全 文 ：·综述与专论· 2012年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 : 2011-07-22
基金项目 : 国家科技重大专项课题（2008ZX08012003）, 国家科技支撑计划项目课题（2008BAK41B01）
作者简介 : 李亮 , 男 , 博士 , 助理研究员 , 研究方向 : 生物计量学 ;E-mail:liliangene@yahoo.com.cn
转基因定量检测用质粒分子标准物质研究进展
李亮1 王晶1 隋志伟1 臧超1 余笑波2
（1中国计量科学研究院，北京 100013 ；2中国计量学院生命科学学院，杭州 310018）
摘 要 : 近 10 年来，应用于转基因植物产品定量检测的质粒分子标准物质凭借其易于富集，快捷高效等优点，成为各国检
测机构的研究热点。对国内外转基因植物核酸定量检测用的质粒分子标准物质研究进展进行总结和评述，并且对该类标准物质在
研制过程中的问题进行分析，同时展望了该类标准物质的发展与应用。
关键词 : 质粒分子 标准物质 均匀性 稳定性 不确定度 核酸定量
Advances in Reference Plasmids for the Quantitative Detection of
Genetically Modified Crops
Li Liang1 Wang Jing1 Sui Zhiwei1 Zang Chao1 Yu Xiaobo2
（1National Institute of Metrology，Beijing 100013 ；2College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 310018）
Abstract: Last ten years, reference plasmids for the quantitative detection of genetically modified crops, produced in unlimited quantities
of consistent quality from E. coli, have become the focus of various nations’ testing institutions. In this paper, we summarized advances in
reference plasmids for the quantitative detection of genetically modified crops, analyzed the problems in current study, and looked pridicted the
development and application future.
Key words: Plasmids Certified reference materials Homogeneity Stability Uncertainty DNA quantification
随着转基因作物及相关产品在全世界范围内的
迅速发展，其环境安全和食用安全问题一直受到各
国政府和广大消费者及相关机构人员的重视。截至
2010 年底，全球已有 29 个国家获批种植转基因作物，
总面积达到 1.48 亿 hm2，获批的转基因作物达 23 种，
183 种转化体［1］。
对转基因作物核酸进行定量检测，并保证检测
的准确、可靠和有效性，需要计量标准的支撑。目
前已有多个国家对转基因检测标准方法和标准物质
进行了研究，而真正意义上具有溯源性的有证标
准物质（certified reference materials）却不多，较常
见的是参考标准或阳性对照物质。截至 2011 年 6
月，欧盟联合研究中心下属标准物质与测量研究所
（IRMM-CRL）、美国油料化学协会（AOCS）和西格
玛奥德里奇公司（SIGMA-ALDRICH CORP）公布的
转基因植物核酸类标准（参考）物质中仅涉及 50 余
种转化体。因此，转基因标准物质的研制和应用成
为国内外农业转基因生物安全管理体系建设的当务
之急，也是转基因检测监测的重要技术支撑之一。
转基因标准物质的缺乏已成为制约转基因植物检测
技术发展和检测机构建设的瓶颈问题之一。
生物标准物质，是一种或多种足够均匀并很好
确定了含量、序列、活性、结构或分型等生物测量
特性（量）值，用以校准仪器、评价生物测量方法
或给生物测量材料赋值的物质［2］。转基因标准物质
属于生物标准物质，目前主要集中于基体标物质和
质粒分子标准物质的研究。基体标准物质主要由原
始植物材料制成，而质粒分子标准物质由一种含有
外源基因片段和内标准基因片段的质粒分子制备而
成［3］。质粒分子具有易于富集，非农产品来源，可
