全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(8): 11911200 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2014AA10A603), 比尔盖茨基金(OPP51587)和中国农业科学院科技创新工程资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 石英尧, E-mail: shiyy123@163.com, Tel: 0551-65786213; 周永力, E-mail: zhouylcaas@126.com
第一作者联系方式: E-mail: hudandan_ahau@163.com, Tel: 18515197530
Received(收稿日期): 2015-01-08; Accepted(接受日期): 2015-05-04; Published online(网络出版日期): 2015-06-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150603.0901.012.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01191
胁迫相关蛋白激酶基因 OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应
胡丹丹 1,2 张 帆 2 黄立钰 2 卓大龙 1,2 张 帆 2 周永力 2,*
石英尧 1,* 黎志康 2
1安徽农业大学农学院, 安徽合肥 230036; 2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶 SnRK2, 又称胁迫相关蛋白激酶(stress-activated protein kinase genes in rice,
OsSAPKs), 在调控水稻非生物胁迫信号传导中起着重要作用。本研究对 OsSAPK2 的结构及其在水稻抗白叶枯病反
应中的功能进行了初步研究。结果表明 OsSAPK2被定位于细胞核和细胞质内, 与 OsSAPK1、OsSAPK3同属于 Kulik’s
II 组。OsSAPK2-RNAi 转基因水稻中 OsSAPK2 下调表达, 人工接种水稻白叶枯病菌后, 转基因水稻比受体对照的病
斑长度显著增长, 抗病相关基因 OsLRR1、OsHIR1 表达水平下降, 感病相关基因 OsMAPK5 表达水平升高。此外,
OsSAPK2具有自激活活性, 可能与 OsMAPK5等胁迫相关蛋白互作。上述结果为进一步研究 OsSAPK2调控水稻抗白
叶枯病的分子机制提供了信息。
关键词: OsSAPK2; 水稻; 白叶枯病; RNA干扰
Stress-activated Protein Kinase OsSAPK2 Involved in Regulating Resistant
Response to Xanthomonas oryzae pv. oryzae in Rice
HU Dan-Dan1,2, ZHANG Fan2, HUANG Li-Yu2, ZHUO Da-Long1,2, ZHANG Fan2, ZHOU Yong-Li2,*, SHI
Ying-Yao2,*, and LI Zhi-Kang2
1 College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences,
Beijing 100081, China
Abstract: Sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 (SnRK2), also known as stress-activated protein kinase (OsSAPKs),
plays an important role in signal transduction. In this study, we analyzed the structure and function of OsSAPK2 in response to
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) infection. The result suggested that OsSAPK2 is a member of Kulik’s II group like Os-
SAPK1, OsSAPK3 and located in nucleus and cytoplasm. OsSAPK2 and disease-resistant genes OsLRR1, OsHIR1 were down
regulated in OsSAPK2-RNAi transgenic rice, while disease-related gene OsMAPK5 was up regulated. Compared with
non-transgenic plants, transgenic plants were more susceptible to Xoo infection. OsSAPK2 could activate itself and interact with
several stress-related proteins. These results indicate that OsSAPK2 might be involved in the regulation of resistance response by
regulating the expression of OsLRR1, OsHIR1, OsMAPK5 and interacting with stress-related proteins.
Keywords: OsSAPK2; Oryza sativa; Bacterial blight; RNAi
植物在整个生长发育过程中受多种外界环境的
影响, 包括病原菌的侵染生物胁迫以及干旱、寒冷、
高盐等非生物胁迫。经过长期进化, 植物发展出响
应不同环境胁迫的适应机制 [1], 能够识别外界胁迫
信号, 将信号传递到不同的信号元件中, 迅速做出
一系列防御反应。其中, 蛋白质的可逆磷酸化(主要
通过蛋白激酶和磷酸酶发挥作用)是高等植物重要
的信号转导方式之一[2-3]。
蔗糖非酵解型蛋白激酶(sucrose non-fermenting1-
related protein kinase, SnRK)是一类广泛存在于植物
中的蛋白激酶, 包括 SnRK1、SnRK2和 SnRK3三个
亚家族, 参与糖代谢途径并对干旱及盐胁迫等多种
1192 作 物 学 报 第 41卷


