全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(7): 1205−1212 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目 (31360190), 国家现代农业产业技术体系建设专项 (CARS-22)和中央高校基本科研业务费专项
(XDJK2014C065)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 余茂德, E-mail: yumd@163.com, Tel: 023-68250191
第一作者联系方式: E-mail: lcyswu@163.com
Received(收稿日期): 2013-11-21; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-04-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140409.1117.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01205
桑树 EIN2基因的分离与表达
刘长英 1 吕蕊花 1 朱攀攀 1 范 伟 1 李 军 1 王晓红 1 李镇刚 2
王茜龄 1 赵爱春 1 鲁 成 1 余茂德 1,*
1 西南大学生物技术学院 / 西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400715; 2 云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所, 云南
蒙自 661101
摘 要: EIN2 是植物体内乙烯信号转导的中心元件, 负责将乙烯信号由内质网传递到细胞核中。本文通过检索桑树
基因组数据, 获得一个 EIN2候选基因(MaEIN2), 并进行生物信息学分析和表达分析。MaEIN2全长 5614 bp, 由 7个
外显子和 6 个内含子组成, 包含 3921 bp 的 CDS, 编码 1036 个氨基酸残基。MaEIN2 在进化树中与草莓、桃树等双
子叶植物的 EIN2蛋白关系较近, 与单子叶植物关系较远。MaEIN2在老叶和成熟果实中的表达量分别高于在幼叶和
幼果中, 且随果实发育呈逐渐上升趋势, MaEIN2可能与器官的成熟衰老有关。选用乙烯利、ABA和 NaCl处理桑树
种苗, 乙烯利能够促进 MaEIN2的表达, 而 ABA和 NaCl抑制 MaEIN2的表达。本文为深入研究 MaEIN2基因的功能
奠定了基础。
关键词: 桑树; MaEIN2; 表达分析; 乙烯利; ABA; NaCl
Isolation and Expression of Mulberry (Morus alba L.) EIN2 Gene
LIU Chang-Ying1, LÜ Rui-Hua1, ZHU Pan-Pan1, FAN Wei1, LI Jun1, WANG Xiao-Hong1, LI Zhen-Gang2,
WANG Xi-Ling1, ZHAO Ai-Chun1, LU Cheng1, and YU Mao-De1,*
1 College of Biotechnology, Southwest University / State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China; 2 Institute of
Sericulture and Apiculture, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Mengzi 661101, China
Abstract: EIN2 is a central component of ethylene signaling pathway, transferring the ethylene signal from endoplasmic reticu-
lum to nucleus. A putative EIN2 gene obtained from Morus Genome Database and its expression levels were detected by using
RT-PCR. The full-length genomic sequence of MaEIN2 is 5614 bp in length, which consists of seven exons and six introns. The
CDS of MaEIN2 is 3921 bp and encodes 1036 amino acids. Phylogenetic tree analysis revealed that MaEIN2 had closer relation-
ships with dicotyledons plants and further with monocotyledons plants. The expression levels of MaEIN2 in old leaf and mature
fruit were much higher than these in young leaf and immature fruit. The expression levels of MaEIN2 was increasing gradually in
fruit development, indicating MaEIN2 was involved in the ripening and senescence of plant organs. Ethephon, ABA and NaCl
were used to incubate the mulberry seeds, showing that ethephon induced the expression of MaEIN2 in seedlings, while ABA and
NaCl downregulated the expression of MaEIN2. This work lays a foundation for further understanding of the function of MaEIN2.
