全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17 (3) : 279～ 281
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
白木千体细胞胚胎发生过程中过氧化物酶
及酯酶同工酶的研究Ξ
杨金玲
中 国 医 学 科 学 院
中国协和医科大学药物研究所　北京　100050
桂耀林　郭仲琛
(中国科学院植物研究所　北京　100093)
STUD IES ON PEROX IDASE AND ESTERASE ISOZYM E
PATTERNS D UR ING SOM AT IC EM BRYOGENESIS OF
P ICEA M E YER I REHD. ET W IL S.
Yang J in ling
( Institu te of M a teria M ed ica , T he Ch inese A cad emy of M ed ica l S ciences
and P ek ing U n ion M ed ica l Colleg e　Beijing　100050)
Gu i Yao lin　Guo Zhongchen
( Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences　Beijing　100093)
关键词　白　, 体细胞胚胎发生, 同工酶
Key words　P icea m ey eri, Som atic em bryogenesis, Isozym e
同工酶的多种分子形式的时间特异性和组织特异性在植物中普遍存在, 植物体内各种酶的同工酶
酶谱随着细胞分化、组织器官及植株的生长、成熟而发生规律性的变化。这种变化在一定程度上反映了
植物在发育过程中基因表达的时空顺序性, 因而同工酶的酶谱特征可以作为植物组织培养的一种生化
指标〔1, 2〕。有关被子植物组织培养中同工酶的变化已有不少报道〔3～ 7〕, 而对裸子植物却研究甚少。我们以
中国特有的针叶树种白　 (P icea m ey eri R ehd. et W ils. ) 的成熟胚为外植体, 诱导了体细胞胚胎发生并
得到再生植株〔8〕。在此基础上研究了胚性和非胚性愈伤组织及体细胞胚发育过程中过氧化物酶和酯酶
的变化, 以期探讨体细胞胚胎发生与同工酶变化之间的相关性。
1　材料和方法
白　 (P icea m ey eri R ehd. et W ils. )的球果采自中国科学院植物研究所植物园。
体细胞胚胎发生的诱导方法如前文〔8〕。
酶液制备及同工酶的测定: 取胚性、非胚性愈伤组织及不同发育时期的体细胞胚各 1 g, 分别置于预Ξ 收稿日: 1998206215, 修回日: 1998212217。第一作者: 女, 1970 年出生, 助理研究员 (博士) , 从事植物组织培养和分子生物学方面的研究。国家 863 资助项目 (86070502)。
先冰冻的研钵中, 加 011 mo löL T ris2HC l (pH 810) ∶20% 甘油= 4∶1 的酶提取液 1 mL , 冰浴中研磨成
匀浆, 0℃下 4 000 röm in 离心 15 m in, 取上清液备用。同工酶的测定采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳。
浓缩胶浓度为 3% , 分离胶浓度为 715%。染色参照吴少伯报道的方法〔9〕。
2　结果
根据外部形态特征及能否进一步分化, 可区别非胚性 (图版É : 1)和胚性愈伤组织 (图版É : 2)。胚性
愈伤组织的分化经过 4 个发育时期: (1)胚性胚柄团时期 (图版É : 2) ; (2) 球形至鱼雷形胚时期 (图版É :
3) ; (3)子叶出现期 (图版É : 4, 5) ; (4)体细胞胚成熟期 (图版É : 6)。
主要测定了胚性和非胚性愈伤组织中过氧化物酶和酯酶同工酶的差别及体细胞胚成熟过程的 4 个
时期中这 2 种同工酶的变化。
2. 1　过氧化物酶同工酶 (图版É : 7)
胚性和非胚性愈伤组织的酶谱有明显的不同。非胚性愈伤组织有 7 条酶带, 胚性愈伤组织有 12 条
酶带。两种愈伤组织有 6 条共有酶带: A 4、B 3、B 4、B 6、B 9、B 10, 但胚性愈伤组织这 6 条酶带的着色比非胚性
愈伤组织深。B 5 是非胚性愈伤组织特有的酶带, 较宽且着色很深。A 5、B 1、B 2 是胚性愈伤组织特有的酶
带,A 5、B 1 着色较浅,B 2 着色很深。
