全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(11): 19461955 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30700498和 31271691)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 潘刚, E-mail: pangang12@126.com
Received(收稿日期): 2014-03-31; Accepted(接受日期): 2014-09-16; Published online(网络出版日期): 2014-09-26.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140926.0820.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01946
水稻叶片早衰突变体 osled的生理特征与基因定位
赵晨晨 1 黄福灯 2 龚 盼 1 杨 茜 1 程方民 1 潘 刚 1,*
1浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058; 2 浙江省农业科学院, 浙江杭州 310021
摘 要: 叶片早衰直接影响作物的产量与品质, 因此, 研究叶片早衰的分子与生理机制对于作物遗传改良具有重要
的意义。本研究利用 60Co-辐射诱变水稻品种 93-11获得突变体 osled, 其从分蘖期叶片就开始早衰, 最先表现为叶尖
和叶边缘变褐, 并伴有红褐色斑点。在苗期经模拟干旱胁迫处理后, 突变体不仅早衰, 而且植株变矮以及根系变短。
生理分析表明, 野生型剑叶、倒二叶和倒三叶的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及过氧化物酶(POD)
活性基本不变, 但突变体则显著升高且倒二叶和倒三叶极显著高于野生型; 突变体和野生型三片叶的可溶性蛋白含
量、过氧化氢酶(CAT)活性及叶绿素总含量均表现下降, 但突变体倒二叶和倒三叶的含量或活性均显著低于野生型。
叶片经台盼蓝、二氨基联苯胺(DAB)及四唑硝基蓝(NBT)等细胞组织化学染色及透射电镜分析表明, osled叶片细胞膜
系统已破坏, H2O2和 O2܋积累, 叶绿体已开始解体。遗传分析表明, osled受 1对隐性基因控制, 借助图位克隆技术将
该基因定位于第 3 染色体长臂的 RM15528 与 RM15553 两个标记之间, 遗传距离均为 0.7 cM, 该结果为进一步克隆
OsLED基因并研究其功能奠定了基础。
关键词: 水稻; 叶片早衰; 模拟干旱胁迫; 生理分析; 精细定位
Physiological Characteristics and Gene Mapping of a Leaf Early-Senescence
Mutant osled in Rice
ZHAO Chen-Chen1, HUANG Fu-Deng2, GONG Pan1, YANG Xi1, CHENG Fang-Min1, and PAN Gang1,*
1 College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou
310021, China
Abstract: Leaf early senescence directly affects crop yield and quality, therefore, it is of great importance to study its molecular
and physiological mechanisms. In this study, we obtained a leaf early senescence mutant, osled, by irradiating rice variety 93-11
with 60Co-γ ray. The mutant showed early senescence symptoms, such as grey leaf tip and edge and red-brown lesions on leaf,
even at tillering stage. Under the condition of simulated drought stress, seedlings of the mutant appeared in obviously shortened
plant height and root length. Besides, physiological and biochemical indices in the mutant varied significantly. Under drought
stress, the wild type maintained stable levels of malondialdehyde (MDA) content and activities of superoxide dismutase (SOD)
and peroxidase (POD) in the top three leaves; however, the mutant showed significantly increased MDA content and SOD and
POD activities in these leaves. Although the contents of soluble protein and chlorophyll and catalase (CAT) activity in the top
three leaves decreased in both wild type and the mutant, the reductions in the second-top and third-top leaves of the mutant
were significantly greater compared to those of the wild type. The results of histochemical staining by trypan blue,
3,3’-diaminobenzidine (DAB), and nitro blue tetrazolium (NBT) disclosed the destruction of membrane system and the accumula-
tion of H2O2 and O2܋ in the mutant. Besides, ultrastructure of mesophyll cells further explained the degradation of chloroplast in
the mutant. A single recessive gene was found to control the senescence trait according to genetic analysis, and the OsLED gene
was mapped in the marker interval RM15528–RM15553 on the long arm of chromosome 3, with bilateral genetic distance of
0.7 cM.
Keywords: Rice; Leaf early senescence; Simulated drought stress; Physiological analysis; Fine mapping
衰老是植株整个生长发育过程的最终阶段, 是 由遗传因子调控的一种有序自解体过程。衰老最先
第 11期 赵晨晨等: 水稻叶片早衰突变体 osled的生理特征与基因定位 1947