Keywords: Mulberry; MaEIN2; Expression analysis; Ethephon; ABA; NaCl
乙烯是一种重要的植物激素, 广泛参与植物生
长发育和衰老的整个生长周期, 包括种子萌发、实
生苗生长、叶片伸展、花蕾开放和衰老脱落以及果
实后熟等[1]。乙烯同时还是一种信号分子, 参与植物
对逆境的应答[2]。乙烯在植物中的生物学效应主要
通过其生物合成和信号转导两方面来实现。对拟南
芥的研究表明, 乙烯信号的转导主要是通过 ETR、
EIN2、EIN3/EIL和 ERF四级元件。乙烯信号进入细
胞后, 位于内质网上乙烯受体(ETR1、ETR2、ERS1、
ERS2 和 EIN4)能够与乙烯结合, 使 CTR1 失活, 并
1206 作 物 学 报 第 40卷
将信号传递给 EIN2, 再传递到位于细胞核的 EIN3/
EIL和 ERF, 最终调控乙烯相关蛋白的表达[3-4]。
EIN2 元件被认为是将乙烯信号由内质网传递
到细胞核的中间“桥梁”。在缺乏乙烯信号时, 负调
控元件 CTR1 磷酸化修饰 EIN2, 阻止 EIN2 传递信
号; 当 ETR接收到乙烯信号后, CTR1的失活会导致
EIN2 去磷酸化, 其 C 末端(CNED)被切割下来进入
细胞核, 实现信号的传递[5-6]。此外, 当 EIN2功能缺
失时, 植物体对乙烯不敏感[7]。因此, EIN2被认为是
乙烯信号转导的中心元件, 不仅如此, 也被认为可
能参与不同激素信号途径, 以及响应生物或非生物
胁迫[7-9]。
桑树(Morus alba L.)既是家蚕的主要饲料, 还有
生态学功能、药用、食用等多种用途的非绢丝开发
价值。长期以来由于桑树在分子生物学方面的研究
相对滞后, 有关桑树乙烯信号转导方面的研究还未
见报道。本研究利用最新公布的桑树基因库(http://
morus.swu.edu.cn/morusdb/)数据, 获得了一个 EIN2
同源基因, 并对初步研究该基因的功能, 以期为深
入探讨桑树的乙烯信号转导提供了参考依据。
1 材料与方法
1.1 MaEIN2基因的信息学分析及鉴定
从 NCBI数据库搜索已登录的 EIN2基因序列, 与
桑树基因组数据库中的序列比对分析, 获得候选基因,
经过 BlastN和 Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/)
预测, 得到一个 EIN2 同源基因, 在桑树基因组数据
库中的编号为 Morus024376。利用 Genetyx-Ver. 7、
MEGA 4.1、ProtParam 等不同的生物软件对获得的
序列进行生物信息学分析。
1.2 乙烯利、ABA和 NaCl处理桑树种苗
选用桑树品种桂优 62, 种子经 ddH2O浸泡 24 h
后, 均匀地铺在消毒湿润滤纸上, 在 24℃下培养 5 d。
用不同浓度的乙烯利、ABA 和 NaCl 溶液处理预培
养的种子, 每处理 50粒, 设 3次重复, 对照用 ddH2O
处理。乙烯利组处理 5 d, ABA组处理 3 d, NaCl组
处理 4 d。其后分别测量种苗的根、茎长度, 并求平
均值。随即用解剖刀将种苗的根、茎剖开, 分别收
集于离心管中, 经液氮速冻后存于–80℃冰箱备用。
1.3 RNA的提取及 cDNA第 1链的合成
按照 TaKaRa公司 RNA抽提试剂盒说明书提取
总 RNA。分别取适量体积 RNA用 1%的琼脂糖凝胶
电泳检测, 并用紫外分光光度计检测总 RNA 的浓
度。总 RNA 经 DNA 酶消化后 , 参照反转录酶
M-MLV (TaKaRa)说明书, 以随机引物为引物, 合成
cDNA第 1链, 存于–20℃备用。
1.4 定量 PCR检测 MaEIN2基因的表达量
使用南京金斯瑞公司网站在线软件设计
MaEIN2基因的 qRT-PCR引物 MaEIN2-qF: 5-TGAT
TCCATGGGCAACTAA-3和 MaEIN2-qR: 5-AATTC
CTTTGCGGTGGTATC-3。使用定量 PCR试剂 SYBR
Premix Ex Taq II (TaKaRa), 反应体系为 Premix Ex
Taq II (2×) 10 μL, 10 μmol L–1上下游引物各 0.8 μL,
50×ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL, cDNA 2 μL和
无菌双蒸水 6 μL。qRT-PCR程序为 95℃预变性 30 s;
94℃变性 5 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸 10 min, 扩增