渗透逆境有应答作用[4]。SnRK2家族是植物中一类特
异的 Ser/Thr类蛋白激酶, 分为 3组, Kulik’s I组, 激
酶不受 ABA 激活; Kulik’s II 组, 受 ABA 微弱激活;
Kulik’s III组, ABA能够完全激活该家族成员[5]。通过
生物信息学分析与试验相结合, 已从众多物种的基
因组数据库中鉴定出大量的 SnRK2 家族成员。拟南
芥、水稻和高粱中均含有 10 个 SnRK2 家族成员[6-8],
玉米中有 11 个 SnRK2 家族成员[9], 烟草、小麦、大
豆等作物基因组中也鉴定出一些 SnRK2基因[10,11-16]。
Mikołajczyk等[16]研究发现烟草BY-2悬浮细胞渗透胁
迫可以激活渗透胁迫激活蛋白(NtOSAK)。大豆中的
SnRK2成员 SPK1和 SPK2可以被高渗透逆境诱导激
活, 而 SPK3和 SPK4可被脱水和高盐激活, SPK3还可
以被外源 ABA 激活[17]。水稻基因组中包括 SnRK2s
家族 10个基因, 被命名为 OsSAPK1-10 (stress-activated
protein kinase genes in rice, OsSAPKs), 这 10个 SnRK2
成员均可被 NaCl 所诱导激活, 其中 SAPK8、SAPK9
和 SAPK10 可以被 ABA 激活 [6]。近年来 SnRK2 基
因家族参与调控植物非生物胁迫反应的报道越来
越多 [18-20], 但其在生物胁迫中的功能鲜有报道。
由 Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)引起的
水稻白叶枯病是我国和亚洲其他国家稻作栽培中一
种重要的细菌病害, 在我国华南、华中和华东地区,
以及东南亚稻区和非洲稻区普遍发生[21-22]。本实验
室前期对 OsSAPK 基因家族的研究中初步发现不同
水稻品种接种白叶枯病菌后, OsSAPK2 表达水平存
在明显差异[23]。本研究利用 RNAi技术对 OsSAPK2
(LOC_Os07g42940)进行抗病功能验证, 通过蛋白序
列分析 , 酵母双杂交和荧光定量 PCR 技术分析
OsSAPK2互作蛋白和部分已知抗病相关基因的表达
水平, 初步探讨了 OsSAPK2参与调控水稻抗白叶枯
病的分子机制。
1 材料与方法
1.1 供试菌株与载体
根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)菌株
EHA105、白叶枯病菌菌株 PXO61(P1)、KS6-6(C2)
均由本实验室保存。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株
DH5α 购于北京全式金公司。根瘤农杆菌(Agrobac-
terium tumefaciens) EHA105、酵母 (Saccharomyces
cerevisiae)菌株 AH109 由本实验室保存。实验所用
载体 pDONR201、pH7GWIWG2(II)购于 Invitrogen
公司, pGBKT7购于 Clontech公司。
1.2 OsSAPK2基因表达载体的构建
根据 NCBI 在线 BLAST 对水稻基因 LOC_
Os07g42940 (OsSAPK2)序列进行分析 , 选择其中
705 bp 的特异核苷酸序列作为 RNAi 干扰区段。根
据特异核苷酸序列设计引物 SAPK2-RNAi-F/SAPK2-
RNAi-R (表 1), PrimeSTAR PCR扩增 OsSAPK2干扰
区段, 以 Gateway 技术构建 RNAi 抑制表达载体
(pH7GWIWG2(II)-OsSAPK2; 图 1-A)。
根据参考序列日本晴 OsSAPK2 序列 , 利用
Primer 5.0设计引物 SAPK2-EcoRI-F/SAPK2-BamHI-
R (表 1), PrimeSTAR PCR扩增获得OsSAPK2编码区
序列 1020 bp, 以酶切连接方法构建酵母双杂交诱饵
表达载体(pGBKT7-OsSAPK2; 图 1-B)。

图 1 OsSAPK2基因 RNAi表达载体、酵母双杂交诱饵载体和 GFP融合载体示意图
Fig. 1 Construction of RNAi, prey protein vector of Y2H, and GFP fused vector of OsSAPK2
A: OsSAPK2 RNAi载体; B: OsSAPK2基因诱饵蛋白表达载体; C: OsSAPK2基因 GFP融合表达载体。
A: construction of OsSAPK2-RNAi vector; B: construction of OsSAPK2 prey protein vector; C: construction of GFP-OsSAPK2.