体细胞胚发育过程中的酶谱一共有 17 条酶带。第一时期有 12 条酶带, 其中A 4、B 2、B 7、B 9 着色深而
宽, 其余酶带着色浅而窄。随着体细胞胚的成熟, A 4、B 9 着色逐渐加深。B 2 至第二时期着色变得浅而窄,
第三时期完全消失, 第四时期又重新出现。第二时期比第一时期多 4 条酶带: A 1、A 2、A 3、B 8。体细胞胚继
续发育时,A 1、A 2、A 3 着色有变浅的趋势; 第三时期A 7、A 8 着色加深, 到第四时期又变浅; B 8 着色一直加
深, 直到体细胞胚发育成熟。第四时期B 1、B 3 突然加深且变宽。从整体变化趋势来看, 体细胞胚发育过程
中, 酶带着色逐渐加深。
2. 2　酯酶同工酶 (图版É : 8)
胚性和非胚性愈伤组织有 1 条共有的酶带A 1, 但非胚性愈伤组织的这条酶带着色较深。在B 1～B 3
区域两种愈伤组织都扩散的酶着色区。非胚性愈伤组织在B 4～B 5 区域也有扩散的酶着色区。
体细胞胚发育的第一时期仅有 1 条清晰酶带A 1。第二时期增加到 5 条: A 1、B 1、B 2、B 3、B 5, 其中A 1 比
第一时期加深且变宽。第三时期有 4 条酶带: A 1、A 2、B 2、B 5, 着色极浅, 且A 2、B 2 和B 5 都轻度扩散,A 2 是
这个时期特有的酶带。第四时期有 6 条酶带: A 1、B 1、B 2、B 3、B 4、B 5, 着色都较深。在体细胞胚的整个发育
过程中, 共有的酶带A 1 着色逐渐加深。酶带着色程度的整体变化规律也是逐渐加深。
3　讨论
胚性和非胚性愈伤组织在形态及细胞学上都有一定差异, 因而它们在同工酶水平上也一定存在差
异。徐桂芳等〔6〕对哈蜜瓜 4 种脱氢酶同工酶的研究结果表明, 长芽和不长芽愈伤组织中的 62磷酸葡萄糖
脱氢酶和苹果酸脱氢酶同工酶酶谱明显不同, 长芽愈伤组织中酶带较多且酶活性较强。 Kochba 等〔10〕在
柑桔的研究中也观察到胚性愈伤组织中过氧化物酶同工酶的活性大大强于非胚性愈伤组织。与上述结
果相似, 本实验在对白　的研究中发现, 胚性愈伤组织的过氧化物酶同工酶酶带着色较深, 活性较强, 这
可能意味着胚性愈伤组织有活跃的物质代谢和旺盛的生长潜力。但白　非胚性愈伤组织中的酯酶同工
酶活性比胚性愈伤组织高。总之, 胚性和非胚性愈伤组织在酶带数目或酶活性上都存在明显的差异, 因
此, 在同工酶水平上区分两类愈伤组织, 从而寻找与体细胞胚胎发生潜能有关的分子标记是可能的。
关于过氧化物酶同工酶的变化与形态发生的关系, 王亚馥等〔3〕、王熊和罗士韦〔4〕、白守信等〔5〕分别
在枸杞、烟草、豌豆的组织培养中进行过研究, 发现细胞分化在过氧化物酶同工酶酶谱变化上都有极其
细致的反映, 从而推断过氧化物酶同工酶可以作为组织培养过程的分化指标。通过对白　体细胞胚胎发
生过程中过氧化物酶同工酶的研究结果可以看出, A 4、B 9 是 2 条基础酶带, 在体细胞胚的 4 个发育时期
都存在且活性变化较小, 说明A 4、B 9 的结构基因的表达是体细胞胚形态建成各个时期所必需的。而其余
酶带随着发育的进程更叠地出现和消失, 反映了这些时期不同的生理状态的需要。依据酶带着色深浅推
082 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷　　
断, 过氧化物酶的活性在白　体细胞胚发育过程中逐渐增强。酯酶同工酶酶谱及其活性的变化趋势与过
氧化物酶基本一致。由此可见, 作为组织培养中形态建成的指标, 过氧化物酶及酯酶同工酶酶谱的变化
的确是有规律可循的。
参　考　文　献
1　路铁刚, 郑国钅昌. 体细胞胚胎发生的分子机制及生理生化研究进展. 植物学通报, 1989, 6 (4) : 197～ 204
2　杨和平, 程井辰. 植物体细胞胚胎发生的生理生化研究进展. 植物学通报, 1991, 8 (2) : 1～ 8
3　王亚馥, 王仑山, 陆卫等. 枸杞组织培养中过氧化物酶和可溶性蛋白质的变化. 实验生物学报, 1989, 22 (1) : 1～ 7
4　王熊, 罗士韦. 烟草组织培养过程中过氧化物同工酶的变化. 植物生理学报, 1981, 7 (1) : 73～ 82
5　白守信, 苏文辉, 梁红卫. 豌豆组织培养中器官的分化生长、过氧化物酶同工酶及核酸含量的变化. 西北植物学报,
1985, 5 (3) : 192～ 198
6　徐桂芳, 牛玉仙, 张静兰等. 哈蜜瓜子叶脱分化和再分化过程中几种脱氢酶同工酶的研究. 植物学报, 1983, 25 (2) :