40 个循环, 并以 MaACT2 基因(引物为 MaACT2-qF:
5-GCATGAAGATCAAGGTGGTG-3和 MaACT2-qR:
5-CATCTGCTGGAAGGTGCTAA-3)为内参。利用
2–ΔΔCT法计算基因的相对表达量。
1.5 MaEIN2基因组织表达分析
选取桑树新品种长江1号(重庆市审定)健壮植
株的根、表皮、韧皮部、托叶、叶柄、叶片和不同
发育时期的果实(果实分别取于盛花期后10、20、29、
36和40 d)等组织材料, 9:00至10:00采样, 立即放入
装有液氮的冰盒, 经速冻后存于–80℃冰箱中备用。
分别提取其总RNA, 经DNA酶消化后, 以反转录得
到的cDNA第1链为模板, 进行定量PCR分析。
2 结果与分析
2.1 MaEIN2基因的结构
通过与桑树基因组数据比对, 获得了一个 EIN2
同源基因, 该基因的 DNA全长 5614 bp, mRNA编码
序列为 3921 bp, 含 7个外显子和 6个内含子(图 1),
该基因编码 1036个氨基酸(图 2)。ProtParam在线预测
MaEIN2 基因编码蛋白质的相对分子量为 142.61 kD,
理论等电点为 5.72, 其化学式推测为 C6366H9976N1702
O1912S52。EIN2的 N末端位于内质网膜上, 当接收上
游元件传递的乙烯信号后, 其 CNED区被切割下来,
在 NLS 的作用下进入细胞核, 并将信号传递给下游
元件[10-12]。经过 Smart在线软件分析, 编码序列中第
13~第 457位氨基酸含有 13个跨膜结构, 其中第 38~
第 391 个氨基酸区域为类 Nramp 蛋白结构域(图 1),
表明 MaEIN2 蛋白可能分布在内质网膜上参与乙烯
信号的传递。将 MaEIN2 氨基酸序列与拟南芥
(Arabidopsis thaliana)和蒺藜状苜蓿(Medicago trun
第 7期 刘长英等: 桑树 EIN2基因的分离与表达 1207
图 1 MaEIN2基因序列及其编码蛋白分析
Fig. 1 Sequence analysis of MaEIN2 and predicted protein
catula)的 EIN2 氨基酸序列进行比对, MaEIN2 的蛋
白序列相对较为保守。经过序列比对分析 , 预测
S645和 F646之间为信号切割点, S645以后的序列为
CNED区; L1271~L1278的序列被预测为核定位信号
(NLS), MaEIN2蛋白的第 1275位的氨基酸为亮氨酸
(L), 不同于拟南芥和苜蓿中的赖氨酸(K)(图 1)。
2.2 MaEIN2基因的同源性与进化
从 NCBI 数据库搜索拟南芥(Arabidopsis thali-
ana)、草莓(Fragaria ananassa)、葡萄(Vitis vinifera)、
蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)等 15个物种的 18
个 EIN2基因, 氨基酸序列同源性分析表明, MaEIN2
与蔷薇目(Rosales)植物草莓(XP_004306246.1)、桃树
(Prunus persica, ACY78397.1)的 EIN2蛋白同源性分
别为 64%和 71%, 与豆科(Leguminosae)植物蒺藜状
苜蓿 (ACD84889.1)、鹰嘴豆 (Cicer arietinum, XP_
004493976.1)的同源性分别为 59%和 61%, 与十字
花目 (Brassicales)植物拟南芥 (AAD41077.1、NP_
195948.1)、金虎尾目(Malpighiales)植物杨树(Populus
trichocarpa, XP_002322882.1、XP_002326185.1)的同
源性为 56%、56%、65%和 65%, 与茄目(Solanales)
植物矮牵牛(Petunia hybrida, AAR08678.1)、葡萄目
(Vitales)植物葡萄(Vitis vinifera, XP_002276399.1)、
葫芦目(Cucurbitales)植物甜瓜(Cucumis melo, ADV
90799.1)、锦葵目 (Malvales)植物可可树 (Theobroma
cacao, EOY07851.1)的同源性为 56%、68%、63%和 66%,
与禾本目 (Poales)植物节节麦 (Aegilops tauschii,
EMT14855.1)、乌拉尔图小麦(Triticum urartu, EMS6
