全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(4): 639−647 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08012-009B)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 卢长明, E-mail: cmlu@oilcrops.cn, Tel: 027-86728186
第一作者联系方式: E-mail: lijuner126@126.com, Tel: 027-86728186
Received(收稿日期): 2011-09-14; Accepted(接受日期): 2011-12-19; Published online(网络出版日期): 2012-02-13.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120213.1105.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00639
植酸酶基因定性 PCR 检测方法及阳性质粒分子的构建
李 俊 1, 2 刘 信 3 曹应龙 2 武玉花 2 厉建萌 3 吴 刚 2
张 丽 2 卢长明 2,*
1 中南民族大学生命科学学院, 湖北武汉 430074; 2中国农业科学院油料作物研究所, 湖北武汉 430062; 3 农业部科技发展中心, 北京 100026
摘 要: 植酸酶基因在农业生产中具有很高的应用价值, 正被广泛用于农作物的基因工程研究。为了满足转植酸酶
基因作物安全监管的需要, 通过优化 PCR检测条件, 建立了植酸酶基因特异性定性 PCR检测方法。该方法具有良好
的扩增特异性和检测灵敏度, 可以满足我国植酸酶转基因作物监管需要。此外, 我们将 6种主要农作物(小麦、水稻、
棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因和植酸酶基因克隆到同一载体上, 构建成了阳性质粒分子 pBS Endogenous-
phytase。该质粒分子适用于这 6 种作物中植酸酶基因的筛查检测。本研究为转植酸酶基因作物的安全监管提供了阳
性材料和检测方法。
关键词: 转基因检测; 植酸酶基因; 定性 PCR; 阳性质粒分子
Establishment of Phytase-Specific Qualitative PCR Detection Method and
Construction of a Positive Plasmid Molecule
LI Jun1,2, LIU Xin3, CAO Ying-Long2, WU Yu-Hua2, LI Jian-Meng3, WU Gang2, ZHANG Li2, and LU
Chang-Ming2,*
1 School of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China; 2 Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of
Agriculture Sciences, Wuhan 430062, China; 3 Development Center of Science and Technology, Ministry of Agriculture, Beijing 100026 China
Abstract: Phytase gene is valuably applicated in agricultural production, especially in genetic engineering of crops. In order to
meet the requirements of safety regulation of transgenic crops, the gene-specific qualitative PCR detection method targeting the
fungal-originated phytase gene was developed. A primer pair Phytase-F5/R5 yielding a 389 bp amplicon was selected from 11
primer pairs, then the PCR reaction system was optimized by improving Mg2+ concentration, primer concentration and primer
anneal temperature. Twenty transgenic and nontransgenic lines from different crops were used as templates in PCR, showing that
the PCR method had good amplification specificity. The results of sensitivity testing indicated that the phytase amplicon was still
observed when the template concentration was down to 0.05%, which reaches the national standards for GMO (Genetically Modi-
fied Organism) detection method. In addition, we cointegrated the phytase gene and the endogenous reference genes from six
major crops of wheat, rice, cotton, soybeans, corn, and rapeseed into a vector, yielding a positive plasmid molecule pBS Endoge-
nous-phytase. The positive plasmid molecule was suitable for screening phytase gene in the six crops about wheat, soybeans, corn,
cotton, rice, and rape. This study provides positive materials and detection method for safety regulation of genetically modified
crops carrying phytase gene.
Keywords: GMO detection; Phytase gene; Qualitative PCR; Positive plasmid molecule
从 1996 年第一个转基因作物被批准商品化种
植后, 转基因作物的商业化迅速发展。目前, 在全世
界范围内, 已经有 24 种作物涉及 184 个转化体在 29
个不同的国家和地区获准种植或用作加工原料[1]。为
了加强转基因生物安全管理, 我国自 2001年起相继
颁发了一系列法律法规和管理办法[2], 如《转基因生
物安全管理条例》和《农业转基因生物标识管理办
法》等, 而转基因生物的安全监管和标识管理均依
赖于精确的转基因产品检测技术。
目前, 用于转基因产品检测的技术主要有两大
640 作 物 学 报 第 38卷