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7　Shuban K R ,M enta A R. Changes in enzym e activity and isoperox idases in hap lo id tobacco callus during o rgano2
genesis. P lan t S ci L ett, 1982, 24 (1) : 67～ 77
8　杨金玲, 桂耀林, 杨映根等. 白　体细胞胚胎发生及其植株再生. 植物学报, 1997, 39 (4) : 315～ 321
9　吴少伯. 植物组织中蛋白质及同工酶的聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳. 植物生理学通讯, 1979 (1) : 30～ 33
10　Kochba J , L avee S, Sp iegel2Roy P. D ifferences in perox idase activity and isoenzym es in em bryogen ic and non2em 2
bryogen ic‘Shamouti’o range ovu lar callus lines. P lan t Cell P hy siol, 1977, 18 (2) : 463～ 467
“湖北省苔藓植物研究中心”成立
在湖北省内植物学界专家教授的热心关怀和大力支持下,“湖北省苔藓植物研究中
心”已于 1999 年 6 月 20 日在孝感师范高等专科学校正式挂牌成立。中心主任为黄天芳教
授, 副主任为姜益泉副教授和田春元讲师, 成员由陈银值、彭传宽、谢怀宇、向阳、尚杰、李
应超、吴建桥、金忠良、卢定军、赵立海、吴锋、时春涛共 12 人组成。本中心还特聘请中国科
学院武汉植物研究所郑重研究员、吴金清副研究员, 华中师范大学生命科学学院刘胜祥教
授、赵以军教授, 湖北大学生命科学学院王万贤教授、杨毅副教授、傅运生副教授, 湖北中
医学院刘合刚副教授, 湖北省药品检验所万定容副教授, 华中农业大学林学系姚崇怀副教
授, 黄冈师范学院项俊副教授共 11 人为顾问, 指导本中心的工作。
成立本中心的目的是为了尽快摆脱我省及华中地区苔藓植物研究相对落后的状况,
为科教兴鄂做一些前瞻性和基础性的工作。本中心的主要工作任务是: (1)湖北省苔藓植
物及其分布本底的研究; (2)湖北省苔藓植物区系特征及其与邻近地区关系的研究; (3)湖
北省特有、珍稀及濒危苔藓植物的种类及其分布与保护研究; (4)苔藓植物细胞、生理生化
及生态等方面的研究; (5)湖北省资源苔藓植物 (药用、工业用、园林绿化及环境监测等)的
开发利用, 包括药用苔藓植物的筛选, 草坪、园林绿化类苔藓植物的筛选, 敏感环境监测苔
藓植物筛选; (6) 组织编著《湖北省苔藓植物志》, 以及为我省培养苔藓植物研究方面的专
门人才等。
(田春元　姜益泉　黄天芳)
182　第 3 期　　　　　　　　杨金玲等: 白　体细胞胚胎发生过程中过氧化物酶及酯酶同工酶的研究
杨金玲等: 白　体细胞胚胎发生过程中过氧化物酶及酯酶同工酶的研究 图版É
Yang J in ling et a l. : Studies on perox idase and esterase isozym e pat tern s du ring
som atic em b ryogenesis of P icea m ey eri R ehd. et . W ils. P la te É
1. 非胚性愈伤组织 (a) ; 2. 胚性愈伤组织, 即胚性胚柄团时期 (b) ; 3. 球形及鱼雷形胚时期 (c) ; 4, 5. 子叶出现期 (d) ;
6. 体细胞胚成熟期 (e) ; 7. 过氧化物酶同工酶酶谱; 8. 酯酶同工酶酶谱
1. N on2em bryogen ic callus ( a ) ; 2. Em bryogen ic callus, nam ely the stage of em bryogen ic suspenso r m asses ( b ) ;
3. Globu lar and to rpedo2shaped em bryo stage (c) ; 4, 5. Co tyledonary em bryo stage (d) ; 6. M atu re em bryo stage (e) ; 7.
Perox idase isozym e pattern; 8. E sterase isozym e pattern