1209.1)、二穗短柄草 (Brachypodium distachyon,
XP_003575571.1)、玉米(Zea mays, DAA52816.1)、
水稻(Oryza sativa, AAQ95276.1、BAD31350.1)的同
源性为 38%、39%、41%、44%、44%和 42%。结果
显示, MaEIN2基因编码氨基酸序列与双子叶植物的
同源性普遍较高, 均在 50%以上, 而与禾本科植物
的同源性较低, 均在 40%以下。
分析 MaEIN2 与拟南芥、草莓、水稻等植物的
MaEIN2基因编码氨基酸序列发现, MaEIN2与草莓、
桃树、杨树等物种进化距离较近, 而与水稻、玉米
等物种进化距离较远。以 MaEIN2 与其他物种的
EIN2 基因编码氨基酸序列比对为基础, 构建 NJ 进
化树, 以分析它们的进化关系。参照进化树的构型,
可将整个进化树划为 2个亚群(图 3)。其中 I类包含
草莓、牡丹、葡萄、桑树、拟南芥等植物; II类包括
玉米、水稻等植物。表明双子叶植物和单子叶植物
的乙烯信号转导在进化上可能存在一定差异。
2.3 MaEIN2基因在不同组织中的表达
使用定量 PCR技术检测 MaEIN2基因表达量显
示, 其在根和幼叶中的表达量微弱, 在其他组织中
都有一定的表达(图 4)。MaEIN2 基因在成熟叶片中
的表达量显著高于在幼叶中, 同时 MaEIN2 基因随
果实的发育呈上升趋势, 果实发育后期的表达量明
显高于发育初期, 表明乙烯信号转导对于植物器官
的成熟衰老具有重要的作用。
1208 作 物 学 报 第 40卷
图 2 MaEIN2全长 cDNA序列及推导氨基酸序列
Fig. 2 Full-length cDNA and cDNA-derived amino acid sequences of MaEIN2
2.4 乙烯利、ABA和 NaCl对桑树幼苗发育的影响
使用乙烯处理植物幼苗可诱发乙烯信号的传递,
使幼苗表现出“三重反应”的特征, 乙烯信号元件
也能够响应 ABA和 NaCl的处理。以乙烯利、ABA
和 NaCl 处理后, 幼苗的生长势受到抑制(图 5)。根
和茎的长度随试剂浓度的增加呈逐渐下降的趋势
(图 6)。在乙烯利和 ABA 处理组中, 根对茎的比值
随着处理浓度的增加逐渐升高, 表明根和茎对乙烯
利和 ABA的响应有一定的差异。NaCl处理组中, 根
茎比接近 1, 不同浓度处理种苗并没有引起根茎比
显著变化, 表明种苗对盐胁迫的响应与对乙烯利和
ABA的响应有所不同。
2.5 乙烯利处理幼苗后 MaEIN2 基因在不同组
织中的表达
将经乙烯利处理后的幼苗根和茎分离, 分别提
取 RNA并合成 cDNA用于检测MaEIN2基因的相对
表达量。用 100 mg L–1乙烯利处理幼苗后, 结果显
示乙烯利提高了 MaEIN2 基因的表达量, 随着处理
时间的延长, MaEIN2 基因在茎中的表达呈上升趋势,
而在根中的表达呈先增后降的趋势。随着乙烯利处
理浓度的上升, MaEIN2基因在根和茎中的表达量都
呈逐渐上升的趋势(图 7)。
第 7期 刘长英等: 桑树 EIN2基因的分离与表达 1209
图 3 MaEIN2与其他植物 EIN2的 Neighbor-Joining系统进化树
Fig. 3 Neighbor-Joining tree of MaEIN2 and EIN2 of other species
图 4 MaEIN2组织表达分析
Fig. 4 Expression of MaEIN2 gene in various mulberry tissues
1~6分别表示根, 茎, 茎表皮, 叶柄, 幼叶和成熟叶; 7~11分别表
示盛花期后 10、20、29、36和 40 d。数据为 3次重复的平均值
±标准差, 处理间达显著差异(P<0.05)用不同字母表示。
1–6 indicate root, stem, stem epidermis, petiole, immature leaves,
and mature leaves, respectively; 7–11 indicate 10 DAF, 20 DAF, 29
DAF, 36 DAF, and 40 DAF, respectively. Data are means ± SD of
three replicates. Significant differences (P<0.05) among treatment
are marked with different letters above bars.
