全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(6): 813819 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31271304), 重庆市自然科学重点项目(cstc2012jjB80005)和中央高校基本科研业务费(XDJK2012A001)
资助。
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271304), the Natural Science Foundation Project of
Chongqing (CSTC2012JJB80005), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2012A001).
* 通讯作者(Corresponding author): 李云峰, E-mail: liyf1980@swu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: 598161800@qq.com
Received(收稿日期): 2015-12-09; Accepted(接受日期): 2016-03-14; Published online(网络出版日期): 2016-03-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160321.1056.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00813
水稻颖壳退化突变体 degenerated hull 3 (dh3)的表型分析与基因定位
龙珏臣 庄 慧 陈 欢 汪 玲 沈亚林 曾晓琴 崔馨允
桑贤春 何光华 李云峰*
西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室, 重庆 400716
摘 要: 水稻(Oryza sativa L.)花器官的发育直接影响其产量和品质。本研究报道了一个水稻颖壳退化突变体, 来源于
恢复系缙恢 10号的 ethyl methane sulfonate (EMS)诱变群体, 命名为 degenerated hull 3 (dh3)。该突变体表现为内外稃
退化变窄, 且不能正常闭合。在一些突变严重的小花中, 外稃甚至退化成芒状, 内稃边缘和浆片退化变窄且融合。遗
传分析表明该性状受 1对隐性基因调控。利用不育系西农 1A与 dh3杂交构建的 356株 F2突变群体, 将 DH3基因精
细定位在第 12染色体的 SSR标记 RM27706和 RM27709之间, 物理距离为 44.72 kb, 该区段内未见已知功能基因的
报道。本研究的结果为以后 DH3基因的图位克隆与功能分析打下基础。
关键词: 水稻; 颖壳退化; 表型分析; 基因定位
Phenotypic Analysis and Gene Mapping of degenerated hull 3 (dh3) Mutant in
Rice (Oryza sativa L.)
LONG Jue-Chen, ZHUANG Hui, CHEN Huan, WANG Ling, SHEN Ya-Lin, ZENG Xiao-Qin, CUI Xin-Yun,
SANG Xian-Chun, HE Guang-Hua, and LI Yun-Feng*
Rice Research Institute, Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops,
Chongqing 400716, China
Abstract: The floral organ development directly influences the yield and quality of rice. In this study, we reported a mutant de-
generated hull 3 (dh3), derived from ethylmethane sulfonate (EMS)-treated Jinhui 10 (Oryza sativa L. ssp. indica). The manifes-
tation of dh3 mutant was degradation and narrowing in lemma and palea, losting the ability of close-up. In some seriously mutated
florets, the lemma even degenerated in an awn-like shape, the margin region of palea and lodicules became narrow, even fused.
Genetic analysis indicated that the dh3 character is controlled by a recessive gene. By using 356 F2 mutants derived from a cross
between sterile line Xinong 1A and dh3, DH3 was mapped between SSR markers RM27706 and RM27709 on chromosome 12 in
rice, with a physical distance of 44.72 kb. There is no report of known functional gene in this zone. The results will shed light on
the future clone and function analysis of DH3 gene.