类, 一类是基于核酸的检测方法, 如 PCR、Southern
杂交等; 另一类是基于外源蛋白质的检测方法, 如
ELISA、侧向流动免疫试纸条等[3]。PCR技术是目前
应用最广的检测技术。根据检测靶序列不同, PCR检
测策略分为筛查、基因特异性、构建特异性和转化
体特异性检测 4 类[4-6]。其中, 基因特异性检测方法
以目的基因作为检测靶标, 通常用于转基因产品的
筛查检测, 如 bar 基因、nptII 基因、Cp4-EPSPS 基
因等都已建立 PCR特异性检测方法[7]。
植酸酶 (phytase)又称肌醇六磷酸水解酶 (myo-
inositol hexakisphosphate phosphohydrolases), 能将
植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸[8]。植物的根系若
能分泌植酸酶, 可有效提高植物根系对土壤中磷酸
盐的利用率。将植酸酶添加到饲料中, 可将饲料中
的植酸转换成动物可利用的磷酸, 同时解除植酸的
抗营养作用, 提高饲料中有机磷的利用率, 对提高
畜牧养殖业效益具有重要的意义[9-11]。但是, 饲料中
添加植酸酶会大大提高饲料的生产成本。张琪等[12]
从黑曲霉中克隆植酸酶基因, 通过粒子轰击法转到
“Hi-II”玉米自交系中 , 培育出转植酸酶基因玉米
BVLA430101 品系。转基因玉米 BVLA430101 能够
更高效地利用土壤中的植酸磷, 用 BVLA430101 生
产饲料, 可有效提高饲料中植酸酶的含量, 降低饲
料的生产成本[13]。转植酸酶基因玉米 BVLA430101
经过 11 年环境和食用安全评价, 于 2009 年 8 月 17
日获得了农业部颁发的生产应用安全证书 (http://
www.stee.agri.gov.cn/biosafety/)。植酸酶基因具有极
高的应用价值, 目前已应用到玉米、大豆及棉花的
转基因研究中[14], 预计将来会应用到更多的转基因
作物中。
检测方法是实施转基因产品安全管理的必要手
段。目前, 已经建立了植酸酶玉米 BVLA430101 的
转化体特异性和构建特异性检测方法, 但是不能满
足监管过程中对其他作物的筛查检测。本研究拟针
对真菌来源的植酸酶基因建立植酸酶基因特异性
PCR检测方法, 用于植酸酶基因的筛查检测。
在应用 PCR方法检测转基因样品时, 通常需要
阳性材料作为质控对照。然而, 典型的阳性材料经
常难以获取, 而有证标准物质由于生产工艺复杂、
价格昂贵等问题, 已成为检测方法建立和应用的瓶
颈[15]。为了解决这一难题, 众多机构都在研究用阳
性质粒分子替代基体标准物质。现在转基因作物阳
性质粒分子作为转基因检测标准物质已在日本和欧
盟等国家应用。已报道的阳性质粒标准分子有
GTS40-3-2、 MON1445、 MON531、 MON810、
MON863、NK603、Bt11和 TT51-1等[16-17]。由于阳
性质粒分子花费小、周期短、生产量大、稳定性高,
被誉为“黄金标准物质”[15,18-20]。应用阳性质粒分子可
以有效解决检测工作中有证标准物质和阳性材料缺
乏的难题。
转基因玉米BVLA430101虽然已获得安全证书,
但并未正式商业化生产, 检测机构常因得不到阳性
材料而影响检测工作的开展。本研究将植酸酶基因
的全长基因组序列和 6种主要农作物(小麦、水稻、
棉花、大豆、玉米和油菜)的内标准基因构建成主要
作物筛查用阳性质粒分子, 为主要农作物中植酸酶
基因的筛查检测提供通用的阳性质控对照。
1 材料与方法
1.1 材料
转植酸酶基因玉米 BVLA430101由农业部科技
发展中心提供。转基因玉米 BT11、BT176、MIR604、
T25、MON863、MON810、MON88017、NK603、
GA21、TC1507, 非转基因玉米综 31、苏玉糯 1号、
苏玉糯 2号、超甜玉米 2018; 转基因水稻科丰 6号、
克螟稻、BT63, 非转基因水稻两优培九、汕优 63; 转
基因大豆 GTS40-3-2、A2704-12, 非转基因大豆中豆
36、中豆 29; 转基因油菜 T45、Topas19/2, 非转基
因油菜中双 9 号、中油 821 由本研究室保存; 转基
因棉花MON531、MON1445, 非转基因棉花中棉 19、
中棉 21; 转基因小麦 N12-1, 非转基因小麦周麦 17、
扬麦 13、鄂 35264、济麦 22由湖北省农业科学院提供。
1.2 总 DNA提取
采用 TaKaRa DNA Extraction Kit for GMO De-
tection Ver. 2.0 试剂盒提取样品的基因组 DNA, 用
荧光光度计 Versafluor Fluorometer (Bio-Rad, USA)
检测 DNA纯度和浓度。
1.3 PCR反应体系和反应条件
根据真菌来源植酸酶基因的核苷酸序列(Gen-
Bank登录号为 HQ233651.1), 用 Primer Premier 5.0
软件设计植酸酶基因定性 PCR检测的 5条正、反向
引物(表 1)。以转植酸酶基因玉米 BVLA430101基因
组为模板, 用引物组合, 进行 PCR 扩增, 筛选扩增
条带最亮、重现性最好的引物组合。PCR 反应体系
为 40 ng BVLA430101 DNA 1.0 μL, 10 × PCR buffer
2.0 μL, 25.0 mmol L−1 MgCl2 2.0 μL, 10 mmol L−1
dNTPs 0.4 μL, 10 μmol L−1 primer 0.2 μL, 1 U
μL−1Taq DNA聚合酶 0.5 μL, 加 ddH2O至总反应体
第 4期 李 俊等: 植酸酶基因定性 PCR检测方法及阳性质粒分子的构建 641