第 8期 胡丹丹等: 胁迫相关蛋白激酶基因 OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应 1193


表 1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
序列
Sequence information (53)
用途
Purpose
SAPK2-RNAi-F ACAGGTCACTGAGGCATCCG OsSAPK2 RNAi 片段克隆
SAPK2-RNAi-R CCTGTGACGGGGTGTTGATG Clone the RNAi sequence of OsSAPK2
SAPK2-ECORI-F GATC GAATTCATGGAGAGGTACGAGGTGATCAA OsSAPK2 片段克隆
SAPK2-BamHI-R GATC GGATCCTCACAATGCGCACACGAAGTC Clone the sequence of OsSAPK2
SAPK2-CDS-F ATGGAGAGGTACGAGGTGATCAA OsSAPK2 片段克隆
SAPK2-CDS-R TCACAATGCGCACACGAAGTC Clone the sequence of OsSAPK2
Hpt-F CTATTTCTTTGCCCTCGGAC 标记基因检测
Hpt-R CCTGCCTATTGCATCTCCC Detection of the maker gene
Actin-F GACTCTGGTGATGGTGTCAGC 定量 PCR
Actin-R GGCTGGAAGAGGACCTCAGG Quantitative PCR
SAPK2-RT-F AGCGGCGACTTCGTGTG 定量 PCR
SAPK2-RT-R AGGGAAGCAGGCAGGAC Quantitative PCR
03g55560-F GGGAAAGAAAGAGCGGAAGA 定量 PCR
03g55560-R GGTGGAGGCGGATGAGGA Quantitative PCR
08g30790-F GGATGGCAGGGAATGGA 定量 PCR
08g30790-R TTTTGCCTAAGTTTTTATCTCAC Quantitative PCR
01g59440-F GCTGTTTGTCGGCAATGAA 定量 PCR
01g59440-R ATAACACAGGGAAGCGTGATAA Quantitative PCR
SPS- F TTGCGCCTGAACGGATAT 定量 PCR
SPS- R CGGTTGATCTTTTCGGGATG Quantitative PCR
Hpt-RT-F CTATTTCTTTGCCCTCGGACGA 定量 PCR
Hpt-RT-R GGACCGATGGCTGTGTAGAAG Quantitative PCR

根据参考序列日本晴 OsSAPK2 序列 , 利用
Primer 5.0 设计引物 SAPK2-CDS-F/SAPK2-CDS-R
(表 1), PrimeSTAR PCR扩增获得OsSAPK2编码区序
列 1020 bp, 以 Gateway技术构建 GFP-OsSAPK2融
合表达载体(pMDC43-OsSAPK2; 图 1-C)。
1.3 OsSAPKs序列分析及 OsSAPK2亚细胞定位
水稻、玉米、拟南芥、马铃薯和白杨 SnRK2家
族成员蛋白序列来自 http://www.uniprot.org/, 利用
Cluster W进行序列比对, MEGA5进一步构建进化树。
将含有目标基因载体 pMDC43-OsSAPK2 用基
因枪介导法转化至洋葱表皮细胞中, 以不含目的基
因的空载体 pMDC43 为阳性对照, 用激光共聚焦显
微镜观察。
1.4 水稻遗传转化和转基因株系分子鉴定
将 PH7GWIWG2(II)-SAPK2 载体转化到农杆菌
EHA105, 用农杆菌介导法转化粳稻品种 9804 的水
稻愈伤组织, 以潮霉素(50 mg L–1)筛选阳性愈伤组
织, 进而再生获得转基因植株(9804-SAPK2i)。
利用标记基因潮霉素(Hpt)特异引物Hpt-F/R (表
1)对 9804-SAPK2i的不同转化体 T2代转基因株系进
行 PCR 检测, 以质粒 pH7GWIWG2(II)为阳性对照,
1%琼脂糖凝胶电泳, 成像观察。
以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)为内源参照基因
(单拷贝), 标记基因潮霉素抗性基因(Hpt)作为外源
基因设计引物 SPS-RT-F/R、Hpt-RT-F/R, 利用 qPCR
进行拷贝数分析。参照杨立桃等构建校正标准曲线
与线性方程[24]。
1.5 转基因株系白叶枯病抗性鉴定和抗病相关
基因表达分析
2014 年夏天, 在中国农业学科院作物科学研究
所网室进行抗病表型鉴定。采用人工剪叶接种法在
植株分蘖盛期进行接种白叶枯病菌代表菌株
PXO61(P1)和 KS6-6(C2), 2周后测量病斑长度。接种
后 0、12、24、36、48、60和 72 h取样, 液氮速冻
后储存于80℃冰箱备用, 每个样品 3 个重复, 每个
重复 5 株。用 Invitrogen 公司的 TRIzol 试剂提取水
1194 作 物 学 报 第 41卷