以高效、快捷获得无限稳定量的优点，同时也解
决了难以获得阳性植物基因组 DNA 对检测所带来
2012年第2期 49李亮等 ：转基因定量检测用质粒分子标准物质研究进展
的问题［4］。而目前市场上仅有 4 种质粒分子标准
物质，分别用于检测 ：转基因玉米 MON810（ERM-
AD413［5］）、转基因玉米 NK603（ERM-AD415［6］）、转
基因大豆 356043（ERM-AD425［7］）和转基因玉米
98140（ERM-AD427［8］）质粒分子标准物质已经成
为解决转基因作物检测有效性的新途径之一。因此，
本研究是对照一级标准物质技术规范［9］对当前国内
外质粒分子标准物质和参考物质或阳性对照物质等
的研究进行了如下总结分析。
1 研究进展
1.1 质粒分子的制备
转基因核酸检测用质粒分子一般由 3 部分组成：
框架载体、（一个或多个）内标准基因和（一个或
多个）外源基因（图 1）。内标准基因（Endogenous
reference gene）是指具有植物物种专一性且拷贝数
恒定、不显示等位基因变化的保守 DNA 序列［10］。
外源基因（Exogenous gene）通常是指在生物体中原
来不存在的基因 , 或指生物体中已存在但不表达的
基因。转移了外源基因的生物体会因产生新的多肽
或蛋白质而出现新的生物学性状（表型）［11］。通过
同时对内标准基因和外源基因的扩增，将扩增结果
进行比较，从而达到定量检测目的。具体检测的体
系和反应条件依赖所选基因而定。
1.1.2 目的基因的选择 在 GenBank 中搜索或者查
阅已报道文献确定转化体内标准基因序列 ；通过
查阅转化体的相关资料，获得转化体特异性序列，
包括其外源插入基因在转基因作物中的具体插入
方式和拷贝数，并查阅外源基因中主要元件的序
列信息。
1.1.3 载体的构建 按照转基因检测的要求，内标
准基因片段和外源基因片段共同构建到框架载体
上。CRL 的转基因玉米 MON810 质粒分子标准物质
ERM-AD413 选用 hmg（170 bp）和 5 特异性旁侧序
列（351 bp）分别作为内标准基因和外源基因［8］。
Yang 等［13］构建了包括内标准基因 zSSIIb 和 9 个的
玉米事件特异性旁侧序列的质粒分子，其涉及的转
基因玉米事件包括 TC1507、CBH351、Bt11、Bt176、
GA21、MON810、MON863、NK603 和 T25。Wang 等［12］
针对转基因大豆和棉花的定量检测构建了一个含有
2 个内标准基因片段（Lec1 和 Sad1）和 6 个外源基
因片段（35S、NOS、Pat、35SG、Cry 和 EPSPS）的
质粒。
1.1.4 制备工作 一般都将构建得到的质粒转化入
大肠杆菌模式菌株中，划平板挑取单克隆菌落后在
LB 培养液中进行富集培养，然后采用碱裂解法进行
提取和纯化。
1.1.5 检测方法 目前最常用和有效的是实时荧光
定 量 PCR（Real-time PCR， 简 写 为 RT-PCR） 方 法
进行检测。ISO 21570:2005 和 GB/T 19495.5-2004 均
规定了转基因产品中转基因成分核酸定量检测方
法［18,19］。
以上所介绍的相关 RT-PCR 检测方法都是针对
单性状转化体设计的，但是近年来国内外种子公司
开发了大量的复合性状（Stack）转基因作物。复合
性状转基因作物是指同一种转基因植物中含有两种
Vector. 框架载体；Ex. 外源基因片段；En. 内标准
基因片段；Interval. 间隔序列
载体名称 载体大小（bp） 研发公司 文献来源
pT-Adv vector 3 906 Clontech 公司 [5]
pMD18/19-T Simple Vector 2 692 宝生物公司 [4,12-14]
pEASY-T3 3 036 全式金公司 [15]
pGEM-T 或 pGEM-T easy 3 003 或 3 018 普洛麦格公司 [16]
pCR®2.1-TOPO® 3 931 英潍捷基公司 [3,17]
图 1 质粒分子载体模式
1.1.1 载体的选择 转基因核酸检测用的候选质粒
分子一般为自身较小、拷贝数高的松弛型质粒，该
类质粒容易复制和纯化，是构建载体较好的选择。
表 1 中列举了近年来在构建质粒分子中常用的载体。
由表 1 可见 , 此类载体多集中于 3 000 bp 左右，并
且多数是适用于蓝白斑筛选的 T 载体。
表 1 质粒标准分子的框架载体统计表
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期50
及两种以上的不同目标性状。如同时耐除草剂和抗
虫的转基因棉花，同时抗病和抗虫的转基因马铃薯，
含油量高和耐除草剂的转基因大豆，同时改变花色
和耐除草剂的转基因香石竹，同时增加赖氨酸含量