Keywords: Rice (Oryza sativa); degenerated hull; Phenotypic analysis; Gene mapping
水稻的颖壳包括内稃和外稃, 是禾本科植物所
特有的外轮花器官。它们位于小花结构的外层, 早
期可以为内部器官提供发育所需光合产物, 成熟后
保护种子避免病虫等的侵入。同时, 颖壳的大小也
是种子大小的决定因素之一。因此, 颖壳的发育对
水稻产量以及品质的形成非常重要。
植物花器官发育的分子机制研究已比较透彻 ,
依据双子叶植物的研究人们提出了花器官发育的
ABCE模型[1], 该模型认为四轮花器官花萼、花瓣、
雄蕊及心皮分别由 A+E、A+B+E、B+C+E 及 C+E
814 作 物 学 报 第 42卷


四组基因决定, 每一类基因都调控两轮或两轮以上
的花器官, 其中任何一类基因的突变都会引起相应
轮次器官的同源异型转变[2]。在水稻等单子叶植物
中, 内轮花器官雄蕊和心皮的形态和功能与双子叶
植物很相似, 也基本适于 ABCE 模型; 但外轮花器官
颖壳和浆片的形态和功能与双子叶植物有很大差异。
在拟南芥中, 外轮花器官的发育主要受到 A 类
和 E 类基因的调控[2-4]。A 类基因包括 APETALA1
(AP1)和 APETALA1AP2 (AP2), 它们特异地调控外两
轮器官花萼和花瓣的发育, 一旦 A类基因发生突变,
将导致萼片、花瓣向雌蕊、雄蕊的同源异型转变[3]。
拟南芥中有 4 个 E 类基因 , SEPALLATA1/2/3/4
(SEP1/2/3/4), 一开始发现 SEP1/2/3冗余地调控内三
轮器官的特征, 后来发现 SEP1/2/3 还和 SEP4 一起
冗余地调控花萼的发育 [4]。在水稻中 , OsMADS14/
15/18 是拟南芥 AP1 的直系同源基因。degenerative
palea (dep)突变体是由 OsMADS15 基因的单碱基突
变造成的 , 表现为外稃伸长 , 内稃主体退化 , 只留
下 2 个边缘结构, 这表明 OsMADS15 是维持内稃主
要结构和外稃的发育是必需的[5]。对 OsMADS14 和
OsMADS18 的功能目前并不清楚。OSMADS1/5/7/8/
34 是水稻的 E 类基因。在多个 OsMADS1 基因的突
变体中, 内外稃呈现出不同程度的叶化伸长, 表明
OsMADS1在内外稃的发育中承担了重要的功能[6]。
osmads34 突变体表现出护颖伸长, 而内外稃基本正
常, 但是在 osmads34+osmads1 双突变体中, 内外稃
比 osmads1 单突变体进一步伸长并叶化 , 这表明
OsMADS34与 OsMADS1冗余地调控内外稃的发育[7]。
另外 3个基因OSMADS5/7/8/是否在内外稃的发育调
控中承担功能尚不清楚。
除 A、E类基因外, 其他一些基因也影响着水稻
颖壳的发育。STAMENLESS 1 (SL1)、OPEN BEAK
(OPB)和 Oryza sativa JAGGED (OsJAG)属于同一个
基因, 编码一个C2H2锌指结构域转录因子, 其功能
缺失导致内外稃弯曲变小且不扣合[8]。DEGENERATED
HULL 1 (DH1)编码一个 LOB结构域的蛋白。在 dh1
突变体中, 大约 60%的小花不能发育出正常的内外
稃, 而完全退化成膜状或纤维状器官, 同时伴随浆
片、雄蕊和雌蕊不同程度的缺失 [9]。TRIANGULAR
HULL1 (TH1)基因编码一个 DUF640 结构域转录因
子, 突变后内外稃横向和纵向生长均被影响, 内外
稃变小、增厚[10]。另外, 还发现一些基因只调控内
稃的发育。MOSAIC FLORAL ORGANS1 (MFO1)和
CHIMERIC FLORAL ORGANS1 (CFO1)都编码MADS-
box 基因, 突变后都导致内稃边缘区域变大且表面
硅化 , 使得突变体内稃整体看起来外稃化 [11-12]。
DEPRESSED PALEA 1 (DP1)编码一个 AT-hook DNA
结合蛋白, 突变导致内稃主体结构完全丢失, 仅保
留 2个膜状的边缘区域[13]。最近鉴定的 DEFORMED
FLORAL ORGAN1 (DFO1)和 CURVED CHIMERIC
PALEA 1 (CCP1)是同一个基因, 编码的蛋白参与水
稻C功能基因OsMAD58等的表观遗传抑制, 突变后
导致 OsMAD58 在内稃等器官中异位表达, 引起内
稃的特征缺陷[14-15]。
本研究中, dh3突变体主要表现为颖壳退化, 特