表 1 引物及碱基组成
Table 1 List of primer sequences
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence (5′–3′)
Phytase-F1 GCCAGCACATCCAACAACA
Phytase-F2 CGTTCGTCCCTTCCATTCG
Phytase-F3 CAGTCCCTGAACAAATACTACGG
Phytase-F4 CCCTGAACAAATACTACGGC
Phytase-F5 GTCTCACCCACTCGCCTGTC
Phytase-R1 CATTCTTCATGGGTGAACAGG
Phytase-R2 ACAGGCGAGTGGGTGAGACG
Phytase-R3 CATCGGTCTGGGTGATATTCT
Phytase-R4 AACCAAGACACGGACCAAA
Phytase-R5 AAAGCTCAAACCCTTCACG

系 20 μL。反应条件为 94℃变性 5 min; 94℃变性 30 s,
58℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 共进行 35 次循环;
72℃延伸 7 min。用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
筛选出最佳扩增引物组合后 , 设置不同的 Mg2+浓
度、引物浓度、退火温度梯度优化反应体系, 确定
最佳反应体系和反应条件。
PCR反应体系中, Mg2+浓度尤为重要, 直接影响引
物的扩增特异性, 以及酶的催化能力的准确性[21]。本
研究设置 0、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00和 3.50 mmol
L−1 7个Mg2+浓度梯度进行 PCR分析。
PCR反应体系中最佳 Mg2+浓度确定以后, 再对
PCR反应体系中引物的终浓度进行优化。设置 0.10、
0.15、0.20、0.25、0.50和 1.00 µmol L−1 6个浓度梯
度进行 PCR分析。
在 PCR 反应条件中以退火温度最为重要, 在
Tm 值允许的范围内, 适当提高反应的退火温度可
使 PCR产物的特异性增强[21]。根据引物设计时设置
的 Tm值范围, 共设计了 52、54、56、58、60和 62 ℃
6个退火温度, 进行 PCR分析。
1.4 构建阳性质粒分子
依据颁布的国家标准, 将小麦、水稻、棉花、
大豆、玉米和油菜内标准基因的检测序列拼接到一
起, 形成一段长 977 bp 的序列, 委托上海生工生物
工程有限公司合成全基因, 并且在合成序列的两端
分别加一个 Sac I的酶切位点。利用 Sac I酶切, 将
合成的 6 种作物内标基因的检测序列克隆到 pBS
inter 载体上。在植酸酶基因编码序列的两侧设计引
物 PhytaseFLF/LR, 克隆植酸酶基因的全长序列。
PCR反应体系同上, PCR反应条件为 94℃变性 5 min;
94℃变性 30 s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 90 s, 共进行
35次循环; 72℃延伸 7 min。将克隆的植酸酶基因的
全长序列通过平端酶 EcoR V 酶切的方法连接到克
隆有 6 种物内标基因的质粒上。将构建好的阳性质
粒送北京擎科新业生物技术有限公司测序验证。
1.5 阳性质粒分子的应用
委托上海生物工程有限公司合成我国转基因检
测国家标准中 6 种作物内标准基因的检测引物(表
2)。以构建好的阳性质粒分子作为阳性对照, 利用内
标准基因的扩增引物和植酸酶基因特异性检测引物,
对小麦(周麦 17、扬麦 13、鄂 35264、济麦 22)、水
稻(科丰 6 号、克螟稻、两优培九、汕优 63)、棉花
(MON531、MON1445、中棉 19、中棉 21)、大豆
(A2704-12、GTS40-3-2、中豆 36、中豆 29)、玉米
(MON863、BVLA430101、苏玉糯 1 号、苏玉糯 2
号)和油菜(T45、Topas19/2、中双 9号、中油 821) 6