和抗虫的转基因玉米等都是复合性状转基因作物。
多性状复合是发展趋势。2010 年，美国种植的转基
因作物中 41% 具有复合性状，包括 78% 的转基因
玉米，以及 67% 的转基因棉花。转 8 个基因的转基
因玉米，名为 SmartstaxTM，于 2010 年在美国和加拿
大进入市场，拥有多种抗虫性状及耐除草剂性状［1］。
针对复合性状的转基因核酸需要使用双重或
多重 PCR 进行检测。Zhang 等［14］将孟山都公司研
发 的 Roundup Ready 大 豆 产 品 GTS 40-3-2（RRS）、
CaMV35S 和 NOS 3 个外源基因片段及内标准基因片
段 Lectin 构建到 pMD18-T 载体。为了避免干扰，在
内外源基因片段间使用了 2.6 kb 的间隔片段，并且
开发了双重定量 PCR 的方法，试验结果证明双重
PCR 与单一 PCR 结果相似，可用于转基因大豆的
定量检测。2010 年，Koppel 等［20］针对 3 种水稻转
化体（LL62、LL601 和 Bt63）构建了质粒分子，并
且进行了多重 RT-PCR 的研究。灵敏度和特异性在
0.01%-1%。
1.2 均匀性检验
标准物质均匀性是标准物质最基本的属性，不
论制备过程中是否经过均匀性初检，凡成批制备并
分装成最小包装单元的标准物质，都必须进行均匀
性检验。对于分级分装的标准物质 , 凡由大包装分
装成最小包装单元时，都需要进行均匀性检验［9］。
为了检验质粒分子标准物质是否均匀，通常随机抽
取一定数量的最小包装单元。可按随机数表所示方
法抽样，采用精密度高的实验方法，对抽出的各样
品在控制同样的试验条件下进行测定，从而使各样
品间的差异完全由样品的不均匀性反映出来。方差
分析法是用来统计检验均匀性的最常用方法。通过
组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间
有无系统性差异，二者的比小于统计检验的临界值，
则认为样品是均匀的。
目前已报道的质粒分子大多缺乏此类检验，只
有 ERM-AD413 进行了均匀性试验。其试验方法如
下 ：均匀性是采用内标准基因和外源基因扩增拷贝
数相比的方法，通过双重 RT-PCR 随机取样进行分
析。在 DNA 序列的固有特征一致的前提下，试验证
明批次间的序列比值没有差异。两个目标序列的比
率用来评估 ERM-AD413 方差的齐性［5］。
1.3 稳定性检验
标准物质的稳定性是指在规定的时间间隔和环
境条件下，标准物质的特性量值保持在规定范围内
的性质［9］。可见，标准物质的稳定性是用来描述标
准物质的特性量值随时间变化的。
标准物质的稳定性包括长期稳定性和短期稳定
性。长期稳定性是指在规定贮存条件下标准物质特
性的稳定性。短期稳定性是指在运输条件下标准物
质在运输过程中的稳定性。对于生物类标准物质，
由于运输过程很难保持储存条件，且这些物质可能
由于温度的变化（如上至 50℃，下至 -70℃）而使
样品的特性值发生变化甚至失效。因此进行短期稳
定性研究 4 周 ；长期稳定性进行 6 个月或 1 年。按
ISO 导则 35［21］关于稳定性评价的方法对标准物质
的长期稳定性进行评价。
关于稳定性的检验，目前仅有 ERM-AD413 的
报告中对其进行了报道。内容如下：短期稳定性分析：
分别存储在 -20℃、4℃、18℃或 60℃，达 1、2 和 4
周，各 5 管样本，每管分成 3 个子组（N=5，n=3）。
一个存储在 70℃的同种样本作参照。每个样本 3 次
重复，通过双重 RT-PCR 对两个序列含量进行分析。
长期稳定性试验 ：将冻存管放置在 -70℃（参照
温度），-20℃及 18℃，达 2、4 和 6 个月进行。5 个
不同的管在每个温度下通过 RT-PCR 同时分别进行
3 个重复的测试（5 μL pDNA 每个 PCR 反应）。数据
经格拉布斯检验无离群值需要剔除。
1.4 定值与不确定度评价
定值的测量方法应在理论上和实践中经检验证
明是准确可靠的方法。选用下列方式之一对标准物
质定值 ：用高准确度的绝对或权威测量方法定值 ；
用两种以上不同原理的已知准确度的可靠方法定值；
多个实验室合作定值。由于目前转基因核酸检测缺
乏权威方法（基准方法）和不同原理的已知准确度
方法，所以只能采用多个实验室合作的方式定值。
2012年第2期 51李亮等 ：转基因定量检测用质粒分子标准物质研究进展
参加合作的实验室应具有该标准物质定值的必
备条件，并有一定的技术权威性。每个实验室可以
采用统一的测量方法，也可以选该实验室确认为最
好的方法。合作实验室的数目或独立定值组数应符
合统计学的要求（当采用同一种方法时，独立定值
组数一般不少于 8 个，当采用多种方法时，一般不
少于 6 个）。定值负责单位必须对参加实验室进行质