别是外稃在严重时退化成芒状器官。这种表型与以
上突变体都不相同 , 而与植物反义小干涉 RNA
(ta-siRNA)产生途径的基因异常引起的表型十分类
似 , 比如水稻 RNA-dependent RNA polymerase 6
(RDR6)和 Oryza sativa Dicer like-4 (OsDCL4)基因的
突变也出现芒状外稃的表型 [16-18]。通过基因定位 ,
我们将 DH3 定位在第 12 染色体的 RM27706 和
RM27709两个 SSR标记之间, 物理距离为 44.72 kb,
包括 7 个注释基因, 但并不包含 RDR6 或 OsDCL4
基因。该研究有利于后续 DH3基因的图位克隆和功
能分析, 也将为进一步理解植物 ta-siRNA 途径调控
花器官发育做出贡献。
1 材料与方法
1.1 实验材料
dh3突变体来源于恢复系缙恢10号 EMS诱变群
体, 多代自交后突变性状稳定遗传。2013年, 将正
常的不育系材料西农1A与 dh3杂交, 收获 F1种子。
同年, 在海南种植并收获 F2种子。2014年, 在西南
大学歇马水稻研究所基地种植 F2群体, 用于遗传分
析和基因定位。所有材料均由西南大学水稻研究所
提供。
1.2 形态和组织学分析
在开花期 , 选取野生型和dh3突变体小穗 , 用
SU3500扫描电镜和NIKON SMZ1500体视镜分析其
表型特征。用SU3500扫描电镜观察分析幼穗期的野
生型和突变体。
石蜡切片被用于开花期小穗的组织学分析。选
取抽穗期的野生型和突变体小穗于FAA (50%无水
乙醇, 0.9 mol L–1的冰乙酸和3.7%甲醛)中4℃固定
16 h以上, 经乙醇梯度脱水和二甲苯透明后用石蜡
第 6期 龙珏臣等: 水稻颖壳退化突变体 degenerated hull 3 (dh3)的表型分析与基因定位 815


包埋。切片厚度为8 μm, 经1%番红和1%固绿对染后
于尼康E600光学显微镜下观察分析。
1.3 分子标记定位及连锁图谱构建
以西农1A/dh3杂交F2群体隐性单株为作图群
体。采用BSA法定位目标基因[19]。CTAB法提取亲本、
基因池以及 F2群体DNA[20]。 SSR引物序列参照
http://www.gramene.org/microsat/, 由生工生物工程
(上海)股份有限公司合成。PCR总体系为15 μL, 含
1.5 μL 10×PCR buffer、1 μL 50 ng μL–1 DNA模板、
0.25 μL 2.5 mmol L–1 dNTPs、10.0 μL ddH2O、10 μmol
L–1的前后引物各1.0 μL、0.25 μL 5 U μL–1 Taq DNA
聚合酶。PCR程序94℃预变性5 min; 94℃变性30 s,
55℃退火30 s, 72℃复性1 min, 35个循环; 72℃延伸
10 min。PCR产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,
快速银染后观察[21]。将具有缙恢10号带型的单株标
记为A, 具有dh3带型的单株标记为B, 具有双亲带
型的单株标记为H, 用MapMaker3.0分析数据和作图,
用Kosanbi函数将重组率转化为遗传距离(cM)。
1.4 候选基因分析
注释基因信息来源于网站http://www.gramene.
org/和http://rice.plantbiology.msu.edu/, 同源性分析
基于NCBI网站的BLAST工具http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi。
2 结果与分析
2.1 dh3突变体小花的形态学和组织学分析
野生型水稻的小穗由2对颖片和1个小花组成 ,
小花从外向内由第1轮的2个颖壳、第2轮的2枚浆片、
第3轮的6枚雄蕊和第4轮的1枚雌蕊构成。其中第1
轮的颖壳分为内稃和外稃, 二者形态结构并不完全
相同。外稃略大, 有5条维管束, 边缘向内钩; 内稃
略小, 有3条维管束, 且由主体和边缘组织组成, 两
部分结合的地方形成一个沟槽, 与外稃紧密地扣合
在一起; 2枚浆片呈八字形位于外稃一侧, 基部与内
稃的边缘组织轻微连接; 6枚雄蕊环绕1枚雌蕊位于
小花的中心(图1-A~F)。
dh3 突变体的小花主要表现为外轮花器官颖壳
和浆片的异常。在突变性状较轻的小花中, 外稃退
化变窄 , 顶端的芒伸长 , 且不能与内稃钩合 , 使小
花开裂(图 1-G~I)。石蜡切片观察发现外稃维管束数