稻叶片总 RNA, DNase I处理后, 用 Promega公司试
剂反转录成 cDNA, 20℃保存备用。
以水稻 Actin (Os03g0718100)作为内参设计引
物 Actin-F/Actin-R (表 1), 用目的基因的特异引物
SAPK2-RT-F/SAPK2-RT-R (表 1)检测转基因植株中
OsSAPK2 基因的表达。根据抗病相关基因 OsLRR
(LOC_01G59440)、OsHIR1 (LOC_08G30790)、MAPK5
(LOC_03G55560)在 NCBI中编码区序列分别设计引
物 01g59440-F/01g59440-R、08g30790-F/08g30790-R、
03g55560-F/03g55560-R (表 1), PCR 扩增检测稳定
后用于荧光定量 PCR。
用 qRT-PCR试剂盒(TransStart Top Green qPCR
SuperMix, TransGen)于 Bio Rad CFX96 Real time
System上进行实时荧光定量 PCR分析, 此反应体系
为 20 μL [2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10
μL、Passive Reference Dye (50×) 0.4 μL、上下游引
物(20 μmol L–1)各 0.2 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 7.2
μL]。扩增反应程序为 94℃, 30 s; 94℃, 5 s; 60℃, 34 s;
40 个循环。每个取样点设 3 个重复, 采用 2–ΔΔCt法
分析确定基因的相对表达量。
1.6 OSsAPK2酵母自激活活性及酵母双杂交筛选
依照 Clontech (Clontech Laboratories, Inc, USA)
酵母实验手册进行酵母转化和酵母双杂交实验。将
构建好的诱饵载体(pGBKT7-SAPK2)转化酵母菌株
AH109, 涂于色氨酸缺陷的 SD 平板(–Trp, SD), 在
30℃培养箱中生长 3~5 d 后观察菌落的生长状况,
挑取单菌落于 5 mL液体色氨酸缺陷的 SD液体培养
基中, 30℃条件下 220转 min–1摇菌培养 16 h, 按 100
倍、10–1倍、10–2倍、10–3倍、10–4倍、10–5倍梯度
稀释, 并点涂在 SD缺陷平板上培养(–Trp, –Trp/–His,
–Trp/–Ade, –Trp/–His/–Ade, SD), 观察菌落生长状况。
酵 母 双 杂 交 筛 选 : pGBKT7-OsSAPK2 与
pGADT7文库(接种白叶枯病菌的水稻酵母次级文库)
质粒, 共转化后将菌液涂在加入定量 3-AT营养缺陷
培养基平板上(–Trp/–His/–Ade/–Leu, SD), 在 30℃培
养箱中生长 3 d 后观察菌落的生长状况, 挑取筛选
培养基平板(–Trp/–His/–Ade/–Leu, SD)上的单克隆
到筛选液体培养中, 30℃条件下 220转 min–1摇菌培
养, 并进行 PCR 检测, 挑取扩增出特异条带菌液测