种作物 24个品种进行筛查检测，考察阳性质粒分子
在检测中的适用性。
2 结果与分析
2.1 植酸酶基因检测体系的建立
为获得合适的植酸酶基因检测方法, 分别合成
了植酸酶基因上游引物和下游引物各 5条(表 1)进行
引物组合筛选。以转植酸酶基因玉米 BVLA430101
基因组为模板, 以 PCR产物大小在 100~400 bp的 11
个引物组合同时进行 PCR扩增, 每个反应设置 2 个
重复。结果显示(图 1), 11个引物组合均已扩增出目
的条带, 其中 Phytase-F1/R2、Phytase-F3/R2、Phy-
tase-F4/R2 和 Phytase-F5/R5 扩增效果较好。但考虑
到 Phytase-F3/R2、Phytase-F4/R2扩增片段较小易与
引物二聚体混淆, Phytase-F1/R2 引物对扩增的引物
二聚体较多, 最终选取重现性最好、扩增条带最亮、
引物二聚体最少的引物组合 Phytase-F5/R5作进一步
验证和优化。最佳引物组合在植酸酶基因序列中的
位置如图 2所示。
为获得 Phytase-F5/R5 引物对最优的反应条件,
分别对 Mg2+浓度、引物浓度和退火温度进行比较优
化。当 Mg2+浓度低于 1.50 mmol L−1时, 没有预期片
段的扩增, 高于 1.50 mmol L−1时, 均有目的片段扩
增, 但在 3.00 mmol L−1时, 效果最佳(图 3-A)。6个
引物浓度梯度均能扩增出预期目的片段, 当终浓度
为 0.15 µmol L−1时扩增效果最好(图 3-B)。在 52、
54、56、58、60、62 6℃ 个退火温度下进行 PCR分
析, 均有预期片段的扩增(图3-C), 以 58℃时 PCR反
应效果最佳。
642 作 物 学 报 第 38卷

表 2 引物序列信息
Table 2 Sequence information of primers
目标
Purpose
引物名称
Primer name
引物序列
Sequence (5′–3′)
扩增对象
Amplification target
产物长度
Amplicons size (bp)
WAXD+854 CTATTGGTTCTCCGTGTTTG
WAXD-1034 TCCATTGCGAAACGGTGA
小麦内标准基因[22]
waxy-D1
181
SPS-F1 TTGCGCCTGAACGGATAT
SPS-R1 GGAGAAGCACTGGACGAGG
水稻内标准基因[23]
SPS
277
Sad1-F CCAAAGGAGGTGCCTGTTCA
Sad1-R TTGAGGTGAGTCAGAATGTTGTTC
棉花内标准基因[24]
Sad1
107
lec-F GCCCTCTACTCCACCCCCATCC
lec-R GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG
大豆内标准基因[25]
Lectin
118
zSSIIb-F CGGTGGATGCTAAGGCTGATG
zSSIIb-R AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC
玉米内标准基因[26]
zSSIIb
88
hmg-F TCCTTCCGTTTCCTCGCC
内标基因检测
Detection of endogenous
gene
hmg-R TTCCACGCCCTCTCCGCT
油菜内标准基因[27]
HMG I/Y
206
PhytaseFLF ATGCTGGCAGTCCCCGCCTC 阳性质粒分子构建
Construction of positive
plasmid molecule PhytaseFLR CTAAGCAAAACACTCCACCCAATCA
植酸酶基因全长
Phytase gene
1350
Phytase-F5 GTCTCACCCACTCGCCTGTC 植酸酶基因检测
Detection of phytase gene Phytase-R5 AAAGCTCAAACCCTTCACG
植酸酶基因的一段
Part of Phytase gene
389