2.6 ABA和 NaCl处理幼苗后MaEIN2基因在不
同组织中的表达
经 ABA和 NaCl处理种苗后, MaEIN2基因在不
同组织中的表达模式与乙烯利处理结果存在明显差
异。ABA 和 NaCl 处理组种苗中 MaEIN2 的表达都
受到抑制, 并随处理浓度的升高而逐渐降低(图 8)。
3 讨论
ETR、CTR1 和 EIN2 都位于内质网膜上, 内质
网是响应和传递乙烯信号最关键的细胞器, 而 EIN2
是内质网和细胞核之间乙烯信号交流的“节拍器”[5]。
EIN2基因的表达对于植物营养生长、成熟衰老和胁
迫响应也有重要意义[7,13]。我们利用最新发布的桑树
基因组序列, 获得了一个 EIN2候选基因, 并对 EIN2
进行了生物信息学分析。该基因的 DNA 全长 5614
bp, mRNA编码序列为 3921 bp, 编码 1036个氨基酸
残基, 与草莓、桃树等双子叶植物的同源性较高, 与
单子叶植物的 EIN2蛋白同源性较低。通过对其蛋白
质的结构和活性位点的预测, 我们认为该候选基因
为 EIN2基因, 命名为 MaEIN2。
乙烯被认为是植物器官的成熟和衰老的关键因
子之一[14]。对 MaEIN2 的组织表达分析结果显示,
MaEIN2 在老叶中的表达量显著高于在幼叶中; 在
成熟果实中的表达显著高于在幼果中, 且随果实发
育呈逐渐上升的趋势。表明乙烯信号转导可能随着
组织的生长发育及成熟而活跃, 并调控营养器官的
成熟衰老。鉴于 EIN2作为乙烯信号转导过程中关键
元件, 抑制番茄 LeEIN2基因的表达能够下调番茄成
熟相关基因的表达并延缓果实的后熟软化[15], 这为
基因工程改造植物并延缓其衰老提供了新思路。目
前有关延缓营养器官(如果实)衰老的基因改造, 主
要是通过抑制乙烯合成基因表达的方法实现的[16-17],
但仅为部分抑制, 转基因植株也会合成一定量的乙
烯, 且环境中的外源乙烯也会对植株产生影响。而
乙烯信号转导途径被认为是乙烯调控植物体生长发
育的主要途径, 该途径中一些基因的突变有可能彻
1210 作 物 学 报 第 40卷
图 5 乙烯利、ABA和 NaCl处理种苗的表型
Fig. 5 Phenotypes of seedlings treated with ethephon, ABA, and NaCl
图 6 乙烯利、ABA和 NaCl处理种苗根茎长度
Fig. 6 Length of seedlings root and stem treated with ethephon, ABA, and NaCl
A: 根和茎的平均长度; B: 根和茎长度的比值。数据为 3次重复的平均值±标准差, 处理间达显著差异(P<0.05)用不同字母表示。
A: mean length of root and stem; B: ratio of root/stem. Data are means ± SD of three replicates. Significant differences (P<0.05) among
treatment are marked with different letters above bars.