量控制的制订明确的指导原则［9］。
针对质粒分子标准物质的定值，目前是通过两
种手段进行定值 ：对质粒分子全序列进行测序，至
少选择不同的 3 家实验室确定外源基因和内标准基
因的克隆比例 ；对质粒分子进行外源基因和内标
准基因的扩增，确定两个片段的 Ct 值比例。ERM-
AD413 采取了这两种方式。
为了验证 ERMAD413 标准物质的两个克隆 DNA
分子间正确的比例，pIRMM-0036 质粒的全序列由
3 个独立的实验室对质粒全长进行测定。测序结果
与发表的序列 100% 一致。DNA 测序同时也确定了
hmg 和 MON810 克隆序列的比例为 1。拷贝数比率
通过双重 RT-PCR 的齐性数据和单重 RT-PCR 的数
据确定。两个比率都符合质粒序列分析的理论结果
比率“1”。
其他多数工作针对质粒分子的适用性进行了
研究，而非真正意义上的定值。Chiueh 等［22］为满
足实施标记的需求，重点分析了 RT-PCR 方法对转
基因玉米的检测。转入基因特异性引物和探针选
自 Event176、Bt11、MON810、GA21 和 T25 转 基 因
玉米。采用上述引物探针进行 RT-PCR 分析。构建
含外源和内源控制基因序列的转基因玉米质粒分子
作为定量参考。此外，应用构建的质粒和测试样
本验证定量系统。分析结果显示，质粒标准曲线
斜率范围 -3.31--3.45，线性相关系数 0.99-1.0。测
试采用此方法为转基因含量 1%、2% 和 5% 的转基
因玉米进行了定量。1%、2% 和 5% 水平转基因玉
米的测试结果分别为 1.01%-1.23%、2.00%-2.31%
和 4.46%-5.55%。 标 准 偏 差 0.05-0.46， 变 异 系 数
5%-15%。定量限 0.1%。
Wang 等［12］采用 CRL 研制的 Roundup Ready 大
豆标准物质（转基因含量 0.25%、0.5% 和 1% 和 2%）
验证了构建的质粒 pTLE8 相对定量标准的适用性。
定量平均相对含量分别为 0.35%、0.66%、1.18% 和
2.01%。标准偏差从 0.03 到 0.22，相对标准偏差在
3.09% 至 18.53% 之间。对于 2%、1%、0.5% 和 0.25%
的大豆样本定量偏差分别为 0.5%、18%、32% 和
40%。
关于标准值的总不确定度，一般认为由 3 个部
分组成。第一部分是通过测量数据的标准偏差、测
量次数及所要求的置信水平按统计方法计算出。第
二部分是通过对测量影响因素的分析，估计出其大
小。第三部分是物质不均匀性和物质在有效期内的
变动性所引起的误差［9］。针对质粒分子标准物质的
不确定度评价研究鲜有报道，只有 ERM-AD413 的
研制报告中对其进行了表述。该报告忽略了上述的
第二部分不确定度，总不确定度由均匀性、稳定性
和定值不确定度三方面贡献，合成扩展不确定度为
0.06。
2 问题
自从 2002 年日本科研工作者 Kuribara 等［2］首
先采用质粒分子作为阳性参考物质进行转基因产品
定量检测以来，质粒分子标准物质研究成为了热点。
虽然这方面的研究已经进行了近 10 年，但是还存在
如下问题。
2.1 可替代性问题
我们发现在 RT-PCR 试验时，完全依赖质粒标
准分子而不使用其他标准物质是不可能的。问题在
于质粒和基体在定量中是否可以替代。目前只有较
少的文献报道了这方面的研究，ERM-AD413 经过多
家实验室验证，质粒基体可以替代，但这只是特例，
因为不可能保证每个质粒分子同植物基因改良样品
的拷贝数相比都产生 1 1 的结果，因为相关效率和
转基因作物的外源基因片段和内标准基因片段也许
发生了变化。这种情况下，需要通过试验确定一个
具备动态范围的校准系数，以此修正质粒分子和基
体的匹配问题［16］。
2.2 缺乏标准物质研制的基本步骤
标物物质需要有均匀性检验、稳定性检验和不
确定度的评价。多数文献只报道了质粒分子的构建、
制备和标准曲线的线性等，而缺乏这三方面的研究。
这几方面可以证明使用标准物质所得检测结果的可
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第2期52
靠性和可控性，是标准物质必不可少的步骤。
3 展望
在不能直接获得植物组织的标准物质或者不频
繁使用标准物质时，质粒分子可以方便而迅速的获
得，并且达到检测目的。当给予合理的稀释，防止
组织的污染，并且提供可靠的拷贝数，质粒分子与
植物阳性材料的 DNA 相比，将是一种便捷的和经济
的选择。所以，完善质粒分子标准物质的制备流程，
补充制备的必要条件，是加快质粒分子标准物质应
用的有效手段。
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（责任编辑 狄艳红）