出现在叶片, 通常伴随着叶绿体解体、光合作用减
弱、核酸、蛋白质和脂质水平降低等[1]。叶片衰老
的进程既受植物激素等内源相关信号分子调控, 同
时也受干旱、盐碱、温度胁迫和病原菌侵染等环境
因子影响[1]。在植物生殖生长和发育后期, 叶片衰老
导致光合效率降低, 影响种子形成过程中的糖类累
积, 进而影响农作物产量[1-2]。同时, 衰老后期叶片
中大量营养物质的转运和再利用将直接影响种子营
养品质[1-2]。研究表明, 若在水稻籽粒灌浆后期设法
延长功能叶片1天的寿命 , 稻谷产量可以增加1%~
2%左右[3]。
叶片衰老是一个包含程序性细胞死亡的过程 ,
受到细胞核基因的主动调控。衰老过程涉及到大量
基因的开启和关闭, Liu 等[4]利用抑制差减杂交法鉴
定获得533个衰老相关的差异表达基因 , 其功能涉
及大分子物质代谢、调控蛋白质合成、能量代谢、
调节基因、解毒、病原性和逆境、细胞骨架构成和
花发育等。迄今已从水稻中克隆并经遗传转化验证
或 T-DNA插入验证的叶片衰老相关基因有28个, 根
据其功能分成7类 , 包括转录因子 , 如 OsDOS[5]、
OsTZF1[6]、Cga1[7]、OsNAP[8]、SUB1A[9]和 OsHox33[10]
等基因 ; 蛋白酶或激酶基因 , 如 OsSAG12-1[11]、
OsABC1-2[12]、OsSIK2[13]和 Osh69[14]等基因; 参与代
谢加工降解的基因 , 如 SGR[15-16]、 SGRL[17]、
OsAkαGal[18]、RLS1[19]、nol1[20]、nyc1[21]、NYC3[22]、
NYC4[23]、OsRCCR1[24]、OsPAO[24]、A12[25]和 Osl2[26]
等基因; 物质转运相关基因, 如 SPL28[27]; 参与催
化作用的基因, 如 GDCH[28]; GTP或 RNA结合蛋白
基因, 如 OsRab7B3[29]和 OsLMS[30]; 生物合成相关
基因, 如 ygl1[31]。
本课题组利用 60Co-辐射诱变籼稻品种 93-11,
获得了一个隐性叶片早衰突变体, 其叶片早衰表型
在水稻分蘖期(约 4~5 片叶龄时)就开始显现, 之后
随着水稻叶龄的增加, 除心叶及心叶下第 1 片全展
叶外, 其他叶片均不同程度出现早衰症状, 至抽穗
5~7 d后所有叶片均早衰。此外, 与野生型对照 93-11
及未处理的突变体对照 osled相比, 经模拟干旱胁迫
处理后的突变体叶片明显早衰、株高变矮和根系更
短 , 因此将该突变体暂命名为 osled (Oryza sativa
leaf early-senescence and drought-sensitive)。本文分
析了该突变体的基本表型、生理变化、叶片组织化
学染色观测结果、叶肉细胞的超微结构及基因定位,
为进一步克隆该基因及揭示其早衰的分子和生理机
制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与田间种植
从 60Co-辐射诱变籼稻品种 93-11 的后代中获
得叶片早衰及干旱敏感突变体 osled, 经杭州和海南
多代自交和回交获得遗传稳定的株系。之后利用
osled 为母本, 分别与其野生型 93-11 和常规粳稻品
种 02428 杂交, 获得 F1并自交获得 F2, 对 F1和 F2
群体进行遗传分析, 并利用 osled/02428的 F2群体进
行基因定位。
2011 年和 2012 年将突变体 osled 及其野生型
93-11、2013 年将上述 2 个 F2群体及其亲本分小区
种植于浙江大学紫金港校区农业实验站(浙江杭州)。
每个亲本材料重复 2次, 每个重复 4行, 每行 8株; 2
个 F2群体的田间种植不设重复, 单本插植。2011年
和 2012年均 6月 1日播种, 6月 27日移栽; 由于突
变体 osled比野生型 93-11的生育期约晚 3周, 为了
生理试验的取样一致性, 2013年野生型 93-11的播种
和移栽日期均后移 3 周, 而 2 个 F2群体及其他亲本
的播种和移栽日期均同 2012年。所有材料栽插密度
为 17 cm × 22 cm, 大田常规水作管理, 及时防治病
虫和杂草。试验地前茬为油菜, 地力中等偏上。2011
年和 2012年在水稻成熟时, 取每个材料 20株, 调查
生育期、株高、单株有效穗数、穗粒数、千粒重、
结实率等主要农艺性状。2013年在水稻生长至抽穗
期, 对突变体 osled及其野生型 93-11取不同叶位叶
片, 测定有关生理指标, 并进行组织化学染色以及
透射电镜分析; 同时对 2 个 F2群体分单株观察其早
衰表型并取样, 提取 DNA用于后续基因定位分析。
1.2 模拟干旱处理
选取突变体 osled及其野生型 93-11的成熟种子
发芽并在营养液[32]中培养, 挑选生长基本一致的二
叶一心幼苗在含有 7.5% PEG-6000的营养液中培养,
3 周后分别调查株高和根长并观察照相。培养条件
为白天 28℃、光照 16 h; 晚上 25℃、黑暗 8 h。每
个处理重复 3次。
1.3 生理指标测定
分别选取 10 株抽穗当天的突变体 osled 及其野
生型 93-11 主茎剑叶、倒二叶、倒三叶测定叶绿素
含量、可溶性蛋白含量、MDA含量、CAT活性、SOD
活性和 POD活性。用 80%丙酮提取叶绿素, 测定波
长 663 nm和 646 nm下的吸光值; 采用考马斯亮蓝
1948 作 物 学 报 第 40卷