底阻断植株对乙烯的反应。因此, 对 EIN2的功能研
究, 可为今后从基因水平上改造农作物提供参考。
乙烯对于种子萌芽和幼苗发育有很重要的调控
作用, 施用外源乙烯刺激植物会表现出“三重反应”
的特征, 即抑制茎的伸长生长、促进茎或根的增粗
和使茎横向生长[18-19]。本试验中, 添加乙烯利处理
预培养 5 d 的种子, 幼苗的生长势受到了显著的抑
制, 根和茎的长度随着所加试剂浓度的增加, 都呈
现逐渐下降的趋势, 且根/茎比随着处理浓度的增加
而逐渐升高。该结果与模式植物拟南芥的研究结果
相似。进一步检测乙烯利处理幼苗对 MaEIN2 基因
表达量的影响, 结果显示乙烯利提高了 MaEIN2 基
因的表达量, 随着处理时间的延长, MaEIN2基因在
茎中的表达呈上升趋势, 而在根中的表达却呈先增
第 7期 刘长英等: 桑树 EIN2基因的分离与表达 1211
图 7 MaEIN2在乙烯利处理种苗中的表达分析
Fig. 7 Expression of MaEIN2 gene in seedlings treated with ethephon
数据为 3次重复的平均值±标准差, 处理间达显著差异(P<0.05)用不同字母表示。
Data are means ± SD of three replicates. Significant differences (P<0.05) among treatment are marked with different letters above bars.
图 8 MaEIN2在 ABA和 NaCl处理种苗中的表达分析
Fig. 8 Expression of MaEIN2 gene in seedlings treated with ABA and NaCl
数据为 3次重复的平均值±标准差, 处理间达显著差异(P<0.05)用不同字母表示。
Data are means ± SD of three replicates. Significant differences (P<0.05) among treatment are marked with different letters above bars.
后降的趋势。随着乙烯利浓度的上升, MaEIN2基因
在根和茎中的表达量都呈逐渐上升的趋势。以上结
果暗示 MaEIN2基因能够响应乙烯利的调控。
当植物受到干旱和盐胁迫的作用时, 其发育会
受到抑制, 并导致细胞的活性氧(ROS)浓度上升, 同
时 ABA 也会参与植物体对胁迫的响应[20-21]。EIN2
基因的表达量在盐胁迫作用下会被下调, ein2 拟南
芥突变体在盐胁迫作用下生长受到的抑制要比野生
型更显著, 表明 EIN2 参与了植物的胁迫响应途径,
其表达量的降低可能是植物适应胁迫的表现[21-22]。
1212 作 物 学 报 第 40卷
此外, 拟南芥幼苗经 ABA处理后, EIN2基因的表达
量被下调, 同时 EIN2 基因的突变会改变 ABA 响应
基因 RD29B (植物响应胁迫的标志基因)的表达, 因
此 EIN2蛋白可能依赖于 ABA响应途径调控植物对
胁迫的响应[21]。本试验中, 使用不同浓度的 NaCl和
ABA 处理桑树幼苗后, 幼苗的生长受到明显的抑制,
MaEIN2基因的表达量随着 NaCl和 ABA浓度的升高
都呈现逐渐降低的趋势, 也印证了此前的报道[20-22]。
Lei 等[22]研究证实 EIN2 可能与一个含 MA3 结构域
的蛋白 ECIP1互作调控对盐胁迫反应, 但 EIN2是如
何调控植物对盐胁迫的响应还有待进一步研究。
4 结论
从桑树中获得 MaEIN2 基因, 基因组序列全长
5614 bp, 由 7 个外显子和 6 个内含子组成, 包含
3921 bp CDS, 编码 1036 个氨基酸, 与双子叶植物
EIN2 基因的同源性高于单子叶植物。MaEIN2 在老
叶和成熟果实中的表达量分别高于在幼叶和幼果中,
可能与器官的成熟衰老有关。乙烯利能够促进
MaEIN2的表达, 而 ABA和 NaCl抑制 MaEIN2的表
达。
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