R、
A2704-12-1F/2R、TT51-1-1F/2R、MS1-1F/2R、MS8-1F/2R、
Sad1-1F/2R、SPS-1F/2R、Lec-1F/2R和 hmg-1F/2R检测体系。
M: DNA marker I; 1–14: amplification from the primer pair
phyA2-1F/2R, zSSIIb-1F/2R, Bt11-1F/2R, MON810-1F/2R,
GA21-1F/2R, MON89788-1F/2R, A2704-12-1F/2R, TT51-1-1F/2R,
MS1-1F/2R, MS8-1F/2R, Sad1-1F/2R, SPS-1F/2R,Lec-1F/2R, and
hmg-1F/2R, respectively.

2.1.3 质粒分子灵敏度测试 质粒分子 PCR 扩增灵敏
性是衡量该阳性质粒定性检测性能的重要参数之一。将质
粒 DNA依次稀释至 500、300、100、50、10、8、5和 0 copies
μL−1, 以此为模板进行 PCR 扩增, 结果显示(图 4), 随着
模板拷贝数的降低, phyA2基因特异性(131 bp)和 zSSIIb基
因特异性(88 bp)扩增的能力降低, 当模板浓度低于 10 个
拷贝时条带比较模糊或者无明显条带出现 , 说明质粒分
子在定性 PCR中最低检测限(limit of detection, LOD)为 10
个阳性拷贝, 灵敏度较高, 满足转基因检测要求。

图 4 质粒分子 pPZ定性 PCR LOD测试(A为 phyA2基因扩增,
B为 zSSIIb基因扩增)
Fig. 4 LOD tests in phyA2 gene (A) and zSSIIb gene (B) detec-
tion systems based on pPZ as calibrators by qualitative PCR
M: DNA marker I; 1~8: pPZ质粒拷贝数分别为 500、300、100、
50、10、8、5和 0的 PCR扩增。
M: DNA marker I; 1–8: Amplifications of pPZ DNA containing 500,
300, 100, 50, 10, 8, 5, and 0 copies.

2.2 质粒分子在荧光定量 PCR中的应用
2.2.1 标准曲线的建立 以质粒 DNA 和基因组 DNA
作为标准绘制标准曲线(图 5), 当以质粒 DNA为标准时外
源与内源基因的线性相关系数为 0.9947、0.9970, 扩增效
率分别为 94.152%、100.711%; 以基因组 DNA 为标准时
外源与内源基因的线性相关系数均为 0.9994、0.9987, 扩
增效率分别为 93.39%、91.986%。由图可看出以质粒 DNA
和基因组 DNA为标准时产生的外源基因的两条标准曲线
一致性较好(图 5-A), 内标基因的两条标准曲线的一致性
也较好(图 5-B)。斜率和线性相关系数(R2)的 t检验结果(表
2)也证明了质粒 DNA 和基因组 DNA 两个标准所产生的
外源和内源基因的标准曲线符合性较好。
2.2.2 Cf 值的确定 由于不同 PCR 反应的扩增效率不
同或者外源基因和内标基因的拷贝数不一致等 , 在转基
因混合样品定量检测时需要确定 Cf [11,22-23]。phyA2 质粒
分子的 Cf 值为 1.18 (表 3), 由于 phyA2 基因和内标基因
zSSIIb在转植酸酶基因玉米中均为单拷贝, 理论上根据质
粒分子标准曲线得到的转植酸酶基因玉米标准品中
phyA2基因和 zSSIIb基因拷贝数应一致(Cf值为 1.0), 但结
果显示两者并不完全相等, 这有可能是质粒 DNA 和基因
组 DNA大小不同导致的 PCR扩增效率差异所致。


图 5 外源(A)和内源(B)基因标准曲线图(分别以 pPZ质粒 DNA和转植酸酶基因玉米基因组 DNA为标准)
Fig. 5 Standard curves for phytase transgenic maize (A) and zSSIIb (B) (pPZ DNA and phytase transgenic maize DNA as standard,
respectively)
第 8期 张广远等: 转植酸酶基因玉米 phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用 1505


表 2 外源和内源基因标准曲线的斜率和线性相关系数(分别以质粒 DNA和基因组 DNA为标准)
Table 2 The slop and linearity of standard curves for phyA2 and endogenous gene (plasmid DNA and genomic DNA as standard
respectively)
目标序列
Target gene
n 斜率
Slop (K)
P 线性相关系数
Linearity (R2)
P
phyA2 3
–3.4694①
–3.4909②
0.107
0.9947①
0.9994② 0.098
zSSIIb 3
–3.3049①
–3.5338②
0.054
0.9970①
0.9987②
0.066
① 以质粒 DNA为标准曲线测定结果; ② 以基因组 DNA为标准曲线测定结果。结果进行 t检验, α=0.05。
① Result from plasmid DNA as standard; ② Result from genomic DNA as standard. t-test, α=0.05.