G-250 染色法测定可溶性蛋白; 各生理指标测定方
法均参考《植物生理学实验技术》[33]。采用日本岛
津公司 UV-2450 紫外分光光度计, 每个指标测定 3
个重复。
1.4 细胞组织化学染色
抽穗当天剪取突变体 osled及其野生型 93-11主茎
倒二叶中上部 3~5 cm 长叶片, 分别参考 Yin 等[34]、
Kariola等[35]和Mahalingam等[36]的方法进行台盼蓝、
NBT和 DAB染色。每个试验重复 3次。
1.5 透射电镜分析
抽穗当天剪取突变体 osled 及其野生型 93-11
主茎倒二叶中部靠主脉约 5 mm处的 2 mm2样本 ,
放入用 0.1 mmol L–1 (pH 7.2)的磷酸缓冲液配制的
2.5%戊二醛溶液中 , 抽真空至样品完全浸没 , 4℃
下固定 24 h。而后以磷酸缓冲液冲洗 3 次 , 每次
30 min, 再用 1%锇酸 4℃下后固定 4 h, 再以磷酸
缓冲液冲洗 3次 ; 常规梯度乙醇系列脱水 , 环氧丙
烷置换 , Epon812 树脂包埋 , 70℃下聚合 8 h, 用
LKB-V 型切片机制超薄切片 , 经醋酸双氧铀和柠
檬酸铅双重染色后在 JEM-1230 型透射电镜下观
察并照相。
1.6 遗传分析与基因定位
在大田分单株剪取 F2定位群体具有突变体早衰
性状的植株、双亲以及 F2群体中 10 株正常植株的
叶片, 采用 CTAB法提取基因组总 DNA。而后分别
选取 F2定位群中 10株正常植株和 10株具有早衰性
状植株的DNA等量混合, 构建正常基因池和突变基
因池, 用于 OsLED基因连锁标记筛选。将 500对均
匀分布于水稻 12条染色体上的 SSR标记(http://www.
gramene.org/)和 50 对 InDel 标记[37]用于亲本 osled
和 02428 的多态性筛选, 用所筛选到的多态性标记
分别对正常池和突变池进行连锁性分析, 获得连锁
性标记并进一步分析所有 F2群体中 137株早衰单株,
获得每个连锁标记的重组单交换和双交换单株数并
计算遗传距离。分子标记与目标基因的遗传距离
(cM)=100×(单交换单株数+2×双交换单株数)/(2×总
单株数)。同时在 Gramene数据库(http://www.gramene.
org/)查找连锁分子标记在染色体上的具体物理位置
以确定其排列顺序, 结合每个标记的重组交换单株
数确定OsLED基因与连锁标记的顺序并构建遗传连
锁图。PCR体系 20 μL, 含 0.8 U Taq DNA聚合酶, 1×
PCR buffer (Mg2+ Plus), 1 mmol L–1 dNTP Mixture,
50 ng DNA, 上下游引物各 0.25 μmol L–1。PCR程序
为 95℃预变性 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30
s, 33个循环; 72℃ 10 min。PCR产物经 8%非变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察[38]。
2 结果与分析
2.1 突变体 osled的形态特征
田间种植情况下, 分蘖期前的突变体 osled及其
野生型 93-11 表型基本一致, 分蘖期后突变体除心
叶及心叶下部的 1 片完整展开叶外, 其他叶片均出
现不同程度早衰且始于叶尖与叶边缘变褐色, 并在
叶表面呈现不规则分布的红褐色斑点(图 1-A), 之后
随着叶龄增长斑点面积增大至叶脉, 最终整张叶片
枯死(图 1-C)。至抽穗后 5~7 d, 突变体 osled整株所
有叶片均早衰甚至枯死(图 1-B)。其主要农艺性状,
如株高、每穗粒数、千粒重和结实率均比其野生型
分别下降 33.6%、81.7%、31.8%和 33.0%; 生育期则
比对照约迟 3周(表 1)。