图 1 植酸酶基因引物筛选
Fig. 1 Screening of the primer sets suitable for detecting the phytase gene
M: 1 kb DNA marker (TaKaRa); 1–2: Phytase-F1/R1; 3–4: Phytase-F1/R2; 5–6: Phytase-F2/R1; 7–8: Phytase-F2/R2; 9–10: Phytase-F3/R2;
11–12: Phytase-F3/R3; 13–14: Phytase-F4/R2; 15–16: Phytase-F4/R3; 17–18: Phytase-F5/R3; 19–20: Phytase-F5/R4; 21–22: Phytase-F5/R5.



图 2 植酸酶基因定性 PCR 引物位置图
Fig. 2 Schematic diagram of the location of the optimal primer set of phytase gene
箭头代表最佳引物的设计位置和方向。
Arrows show the location and orientation of the optimal primers.

根据 PCR反应体系和反应程序的优化结果, 确
定植酸酶基因特异性检测的 PCR 反应体系为为 40
ng BVLA430101 DNA 1 μL, 10 × PCR buffer 2.0 μL,
25.0 mmol L−1 MgCl2 2.4 μL, 10 mmol L−1 dNTPs 0.4
μL, 10 μmol L−1 primer 0.3 μL, 1 U μL−1 Taq DNA聚
合酶 0.5 μL, 加 ddH2O至总反应体系 20 μL。反应条
件为 94℃变性 5 min; 94℃变性 30 s, 58℃退火 30 s,
72℃延伸 30 s, 共进行 35次循环; 72℃延伸 7 min。
2.2 检测体系的验证
2.2.1 特异性检测 采用优化的 PCR 反应体系,
以 BVLA430101、BT11、BT176、MIR604、T25、
MON863、MON810、MON88017、NK603、GA21
和 TC1507共 11个转基因玉米; 综 31、苏玉糯 1号、
苏玉糯 2 号和超甜玉米共 4 个非转基因玉米; 转基
第 4期 李 俊等: 植酸酶基因定性 PCR检测方法及阳性质粒分子的构建 643




图 3 植酸酶基因检测体系的优化
Fig. 3 Optimization of phytase gene detection system
A: Mg2+浓度的优化, M: marker DL1000 (TaKaRa)); 1~7: Mg2+浓度分别为 0、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00和 3.50 mmol L−1; B: 引物
浓度的优化, M: marker DL1000 (TaKaRa)); 1~6: 引物浓度分别为 0.10、0.15、0.20、0.25、0.50和 1.00 µmol L−1; C: 退火温度的优化,
M: marker DL1000(TaKaRa); 1~6: Tm分别为 52、54、56、58、60和 62℃。
A: Optimization of Mg2+ concentration, M: marker DL1000 (TaKaRa); 1–7: Mg2+ concentration correspond to 0, 1.00, 1.50, 2.00, 2.50, 3.00,
and 3.50 mmol L−1, respectively. B: Optimization of primer concentration, M: marker DL1000 (TaKaRa); 1–6: Primer concentration corre-
spond to 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.50, and 1.00 μmol L−1, respectively. C: Optimization of Tm temperature, M: marker DL1000 (TaKaRa); 1–4: Tm
correspond to 52 , 54 , 56 , 58 , 60℃ ℃ ℃ ℃ ℃, and 62 , respectively.℃