表 3 转植酸酶基因玉米实时荧光 PCR Cf值
Table 3 Test of Cf by real-time PCR using phytase transgenic maize genomic DNA
基因组 DNA模板量
Quantity of genomic DNA
(ng)
外源基因拷贝数
Number of phyA2
copies
内标基因拷贝数
Number of zSSIIb copies
Cf 平均值
Mean Cf
SD RSD
0.1 97.71 102.54 0.95
0.5 566.45 698.82 0.81
2.5 3985.26 3173.21 1.26
5.0 7633.67 6988.91 1.09
25.0 24116.89 17007.23 1.42
150.0 128552.83 84360.52 1.52
1.18 0.27 22.9
SD为标准偏差; RSD为相对标准偏差。SD: standard deviation; RSD: relative standard deviation.

2.2.3 转植酸酶基因玉米混合样品的定量分析 分别
以质粒分子 pPZ 和转植酸酶基因玉米标准品为对象建立
标准曲线 , 对植酸酶玉米含量为 3.0%、1.0%、0.5%和
0.1%的混合玉米样品进行定量检测。定义平均值和百分
偏差为准确度 , 标准偏差 (standard deviation, SD)和相
对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为精确度。
4 个混合样品以质粒 DNA 为标准曲线时百分偏差在
17%以内, 相对标准偏差在 12%以内; 当以基因组 DNA
为标准曲线时百分偏差在 20%以内 , 相对标准偏差
在 15%以内 , 符合欧盟转基因检测要求 [24]。对两组检
测结果进行 t检验分析发现, 4个样品的定量值在 95%的
置信区间无显著差异(表 4)。这些结果表明本研究构建的
质粒分子能够代替转植酸酶基因玉米对转基因玉米进行
检测。
3 讨论
基体标准物质用作定量检测的标准虽然具有基体效
应等优点, 但也存在不易获得、价格昂贵、使用不方便等
缺点, 而通过构建转基因质粒阳性分子可以很好地解决
这些问题。近年来 , 一些转基因玉米品系如 Bt11[ 9]、
NK603 [11-12]的质粒分子的构建工作已相继完成, 实验证
明质粒分子是一种较好的转基因基体物质替代品。本文针
对转植酸酶基因玉米中 phyA2基因设计引物与探针, 并克
隆 phyA2 基因片段和 zSSIIb 基因片段得到阳性质粒分子
pPZ。在定性应用中质粒分子 pPZ的 LOD达到 10个拷贝,
灵敏度较高 ; 在定量检测应用中 , 通过对比质粒 pPZ
DNA 和植酸酶玉米基因组 DNA 产生的标准曲线的斜率
和线性相关系数, 结果证明 2个标准产生的内源与外源

表 4 分别以质粒 DNA和基因组 DNA为标准测定转基因样品的转基因成分含量
Table 4 Practical samples analyses using pPZ DNA and phytase transgenic maize genomic DNA as the calibrators (Cf=1.18, n=3)
质粒 DNA Plasmid DNA 基因组 DNA Genuine genomic DNA 植酸酶玉米含量
Phytase content
(%)
平均值
Mean (%)
百分偏差
Bias (%)
SD RSD (%) 平均值
Mean (%)
百分偏差
Bias (%)
SD RSD (%)
P
3.0 3.12 4 0.106 3.4 3.17 5.6 0.203 6.4 0.21
1.0 1.06 6 0.089 8.4 1.03 3 0.077 7.5 0.42
0.5 0.54 8 0.061 11.3 0.47 6 0.049 10.4 0.07
0.1 0.12 17 0.013 11.1 0.12 20 0.018 14.8 0.19
分别以质粒 DNA和基因组 DNA为标准曲线测定结果。结果进行 t检验, α=0.05。SD为标准偏差; RSD为相对标准偏差。
Result from plasmid DNA and genomic DNA as standard, respectively. t-test, α=0.05. SD: standard deviation; RSD: relative standard
deviation.
1506 作 物 学 报 第 39卷

基因标准曲线符合性较好; 通过计算质粒 DNA 的 Cf 值,
以构建好的质粒分子 pPZ DNA和植酸酶玉米基因组DNA
为标准对实际样品定值检测 , 结果为 3.12%、1.06%、
0.54%、0.117% (以质粒分子为标准)和 3.17%、1.03%、
0.47%、0.120% (以基因组 DNA 为标准), 百分偏差均在
20%以内, T 检验分析两者无显著差异, 充分证明所构建
的质粒分子具有较好的稳定性和可靠性 , 可以作为转植
酸酶基因玉米标准品的替代品应用于转基因成分检测。
于彩虹等[7]曾根据植酸酶玉米中 phyA2 基因设计引
物并建立了 SYBR Green I 实时荧光 PCR 定量方法, 但
SYBR Green I 法特异性不强, 其对转植酸酶基因玉米成
分含量为 0.1%的样品检测结果与理论值的差别达到了
41.17%, 准确度较低。本研究建立的 Taqman 探针实时荧
光定量 PCR 方法对转植酸酶基因玉米样品的定值结果较
为准确(百分偏差小于 20%, 相对标准偏差小于 15%), 更
适合作为转植酸酶基因玉米的定量检测方法。
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