图 1 不同生育期突变体 osled及其野生型(WT)的表型
Fig. 1 Phenotypes of osled and wild type (WT) plants at
different growth stages
A: 分蘖期; B: 开花后 10 d (osled)和 30 d (WT); C: 开花当天
(1: 剑叶; 2: 倒二叶); Bar=5 cm。
A: at tillering stage; B: 10 d (osled) and 30 d (WT) after flowering;
C: at the flowering day (1: flag leaf; 2: the 2nd leaf from top);
Bar=5 cm.

2.2 突变体 osled与野生型对照 93-11的生理特征
2.2.1 叶绿素含量 抽穗期突变体 osled 剑叶(图
2-A)和倒三叶(图 2-C)的叶绿素 a含量分别比其野生
型 93-11 低 4.9%和 43.0%, 而叶绿素 b 则分别下降
34.2%和 42.9%, 叶绿素总含量分别下降 14.6%和
43.0%。而与野生型 93-11 相比, 突变体 osled 倒二
叶(图 2-B)的叶绿素 a 含量则高 15.5%, 叶绿素 b 含
量低 34.3%, 叶绿素总量差异不显著。
2.2.2 CAT、POD 和 SOD 的活性 由图 3-A 可
以看出, 突变体 osled及其野生型 93-11的 CAT活性
随叶龄增加依次降低, 但相对于其野生型 93-11, 突
变体 osled 倒二叶与倒三叶则分别下降 12.6%和
第 11期 赵晨晨等: 水稻叶片早衰突变体 osled的生理特征与基因定位 1949


表 1 突变体 osled及其野生型(WT)的主要农艺性状
Table 1 Main agronomic traits of osled and the wild type (WT) plants
2011 2012 性状
Trait 野生型 WT 突变体 osled 野生型 WT 突变体 osled
生育期 Growth period (d) 149.3±0.6 171.2±0.9** 149.6±0.5 169.3±0.8**
株高 Plant height (cm) 124.0±1.5 83.4±1.8** 124.0±1.5 81.2±1.2**
有效穗数 Effective panicle number 8.4±0.5 7.8±0.3** 8.3±0.4 8.1±0.6
结实率 Seed setting rate (%) 86.1±10.2 61.4±2.8** 87.8±5.9 55.7±4.3**
千粒重 1000-seed weight (g) 29.1±0.5 20.8±1.5** 29.5±0.6 19.3±1.2**
每穗粒数 Grain number per panicle 214.9±22.6 41.1±1.3** 220.4±10.8 43.2±1.6**
**在 0.01水平上差异显著。**Significant difference at P<0.01.