序, 分析目的基因。
测序结果与水稻基因组比对所获得的候选互作
蛋白基因, 分别利用 Primer 5.0设计引物, 荧光定量
PCR进行表达分析。
2 结果与分析
2.1 OsSAPK2序列分析及亚细胞定位
通过对OsSAPK2基因的 cDNA及蛋白质序列的
分析, 发现水稻品种 9804 基因组中 OsSAPK2 的序
列与数据库中报道的日本晴序列完全一致, 具有丝
苏氨酸蛋白质激酶(Serine/Threonine protein kinases)
和催化结构域(catalytic domain), 此外还含有一个特
殊的 STYKC结构域[23]。
选取多个植物物种的 SnRK2 家族成员, 利用
Cluster W 进行序列比对, MEGA5 进一步构建进化
树。结果显示, 不同植物 SnRK2家族成员均可分为
3类, 单子叶的水稻和玉米具有高度的同源性, 双子
叶的拟南芥、马铃薯和白杨之间的距离较近(图 2-A),
暗示单双子叶的分化位于 OsSAPKs基因不同分组后,
可能由于被子植物分化为单子叶植物和双子叶植物
过程中 , 外界环境的巨变 , 主要为非生物胁迫 , 其
自然选择压力对植物 SnRK2家族原始遗传信息进行
改变和修饰, 进行不同程度的复制加倍, 使该家族同
源基因数目增加, 单双子叶的序列差异增大 [25-26]。
OsSAPKs可以分为 3组, 其中 OsSAPK4、OsSAPK5、
OsSAPK6、OsSAPK7属于 Kulik’s I组, OsSAPK1、
OsSAPK2、OsSAPK3属于 Kulik’s II组, OsSAPK8、
OsSAPK9、OsSAPK10属于 Kulik’s III组(图 2-B); 用
基因枪将载体 pMDC43-OsSAPK2 转化至洋葱表皮
细胞中, 瞬时表达检测发现 GFP-OsSAPK2 融合蛋
白定位在细胞质和细胞核中(图 2-C), OsSAPK2可能
与细胞质内相关蛋白和细胞核内相关蛋白都互作 ,
进而达到信号快速传递的目的。
2.2 水稻遗传转化及转基因株系的分子鉴定
利用标记基因 hpt 特异引物对 9804-SAPK2i 转
基因不同独立转化体的基因组 DNA进行 PCR检测,
琼脂糖凝胶电泳结果显示, 转化体株系大部分能扩
增出于质粒载体潮霉素基因一致的特异条带(图 3-A
标记基因 PCR 检测电泳图), 表明带有 hpt/hyg 标记
基因的 T-DNA已经插入并整合到受体基因组中, 仅
有极少数具有潮霉素抗性的转化体呈现假阳性。本
实验获得 11个 9804-SAPK2i独立的转化体。
对 9804-SAPK2-RNAi 转基因株系目的基因
OsSAPK2 进行 qRT-PCR, 分析各转化体 T2 代植株
OsSAPK2的表达量变化。结果表明 4个 9804-SAPK2-
RNAi 转化体的 OsSAPK2 的表达水平有不同程度的
降低, 其中 2 个转化体目的基因表达水平显著低于
对照 9804 (图 3-B)。
第 8期 胡丹丹等: 胁迫相关蛋白激酶基因 OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应 1195