因水稻 BT63、转基因大豆 GTS40-3-2、转基因油菜
T45、转基因棉花 MON531 和转基因小麦共 5 个非
玉米品种为模板进行 PCR 扩增, 考察植酸酶基因
PCR 反应体系的检测特异性。扩增结果表明, 仅从
转植酸酶基因玉米 BVLA430101 样品中扩增出预期
的目的片段, 而在其他样品中均没有预期目的片段
(图 4), 表明该 PCR反应体系具有良好的扩增特异性。
2.2.2 灵敏度检测 将转植酸酶基因玉米 BVLA-
430101 的 DNA 和非转基因玉米 DNA 按不同比例
(W/W)混合, 转植酸酶基因玉米 BVLA430101 DNA
含量分别为 100.00%、10.00%、5.00%、1.00%、0.50%、
0.10%、0.05%、0.01%和 0.00%。用浓度梯度稀释的
转植酸酶基因玉米 BVLA430101 DNA做模板, 进行
PCR扩增, 检测植酸酶基因特异性 PCR检测方法的
检测灵敏度。对 PCR 产物进行凝胶电泳发现, 当转
植酸酶基因玉米 BVLA430101 DNA含量大于 0.10%
时, 均有预期的目的条带的扩增, 当转植酸酶基因
玉米 BVLA430101 DNA含量为 0.05%时, 目的条带
变得模糊, 当其 DNA浓度低于 0.01%时, 没有目标条
带的出现 (图 5), 表明植酸酶基因特异检测引物
Phytase-F5/R5的检测灵敏度能够达到 0.10%。
2.3 阳性质粒分子的构建
将小麦内标基因 waxy-D1、水稻内标基因 SPS、
棉花内标基因 Sad1、大豆内标准基因 Lectin、玉米
内标基因 zSSIIb和油菜内标基因 HMG I/Y的检测序
列拼接人工合成一个大的融合序列(图 6-A)。将该序
列通过 Sac I酶切连接到 pBS inter载体上, 筛选出阳
性克隆 pBS Endogenous。然后从转植酸酶基因玉米
BVLA430101 基因组 DNA 中克隆植酸酶基因全长
1350 bp 的序列(图 6-B), 用 EcoR V 酶切阳性质粒
pBS Endogenous, 采用平端连接的方法将植酸酶基
因序列克隆到质粒 pBS Endogenous中, 筛选出植酸
酶筛查用阳性质粒分子 pBS Endogenous-phytase (图
6-C)。对阳性质粒上插入的外源序列测序验证, 发现
6 大作物内标基因的融合序列及植酸酶基因序列均
准确插入载体中。
2.4 阳性质粒分子的应用
用试剂盒提取阳性质粒 pBS Endogenous-phy-
tase, 测定浓度后, 用 0.1×TE缓冲液或 75 ng μL−1鲑
鱼精子 DNA将阳性质粒梯度稀释至 106、105、104、
103、102、10 和 1拷贝 μL−1。以阳性质粒分子梯度
稀释液为模板, 利用 Phytase-F5/R5 引物进行定性
PCR验证, 转植酸酶基因玉米 BVLA-430101中提取
的基因组 DNA 为阳性对照, 综 31 中提取的基因组
DNA 为阴性对照 , 考察阳性质粒分子的检测灵敏
度。验证结果如图 7所示, 在阳性质粒分子 pBS En-
dogenous-phytase 的浓度为 10 拷贝 μL−1和大于 10
拷贝 μL−1 的样品中均能稳定扩增出植酸酶基因的
特异序列 , 表明阳性质粒分子 pBS Endogenous-
phytase 的定性 PCR 检测灵敏度可达 10 拷贝, 在实
际检测工作中, 若采用质粒 pBS Endogenous-phytase
作为阳性质控对照, 模板量应大于 10拷贝。
以阳性质粒分子作为阳性对照, 利用 6 种作物
内标准基因的检测引物和植酸酶基因检测引物分别
对小麦、水稻、棉花、大豆、玉米、油菜 6 种作物
进行筛查检测。凝胶电泳发现 , 阳性质粒 p B S
Endogenous-phytase上 6种作物的内标基因均可稳定
扩增, 其扩增条带与 6种作物基体基因组 DNA的扩
增条带相同, 因此, 本研究构建的质粒分子 pBS En-
dogenous-phytase 可以替代 6 种作物的基体基因组
DNA, 作为内标基因定性 PCR检测中的阳性质控对
照; 植酸酶基因检测引物仅在质粒分子和转植酸酶
基因玉米 BVLA430101 中扩增出预期产物, 其他样
品无扩增产物(图 8), 表明该质粒分子在植酸酶基
644 作 物 学 报 第 38卷



图 4 植酸酶基因特异性定性 PCR 检测
Fig. 4 Specificity testing of phytase-specific qualitative PCR method
M: marker DL1000 (TaKaRa); 1~21: BVLA430101、BT11、BT176、MIR604、T25、MON863、MON810、MON88017、NK603、GA21、
TC1507、综 31、苏玉糯 1号、苏玉糯 2号、超甜玉米 2018、BT63、GTS40-3-2、T45、MON531、N12-1、H2O。
M: marker DL1000 (TaKaRa); 1–21: Correspond to BVLA430101, BT11, BT176, MIR604, T25, MON863, MON810, MON88017, NK603,
GA21, TC1507, Zong 31, Suyunuo 1, Suyunuo 2, Chaotianyumi 2018, BT63, GTS40-3-2, T45, MON531, N12-1, and H2O, respectively.