图 2 抽穗当天突变体 osled及其野生型(WT)叶片的叶绿素含量
Fig. 2 Chlorophyll content of leaves in osled and the wild type (WT) plants at heading stage
A: 剑叶; B: 倒二叶; C: 倒三叶。** 在 0.01水平上差异显著。
A: the flag leaf; B: the 2nd leaf from top; C: the 3rd leaf from top. ** Significant difference at P<0.01.


图 3 抽穗当天突变体 osled及其野生型(WT)叶片的 CAT、POD和 SOD活性
Fig. 3 CAT, POD, and SOD activities of osled and the wild type (WT) plants at heading stage
1: 剑叶; 2: 倒二叶; 3: 倒三叶。*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
1: flag leaf; 2: the 2nd leaf from top; 3: the 3rd leaf from top. *Significant difference at P<0.05; **Significant difference at P<0.01.

17.8%。由图 3-B 及图 3-C 可见 , 野生型 93-11 的
剑叶、倒二叶和倒三叶之间的 POD 活性和 SOD
活性差异不显著 , 而突变体 osled 则极显著增加。
与野生型 93-11 相比 , 突变体 osled 的剑叶、倒二
叶和倒三叶的 POD 活性分别增加 46.7%、669.0%
和 750.1%; 而 SOD 活性则分别增加 7.1%、17.6%
和 88.1%。
2.2.3 MDA 和可溶性蛋白含量 图 4-A 显示野
生型 93-11的剑叶、倒二叶和倒三叶的 MDA含量基
本一致, 而突变体 osled则依次显著升高。与野生型
93-11 相比, 除剑叶外, 突变体 osled 倒二叶和倒三
叶的 MDA含量分别增加 21.7%和 47.9%。而随着叶
龄增加, 野生型 93-11和突变体 osled的可溶性蛋白
含量依次降低(图 4-B), 但与野生型 93-11 相比, 除
倒三叶外, 突变体剑叶和倒二叶的可溶性蛋白含量
分别下降 13.5%和 6.9%。
2.2.4 叶片组织化学染色及超微结构 通常健康
的细胞因细胞膜完整而能够排斥台盼蓝, 不被染成
蓝色, 因此台盼蓝是检测细胞膜完整性常用的生物
染色试剂。突变体 osled叶片出现深蓝色斑点(图 5-A),
说明其细胞的膜系统已不完整或细胞已死亡。NBT
在 O2܋ 臜的作用下还原生成不溶于水的蓝色二甲 ,
1950 作 物 学 报 第 40卷



图 4 抽穗当天突变体 osled及其野生型(WT)叶片的 MDA及可溶性蛋白含量
Fig. 4 MDA content and soluble protein content of osled and the wild type (WT) plants at heading stage
1: 剑叶; 2: 倒二叶; 3: 倒三叶。*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
1: flag leaf; 2: the 2nd leaf from top; 3: the 3rd leaf from top. *Significant difference at P<0.05; **Significant difference at P<0.01.

图 5 突变体 osled及其野生型(WT)叶片的组织化学染色
Fig. 5 Histochemistry staining of leaves of osled and wild type (WT) plant
A: 台盼蓝染色; B: NBT染色; C: DAB染色。Bar=1 cm。
A: Trypan blue staining; B: NBT staining; C: DAB staining. Bar=1 cm.