图 2 SnRK2家族基因的系统发育分析和 OsSAPK2亚细胞定位
Fig. 2 Phylogenetic analysis of SnRK2 family genes and subcellular location of OsSAPK2
A: 不同植物 SnRK2家族基因的系统发育树; B: OsSAPK的系统发育树; C: OsSAPK2亚细胞定位。
A: phylogenetic relationship of the SnRK2 family genes in different plants; B: phylogenetic relationship of OsSAPK genes;
C: subcellular location of OsSAPK2.


图 3 OsSAPK2-RNAi转基因水稻 PCR鉴定和 OsSAPK2表达
分析
Fig. 3 Identification of OsSAPK2-RNAi transgenic rice plants
by PCR and the expression of OsSAPK2
A: 标记基因 PCR检测电泳图; V指质粒阳性对照(Vector); I1、
I2、I3、I4、I5、I6、I7、I8、I9、I10、I11指转基因植株不同株
系; B: OsSAPK2表达分析; WT为未转基因植株 9804; I1、I2、I3、
I4为转基因株系; 标*的柱值差异显著(P<0.05)。
A: detection of the marker gene by PCR; V: the vector as positive
control; I1, I2, I3, I4, I5, I6, I7, I8 , I9, I10, I11: the transgenic plant;
B: the expression of OsSAPK2; WT: non-transgenic rice 9804; I1,
I2, I3, I4: the transgenic rice; Bars superscribed by * are
significantly different at P<0.05.

根据杨立桃等[24]的方法构建的 Hpt和 SPS基因
的标准曲线如图 4 所示, Hpt 标准曲线的相关系数
R2=0.983, 相关性高, 该基因 Ct 值与起始模板数(Hpt0)
之间的相关性方程为 Hpt0=10(0.29CT+10.07); SPS 基因
标准曲线的相关系数为 R2=0.997, 相关性高,该基因
Ct 值与起始模板数 (SPS0)之间的相关性方程为
SPS0=10(–0.314CT+13.149), 利用 qPCR分析了 9804-SAPK2-
RNAi 转基因株系 (T2)拷贝数 (表 2), 计算公式为
K=2×Hpt0/SPS0。其中, 转基因株系 I1、I4的拷贝数
为 2, I3、I5、I6的拷贝数为 1, I2与对照 9804的拷
贝数为 0。结合表达分析发现, 拷贝数对目的基因的
表达水平有一定的影响, 但影响程度并不完全一致,
可能与目的基因的插入位置有关。
2.3 转基因株系抗病表型鉴定和抗病相关基因
表达分析
在分蘖盛期采用剪叶法接种白叶枯病菌代表菌
株 P1和 C2, 连续 2周观察发病情况。接种 3 d后, 可
以观察到感病品种 9804、9804-SAPK2i 均有明显的
暗绿色水浸状线状病斑; 7 d 后, 病斑沿叶脉扩展,
变成黄褐色, 二者病斑长度无明显差异; 2 周后, 发
病情况稳定 , 病斑呈现枯白色 ; 对于不同小种
9804-SAPK2i的病斑长度均大于 9804, 9804-SAPK2i
对白叶枯病菌比 9804更为敏感; 相同转基因株系接
种菌株 C2 的病斑均比接种 P1 时高, 转基因植株对
C2的感病性更强, 而对照 9804对 P1更敏感(图 5)。
1196 作 物 学 报 第 41卷



图 4 SPS和 Hpt基因定量 PCR扩增的校正曲线
Fig. 4 qPCR calibration curves of SPS and Hpt

表 2 qRT-PCR分析 OsSAPK2-RNAi转基因株系中 T-DNA插入拷贝数
Table 2 Analysis of OsSAPK2-RNAi (T-DNA) copy number of transgenic lines by qRT-PCR
转基因株系
Transgenic line
SPS起始模板数
SPS0
Hpt起始模板数
Hpt0
相对拷贝数
2×Hpt0/SPS0
目的基因的拷贝数
Copy number of target gene
I1 11294.0 11132.8 1.97 2
I3 8468.2 4011.1 0.95 1
I4 153729.3 184634.2 2.40 2
I5 6716.1 1783.2 0.53 1
I6 65859.0 22110.1 0.67 1
WT 14654.9 52.0 0.01 0
I1、I2、I3、I4、I5、I6指转基因植株不同株系, WT为未转基因植株 9804。
I1, I2, I3, I4, I5, I6: the transgenic plant; WT: non-transgenic rice 9804.


图 5 OsSAPK2-RNAi转基因水稻接种白叶枯病菌的反应
Fig. 5 Reaction of the OsSAPK2-RNAi transgenic rice to Xan-
thomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) infection
A: 水稻接种白叶枯病菌 PXO61(P1) 14 d后的发病症状; B: 水稻
接种白叶枯病菌的病斑长度; N为未转基因对照株系 9804; I1、
I3、I4、I5为转基因株系; WT为未转基因对照株系 9804; P1、
C2白叶枯菌株 PXO61, KS6-6; 标*的柱值差异显著(P<0.05)。
A: symptom of leaves inoculated with Xoo strain P1 after 14 days;
B: the lesion length of leaves in different lines; N: non-transgenic
9804; I1, I3, I4, I5: transgenic rice; WT: non-transgenic 9804; P1,
C2: Xoo strain PXO61, KS6-6; Bars superscribed by * are
significantly different at P<0.05.