图 5 植酸酶基因特异性检测方法灵敏度检测
Fig. 5 Sensitivity testing of phytase-specific detection methods
M: marker DL1000 (TaKaRa); 1~2: 转基因 DNA含量为 100%; 3~4: 转基因 DNA含量为 10%; 5~6: 转基因 DNA含量为 5%; 7~8: 转基
因 DNA含量为 1%; 9~10: 转基因 DNA含量为 0.5%; 11~12: 转基因 DNA含量为 0.1%; 13~14: 转基因 DNA含量为 0.05%; 15~16: 转
基因 DNA含量为 0.01%; 17~18: 转基因 DNA含量为 0。
M: marker DL1000 (TaKaRa); 1–2: GMO content 100%; 3–4: GMO content 10%; 5–6: GMO content 5%; 7–8: GMO content 1%; 9–10:
GMO content 0.5%; 11–12: GMO content 0.1%; 13–14: GMO content 0.05%; 15–16: GMO content 0.01%; 17–18: GMO content 0.



图 6 阳性质粒分子 pBS Endogenous-phytase 构建图
Fig. 6 Construction of the positive plasmid molecule pBS Endogenous-phytase
A: 酶切 6个内标基因融合片段(977 bp); B: 植酸酶基因扩增(1 350 bp); C: 阳性质粒图谱 pBS Endogenous-phytase。
A: Digestion of the fusion sequence of six endogenous genes (977 bp); B: Amplification of the phytase gene (1 350 bp); C: Map of the
constructed positive plasmid molecule pBS Endogenous-phytase.

因的筛查检测中具有良好的适用性, 可替代 6 种作
物水稻、棉花、大豆、玉米、油菜和小麦的转植酸
酶基因材料, 作为 6 种作物中植酸酶基因筛查检测
的阳性对照。
3 讨论
Su等[28]以转植酸酶基因玉米 BVLA430101为研
究对象, 以外源基因插入片段的信号肽与植酸酶基
因的连接处为检测靶标, 并以 zSSIIb 为内标准基因,
为转植酸酶基因玉米的检测提供了构建特异性检测
方法。Su 等的方法只适合于用转植酸酶基因玉米
BVLA430101 相同转化载体获得的转基因产品的检
测, 但不能用于植酸酶基因的特异性检测, 不能对
非法释放的其他转植酸酶玉米、水稻、棉花、大豆
和油菜等作物进行安全监管。
本研究以真菌来源的植酸酶基因为研究对象 ,
第 4期 李 俊等: 植酸酶基因定性 PCR检测方法及阳性质粒分子的构建 645




图 7 阳性质粒分子定性 PCR 检测灵敏度
Fig. 7 Sensitivity testing of qualitative PCR of the positive plasmid
M: marker 1kb (TaKaRa); 1~2: 空白对照; 3~4: 阴性对照; 5~6: 阳性对照; 7~8: 106 拷贝; 9~10: 105拷贝; 11~12: 104 拷贝; 13~14: 103 拷
贝; 15~16: 102 拷贝; 17~18: 10 拷贝; 19~20: 1拷贝。
M: marker 1 kb (TaKaRa); 1–2: Blank control; 3–4: Negative control; 5–6: Positive control; 7–8: 106 copy; 9–10: 105 copy; 11–12: 104 copy;
13–14: 103 copy; 15–16: 102 copy; 17–18: 10 copy; 19–20: 1 copy.