因此可以检测植物体内的活性氧的积累。图 5-B 显
示突变体 osled叶片的部分组织细胞被染成蓝色, 说
明其体内存在 O2܋的积累。此外, DAB能与 H2O2反
应生成棕红色的多聚产物, 因此 DAB染色法是检测
H2O2积累的细胞化学方法。从图 5-C 看出, 突变体
osled 叶片的部分组织细胞被染成棕红色, 说明其中
有 H2O2 的积累。与野生型对照相比, 突变体 osled
叶绿体中的嗜锇颗粒更多(图 6-B)、细胞膜界面不清
晰完整(图 6-B)、类囊体基粒片层已降解(图 6-D), 进
一步说明细胞已开始走向死亡。
2.2.5 模拟干旱条件下突变体表型 在 7.5%
PEG-6000 模拟干旱胁迫处理 3 周后, 突变体 osled
叶片在苗期就早衰(图 7-B), 而野生型对照 93-11 及
未处理的突变体 osled 则生长正常(图 7-A)。与未处
理的突变体 osled 相比, 胁迫后的突变体 osled 株高
(图 7-C)和根长(图 7-D)分别下降 52.1%和 42.3%; 而
胁迫后的野生型对照 93-11 则仅比其未处理对照分
别下降 25.3%和 32.9%。处理后的突变体 osled株高
和根长也分别比处理后的野生型对照 93-11 下降
38.8%和 18.5%。

图 6 突变体 osled与野生型(WT)叶肉细胞的超微结构
Fig. 6 Ultrastructure of mesophyll cell in osled and the wild
type (WT) plants
A和 C: 野生型(WT); B和 D: 突变体(osled); E: 噬锇颗粒;
F: 叶绿体膜; G: 类囊体基粒片层。
A and C: wild type (WT) plants; B and D: mutant (osled) plants;
E: osmiophilic particle; F: chloroplast membrane; G: thylakoid
stroma lamella.
第 11期 赵晨晨等: 水稻叶片早衰突变体 osled的生理特征与基因定位 1951



图 7 PEG-6000模拟干旱胁迫下突变体 osled与野生型(WT)的表型
Fig. 7 Phenotype of osled and the wild type (WT) plants under simulated drought stress
A: 正常条件下的植株表型; B、C和 D: 7.5% PEG-6000处理后的植株表型(B)、株高(C)和根长(D)。Bar=5 cm。
A: phenotype of plants under normal conditions; B, C, and D: phenotype of whole plant (B), shoot height (C), and root length (D) under 7.5%
PEG-6000 for three weeks. Bar=5 cm.

2.3 遗传分析及基因定位
osled/93-11和 osled/02428两个杂交 F1单株均表
现正常, 说明突变体叶片早衰性状是由隐性位点控
制。在 osled/93-11的 521个 F2单株中, 有 128株表
现叶片早衰, 393 株表现正常, 正常单株∶早衰单株=
3∶1 [χ2=0.82<3.84(χ2(0.05,1))]; 而在 osled/02428 的
567 个 F2单株中, 正常单株 430, 早衰单株 137, 正
常单株∶早衰单株=3∶1 [χ2=0.65<3.84(χ2(0.05,1))]。田
间种植观察表明, 早衰单株叶片均先呈现出红褐色
斑点, 后随着衰老加剧, 红褐色斑点扩大、增多并逐
渐形成坏死斑点。这 2个 F2群体的结果均符合孟德
尔单基因隐性遗传的分离比例, 证实 osled受单隐性
核基因控制。
利用 osled/02428的 F2代群体作为定位群体, 共
得到 137株早衰单株。选取均匀分布于水稻 12条染
色体上的 500 对 SSR 引物逐条对 02428 和突变体
osled 进行多态性分析, 利用筛选到的多态性引物分
析正常基因池和突变基因池。结果发现在水稻第 3
染色体上的 SSR 标记 R3M30、RM15414 以及
RM3513 在突变体基因池和正常基因池之间存在明
显的偏分离, 利用 137 个早衰单株验证以上标记,
初步把 OsLED定位在 RM15414和 RM3513之间(图
8)。为进一步定位 OsLED 基因, 在 RM15414 和
RM3513 之间设计 SSR 标记, 发现有 4 对引物在亲
本之间存在多态性, 利用这 4 对引物对 F2单株进行
基因连锁分析, 最终将OsLED基因定位在RM15528
与 RM15553之间, 遗传距离均为 0.7 cM, 物理距离
约 289 kb, 其间含有 AC120505、AC128646 和

图 8 OsLED基因在第 3染色体上的分子定位
Fig. 8 Molecular mapping of OsLED gene on the long arm of chromosome 3
1952 作 物 学 报 第 40卷