SnRK2 家族的激酶通常位于胁迫的上游信号转
导途径[27-29]。对 3 个已知的抗病相关基因进行的表
达分析 , 抗病相关基因 OsLRR1、 OsHIR1 在
OsSAPK2-RNAi 转基因植株中表达水平下降, 而感
病相关基因 OsMAPK5 在 OsSAPK2-RNAi转基因植
株表达水平升高(图 6), 推测 OsSAPK2 可能通过正
向调控下游抗病相关基因 OsLRR1、OsHIR1, 负向调
控感病相关基因 OsMAPK5 而参与水稻对白叶枯病
的抗性反应。
2.4 OsSAPK2互作蛋白的初步筛选
OsSAPK2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。为了研
究OsSAPK2是否具有自激活活性, 我们将OsSAPK2
插入到 pGBKT7, 转入酵母 AH109 中, 以 BD 为阴
性对照, 结果显示 OsSAPK2具有自激活活性。随后
涂布在含有 0、5、10、12.5 mmol L–1 3-AT的 SD缺
陷平板上培养 (–Trp, –Trp/–His, –Trp/–Ade, –Trp/–
His/–Ade, SD), 观察菌落的生长, 结果表明在 12.5
mmol L–1 3-AT的 SD缺陷平板上, 酵母不能正常生
长(图 7-A)。
利用诱饵载体(BD-OsSAPK2)进行酵母双杂交
互作蛋白的筛选, 共筛选到 247个阳性克隆, PCR检
测结果如图 7-B, 挑取扩增大小为 1000 bp及以上的
单克隆测序。测序结果与水稻基因组比对获得了多
个候选互作蛋白(表 3), 包括已知在植物抵御非生物
胁迫过程中起作用的 OsEREBP1、OsPTF1等。
为进一步深入了解候选蛋白的功能, 对候选蛋
白基因进行了表达分析。结果表明, 正常处理下, 候
选蛋白基因在 OsSAPK2-RNAi转基因植株中表达水
平均高于未转基因植株(图 8)。接种白叶枯病菌后,
LOC_Os09g07570、LOC_Os02g54160、LOC_Os10g
35840、LOC_Os07g32400 的表达水平在 OsSAPK2-
第 8期 胡丹丹等: 胁迫相关蛋白激酶基因 OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应 1197



图 6 OsSAPK2-RNAi转基因植株接种水稻白叶枯病菌 KS6-6 (C2)后抗病相关基因 MAPK5、OsLRR、OsHIR1的表达分析
Fig. 6 Expression of resistance-related gene MAPK5, OsLRR, and OsHIR1 of the OsSAPK2-RNAi transgene rice after inoculating
with Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) C2
9804为未转基因对照; I3、I4为转基因株系。9804: non-transgenic rice; I3, I4: transgenic rice.

表 3 酵母双杂交筛选到与 OsSAPK2互作的候选蛋白
Table 3 Candidate interaction proteins of OsSAPK2 screened by Y2H
酵母单克隆
Yeast clone
基因号
Gene ID
注释
Annotation
D1 LOC_Os02g54160 OsEREBP1
D3 LOC_Os10g35840 Glutamyl-tRNA reductase
D7 LOC_Os07g32400 Putative MAP4 kinase
D9 LOC_Os07g05820 GLO5
D11 LOC_Os09g07570 Catalytic subunit of the ferredoxin-thioredoxin reductase (FTR)
D15 LOC_Os06g09370 BHLH transcription factor PTF1


图 7 pGBKT7-OsSAPK2的自激活验证与阳性克隆的 PCR
检测
Fig. 7 Identification of pGBKT7-OsSAPK2 for auto-activation
and PCR identification of positive clones
M: DL2000 marker; 1~11：酵母克隆。
M: DL2000 marker; 1-11: Yeast clones.