图 8 阳性质粒分子的适用性检测
Fig. 8 Applicability testing of the plasmid molecule used as positive control
M: marker DL1000 (TaKaRa); 1~6: pBS Endogenous-phytase、周麦 17、扬麦 13、鄂 35264、济麦 22、空白对照, 检测小麦内标基因 waxy-D1;
7~12: pBS Endogenous-phytase、科丰 6号、克螟稻、两优培九、汕优 63、空白对照, 检测水稻内标基因 SPS; 13~18: pBS Endoge-
nous-phytase、MON531、MON1445、中棉 19、中棉 21、空白对照, 检测棉花内标基因 Sad1; 19~24: pBS Endogenous-phytase、A2704-12、
GTS40-3-2、中豆 36、中豆 29、空白对照, 检测大豆内标基因 Lectin; 25~30: pBS Endogenous-phytase、T45、Topas19/2、中双 9号、
中油 821、空白对照, 检测油菜内标基因 HMG I/Y; 31~36: pBS Endogenous-phytase、MON863、BVLA430101、苏玉糯 1号、苏玉糯 2
号、空白对照, 检测玉米内标基因 zSSIIb; 37~42: pBS Endogenous-phytase、MON863、BVLA430101、苏玉糯 1号、苏玉糯 2号、空
白对照, 检测植酸酶基因 Phytase gene。
M: marker DL1000 (TaKaRa); 1–6 correspond to pBS Endogenous-phytase, Zhoumai 17, Yangmai 13, E35264, Jimai 22, and blank control
for wheat reference gene waxy-D1 detection; 7–12 correspond to pBS Endogenous-phytase, Kefeng6, Kemingdao, Liangyoupeijiu, Shanyou
63 and bank control for detecting rice reference gene SPS ; 13–18 correspond to pBS Endogenous-phytase, MON531, MON1445, Zhongmian
19, Zhongmian 21 and blank control for detecting cotton reference gene Sad1; 19–24 correspond to pBS Endogenous-phytase, A2704-12,
GTS40-3-2, Zhongdou 36, Zhongdou 29, and blank control for detecting soybean reference gene Lectin; 25–30 correspond to pBS Endoge-
nous-phytase, T45, Topas19/2, Zhongshuang 9, Zhongyou 821, and blank control for detecting rapeseed reference gene HMG I/Y; 31–36
correspond to pBS Endogenous-phytase, MON863, BVLA430101, Suyunuo 1, Suyunuo 2, and blank control for detecting maize reference
gene zSSIIb ; 37–42 correspond to pBS Endogenous-phytase, MON863, BVLA430101, Suyunuo 1, Suyunuo 2, and blank control for Phytase
gene detection.

建立了该基因的特异性检测方法, 该方法适合于含
有该植酸酶基因的转基因产品检测。可检测范围除
转植酸酶基因玉米 BVLA430101 外, 还包括小麦、
大豆、棉花、水稻、油菜等其他包含该植酸酶基因
的转基因作物及其产品。以转植酸酶基因玉米
BVLA430101的基因组 DNA为靶标, 扩增出 389 bp
大小的条带, 与预期结果一致, 而用其他作物品系
(包括 11个转基因玉米、4个非转基因玉米、1个转
基因水稻、1个转基因大豆、1个转基因油菜、1个
转基因棉花、1个转基因小麦)为模板进行 PCR扩增
均显示出阴性, 表明该方法具有很强的特异性。灵
敏度测试表明, 将阳性样品稀释到 0.10%仍可获得
稳定和清晰的结果, 这可以满足我国转基因成分定
性检测对灵敏度的要求。
本研究首次建立了稳定可靠的植酸酶基因特异
性检测方法, 并构建了阳性质粒分子 pBS Endoge-
nous-phytase, 在一定程度上解决了植酸酶基因检测
阳性物质匮乏的难题。质粒分子 pBS Endogenous-
phytase可通用于小麦、大豆、玉米、棉花、水稻和
油菜 6 种作物中植酸酶基因的筛查检测, 具有更广
646 作 物 学 报 第 38卷

的适用性。它不但可以用于植酸酶基因检测, 还可
以替代这 6 种作物作为内标准基因的质量控制手
段。该检测方法和阳性质粒分子不仅可以用于检测
转植酸酶玉米 BVLA430101, 还可以对非法释放的
其他转植酸酶玉米、水稻、棉花、大豆和油菜等作
物进行安全监管。
4 结论
研制了真菌来源植酸酶基因特异性的检测方法;
构建了用于水稻、玉米、大豆、棉花、小麦和油菜
6 种作物植酸酶基因筛查的阳性质粒分子 pBS En-
dogenous-phytase, 为转植酸酶基因作物的检测提供
了阳性材料和检测方法, 满足我国转基因生物安全
监管的需要。
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