AC147427等 3个 BAC (图 8)。根据日本晴序列, 在
该定位区间内有 22个注释基因(http://rapdb.dna.affrc.
go.jp/), 2 个编码转运体蛋白, 12 个编码未知表达蛋
白, 2个编码转录因子蛋白, 其他分别编码周期蛋白
F、锌指蛋白、DNA修复酶、DNA结合蛋白、WD-40
重复蛋白、类马铃薯糖蛋白和植物果胶甲酯酶抑制
蛋白。
3 讨论
叶片衰老是叶片生长过程中的必经阶段, 伴随
叶片衰老, 其体内的叶绿素含量、光合效率以及细
胞膜系统的膜质组分均发生变化[1]。叶片衰老的外
在直接表现是叶色变黄, 叶片衰老甚至枯死, 而内
在的表现则是叶绿体超微结构发生明显变化甚至完
全解体。本研究中的突变体 osled从分蘖期开始, 叶
尖和叶边缘变黄并伴有红褐色斑点(图 1-C), 光合色
素含量急剧下降, 且相对于剑叶, 倒二叶和倒三叶
中的叶绿素 a 含量分别下降 3.0%和 53.3%, 而叶绿
素 b含量则分别下降 4.3%和 41.9% (图 2), 说明突变
体 osled倒二叶和倒三叶已早衰, 这也与图 1的结果
一致。而突变体 osled倒二叶的叶绿素 a含量明显高
于野生型对照, 叶绿素 b 的含量相反(图 2-B), 这可
能是因为突变体 osled叶片在衰老过程中, 基于自我
保护的机制, 叶绿素 b 在叶绿素 b 还原酶的作用下
转换成叶绿素 a [39]。台盼蓝染色是检验植物细胞膜
完整性以及细胞死亡的有效方法, 本研究中的突变
体 osled 叶片部分细胞被染成深蓝色(图 5-A), 表明
细胞膜系统已经破坏, 细胞已经出现死亡。超微结
构进一步证实, 突变体 osled叶肉细胞的细胞膜边界
不清晰, 叶绿体中的嗜锇颗粒明显更多, 叶绿体膜
及类囊体基粒片层明显降解(图 6)。
然而, 叶绿体是植物ROS (reactive oxygen spe-
cies, ROS)形成的主要场所之一, 伴随衰老叶片叶绿
体的解体以及其他逆境胁迫, 叶绿体中的电子传递
链将受到抑制, 致使1O2、H2O2和O2܋大量形成[40]; 而
ROS含量过高将进一步导致细胞膜的破坏、蛋白质
和脂类的降解, 加速细胞和植株的衰老[41]。由于活
性氧含量急剧增加且不能被及时清除, 导致MDA含
量快速增加, 因此MDA含量也是衡量植物衰老的指
标之一[1]。在本研究中, 相对于突变体osled剑叶及野
生型 , 其倒二叶和倒三叶的MDA含量极显著升高
(图4-A), 说明其体内自由基含量明显累积。当然 ,
在叶片衰老的进程中, 自由基的多少间接反映其衰
老程度, NBT和DAB染色分别能反映自由基和H2O2
的积累。与野生型93-11相比, 突变体osled叶片部分
细胞则分别被NBT (图5-B)和DAB (图5-C)染成蓝色
和红褐色, 说明突变体osled叶片中确实存在自由基
和H2O2的累积。H2O2的积累会导致破坏性的氧化作
用, 而CAT酶是清除H2O2的重要保护酶[42]。图3-A结
果显示除剑叶外, 突变体osled倒二叶及倒三叶CAT
活性明显低于野生型, 表明细胞清除H2O2的能力下
降, 致使H2O2大量积累, 这不仅进一步证实了NBT
染色和DAB染色的结果, 也说明导致突变体叶片早
衰的原因可能与CAT酶相关。
此外, 可溶性蛋白是植物体内亲水性较强的有
机物, 能明显增加细胞的持水力, 束缚更多的水分
而保护自我。然而叶片在衰老的进程中, 不仅蛋白
水解酶的含量增加, 致使叶片中的Rubisco和叶绿素
a/b结合蛋白等叶绿体中的蛋白不断被降解, 而且蛋
白质的合成也会不断减少, 导致可溶性蛋白含量不
断减少, 因此蛋白质的含量特别是可溶性蛋白质含
量的下降是衡量叶片衰老的重要指标之一[1]。本研
究中 , 突变体osled和野生型3片叶片的可溶性蛋白
含量的总体趋势是不断减少, 而剑叶和倒二叶间则
差异不显著(图4-B), 究其原因可能是在水稻叶片衰
老初期, 可溶性蛋白含量减少缓慢[27,43]。至于突变体
剑叶中的可溶性蛋白质含量显著低于野生型(图4-B),
则可能是由于基因的突变, 导致基因调控网络紊乱[44]。
作为可溶性蛋白的抗氧化酶SOD, 在细胞内担负着
清除活性氧或其他过氧化物自由基, 保护膜系统的
重任; 而对于另一个重要抗氧化酶POD来说, 虽然
其作用并非专一, 但它的部分同工酶依然与植物细
胞膜脂过氧化息息相关, 是细胞防御活性氧毒害酶
系统的重要成员之一 , 不仅参与了清除过氧化物 ,
还能使MDA转变为正常的脂肪酸而降低MDA对植
物细胞的损害。研究已证实, 水稻剑叶在衰老的初
期, SOD活性和POD活性显著升高, 在抽穗7~10 d达
最高, 而后则持续下降。因此, 突变体osled衰老叶片
的POD活性(图3-B)和SOD活性(图3-C)显著增加的结
果进一步证实了前人的研究[43]。
叶片衰老是一涉及程序化细胞死亡的复杂系统
工程, 既受外部环境因子的影响, 也受内源激素及
众多基因的精细调控。研究表明, 转录因子、酶调
控因子、蛋白激酶或磷酸酶、信号因子、防御和胁
迫相关因子、代谢加工降解蛋白、生物合成类蛋白、
转运体、催化蛋白、结合蛋白和结构蛋白等均在叶
第 11期 赵晨晨等: 水稻叶片早衰突变体 osled的生理特征与基因定位 1953