RNAi 转基因植株中逐渐降低, 而在未转基因植株
表现升高或变化缓慢; LOC_Os07g05820 在转基因
和未转基因植株中表达均升高 ; LOC_Os06g09370
在转基因植株中表达升高, 未转基因植株中表达变
化趋势不明显。推测可能是由于 OsSAPK2-RNAi 转
基因植株中的 OsSAPK2基因被敲除, 引起的不同候
选蛋白基因的差异表达。
3 讨论
本研究利用 RNAi技术分析了 OsSAPK2基因在
水稻对白叶枯菌的抗性反应中的作用。植物的免疫
反应是一个复杂的调控网络, 网络中有些因子的功
能是冗余的, 对这些因子的沉默可能因为其他因子
的补偿而无法引起植株表型的变化。如拟南芥的
WAK 基因间存在功能的冗余, 利用基因特异的反义
链转录本单独沉默 AtWAK1 或 AtWAK2 均不能引起
拟南芥沉默植株的表型变化[30]。本研究发现接种白
叶枯病菌不同菌株后, OsSAPK2 基因的下调表达水
平不同, RNAi 植株接种 P1 表型变化差异明显小于
接种 C2 白叶枯小种, 可能由于 OsSAPK2 在响应不
同白叶枯菌小种抗性反应中起到的作用是不同的 ,
也可能是在应对不同病菌生理小种时存在与
OsSAPK2基因功能冗余的基因。
番茄细菌性斑点病菌侵染拟南芥时, 类受体蛋
白激酶 OsLRR1 能够减轻病原菌数目、提高防卫反
应标记基因(如 PR基因)的表达[31]; OsHIR1属于 PID
(Proliferation, Ion and Death)超家族成员, 在植物受
到病原菌袭击的时候参与自发超敏反应坏死斑的形
成过程[32]。丝裂原活化蛋白激酶 OsMAPK5 是介导
细胞胁迫响应 MAPK级联反应途径的重要信号分子,
1198 作 物 学 报 第 41卷



图 8 OsSAPK2-RNAi转基因植株接种水稻白叶枯病菌 KS6-6 (C2)后候选互作蛋白基因的表达分析
Fig. 8 Expression of candidate interaction proteins of OsSAPK2 of the OsSAPK2-RNAi transgene rice after inoculating with
Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) C2
9804为未转基因对照; I3为转基因株系。9804: non-transgenic rice; I3: transgenic rice.

既可以响应非生物胁迫又可以响应生物胁迫, 并且
呈现负相关功能[33]。OsSAPK2的表达变化可以引起
上述几个胁迫应答基因的表达差异, 暗示该基因是
水稻抗白叶枯病反应信号传导途径中的一个正调控
因子。
此外, 我们利用酵母双杂交筛选到多个可能与
OsSAPK2 相互作用的蛋白 , 这些蛋白可能被
OsSAPK2 翻译后修饰(磷酸化)或在接收信号等方面
起作用。如 OsEREBP1 基因参与植物抗逆反应[34],
OsEREBP1 (LOC_Os02g54160)属于 AP2/ERF 转录
因子家族[35]。BWMK1 通过结合和激活 OsEREBP1
调节病程相关蛋白的表达[36]。我们推测 OsSAPK2可
能通过与 OsEREBP1 相互作用, 启动下游病程相关
蛋白, 增强水稻抗病性。下一步的实验重点是对候
选蛋白进行验证, 深入研究 OsSAPK2与互作蛋白的
互作机制, 为进一步研究 OsSAPK2参与调控水稻抗
白叶枯病的分子机制提供信息。
4 结论
水稻胁迫相关蛋白激酶OsSAPK2被定位于细胞
核和细胞质内 , 在 OsSAPK2-RNAi 转基因水稻中
OsSAPK2 下调表达, 接种水稻白叶枯病菌后, 转基
因水稻比受体对照感病性显著提高, 抗病相关基因
OsLRR1、OsHIR1 表达水平下降 , 感病相关基因
OsMAPK5 表达水平升高。推测 OsSAPK2 可能通过
调节 OsLRR1、OsHIR1、OsMAPK5的表达而调控水
稻对水稻白叶病的抗病反应。
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