片衰老的进程中起重要作用[45]。更深入的研究显示,
锌指蛋白转录因子[46]及 DNA 结合因子[47]还可以通
过与清除 ROS的 CAT酶互作, 进而调控叶片衰老。
本研究发现, OsLED基因定位区间存在 22个注释基
因, 分别编码转运体蛋白、未知表达蛋白、转录因
子蛋白、周期蛋白 F、锌指蛋白、DNA修复酶、DNA
结合蛋白、WD-40重复蛋白、类马铃薯糖蛋白和植
物果胶甲酯酶抑制蛋白, 目前这些基因均没有被定
位或克隆; 而 MDA 含量(图 4-A)、CAT 酶活性(图
3-A)分析及细胞组织化学染色(图 5)结果显示, 叶片
衰老与 ROS含量密切相关, 推测候选基因与 CAT酶
存在一定联系, 故本研究初步认为候选基因很可能
是诸如转录因子 LOC_Os03g43840 和 LOC_Os03g
43860, 或者 DNA结合蛋白基因 LOC_Os03g43810。
当然, 候选基因的最终确定要依赖于相关基因的测
序分析及遗传互补验证。
4 结论
osled是一个叶片从分蘖期就早衰的突变体。与
野生型 93-11 相比, 抽穗期突变体叶片中的叶绿素
总量显著下降, 衰老叶片叶肉细胞的细胞膜的完整
性已经受到损害或细胞已经死亡 , 叶绿体已经降
解。突变体叶片中自由基和 H2O2明显积累, 致使倒
二叶和倒三叶的 MDA 含量极显著升高; 而 CAT 活
性显著下降, 清除 H2O2 的能力也显著下降。然而,
在叶片衰老的初期, 突变体的 SOD 和 POD 活性显
著升高。osled 受 1 对隐性核基因控制, 该基因被定
位于第 3染色体长臂的 RM15528和 RM15553两个标
记之间, 其间含有 3个BAC克隆, 这将为进一步克隆
该基因并揭示叶片早衰的分子与生理机理奠定基础。
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