目减少为 3条, 且边缘与内稃钩合的部分退化(图 1-J,
K)。内稃的主体部分未见明显异常, 但边缘部分与
野生型相比变窄, 与浆片出现紧密的融合, 且浆片
没有发育出与野生型相似的形状(图 1-J, L)。在突变
性状较重的小花中 , 外稃完全退化为芒状 (图
1-M~O)。石蜡切片表明突变性状较重的小花外稃外
层的硅化表皮细胞已经完全形成一个闭合的环, 包
裹着里面残留的一条维管束和周围少量的厚壁细胞
和薄壁细胞(图 1-Q); 内稃也发生了明显的变化, 主
体部分宽度较野生型窄, 而边缘部分极度退化, 与
浆片完全融合在一起; 相应地, 浆片与野生型相比
也极度退化变小 , 而且失去了正常浆片的形状(图
1-R)。这些结果表明 dh3 突变体外轮花器官(特别是
外稃)的极性发育受到了严重的干扰。
2.2 dh3突变体早期小花的形态学分析
利用扫描电镜, 观察了野生型和突变体小花早
期原基分化起始时期(Sp4~Sp8期)的发育情况, 时期
的划分参考 Itoh 等的方法[22]。在 Sp4 期, 野生型小
花的内外稃原基刚刚起始, 外稃原基发育稍早, 顶
端有一隆起 , 内外稃均呈半圆形 , 边缘相互交错 ,
共同构成一个环状结构, 将花分生组织托于内部(图
2-A)。相较于野生型, dh3突变体外稃原基的两侧边
缘部分不发育, 与内稃边缘没有交叉, 顶端异常隆
起, 总体呈现一个顶端突出的三角形(图 2-E)。进入
Sp5期, 野生型小花的雄蕊原基开始分化, 而内外稃
原基进一步分化, 边缘部分开始钩合在一起(图 2-B);
在 dh3 突变体中, 外稃原基进一步迅速沿基-顶轴分
化 , 顶端过度隆起 , 而两侧细胞分化仍然缓慢 , 逐
渐发育成棒状结构; 而内稃原基的基-顶轴分化较迟
缓, 明显比野生型的短。内外稃的边缘也不能钩合
在一起(图 2-F)。在 Sp6~Sp7期, 野生型内外稃原基
发育正常, 并呈现半闭合状态, 将内轮器官原基包
裹在内(图 2-C); dh3 突变体外稃原基进一步成棒状
结构。内稃原基分化缓慢, 较野生型的短, 致使雄蕊
原基和雌蕊原基裸露(图 2-G)。进入 Sp8期后, 野生
型小花的内外稃原基完全闭合, 将内轮花器官完全
包裹(图 2-D); dh3突变体的内稃原基沿基-顶轴分化
严重延迟, 形态与野生型 Sp5 期类似, 外稃原基进
一步伸长, 但两侧仍然没有发育, 内轮器官完全裸
露(图 2-H)。这些结构表明 dh3突变体小花的内外稃
极性发育受到了严重的影响。
2.3 dh3突变体的遗传分析
用西农 1A与 dh3杂交, F1表型正常, F2群体出
现明显的 dh3突变表型分离。F2群体总数为 1168, 其
中正常植株 812 株 , 突变植株 356 株 , 分离比为
3.281∶1。经过卡平方检测, 分离比例符合 3∶1。
816 作 物 学 报 第 42卷


这些结果表明 dh3突变性状受 1对隐性单基因控制。
2.4 DH3基因的分子定位
将西农1A/dh3杂交F2群体中的356个突变株用
于基因定位。首先在F2中随机选取10株正常株构建
正常基因池, 10株突变株构建突变基因池。选用平均
分布于12条染色体的400对引物进行多态性分析 ,
其中96对引物显示出多态性。进一步利用这96对引
物对正常基因池和突变基因池进行连锁分析, 发现
位于第12染色体上的SSR标记RM247和RM7102在
正常池和突变池之间呈现多态性(表1)。用这2个标
记筛选群体153株 , 重组子分别为13个和9个 , 将
DH3初步定位在RM247和RM7102之间(图3)。在这
两个标记之间进一步设计34对SSR引物 , 其中5对
引物呈现出多态性, 分别是RM27686、RM27706、
RM27709、RM27735、RM4173 (表1)。用这些引物
筛选全部356株突变体, 重组子分别为4、1、1、2和
8株 , 最终将DH3基因定位在RM27706和RM27709
之间, 物理距离44.72 kb (图3)。
2.5 DH3候选基因分析
参照测序品种日本晴, 定位区间共有MSU的注
释基因 7个。其中 LOC_Os12g09570编码 GTP抑制
蛋白, LOC_Os12g09580和 LOC_Os12g09590都编码
拟南芥 SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3
(SGS3)同源蛋白, 为 1对水稻旁系同源基因。LOC_
Os12g09584、LOC_Os12g09600、LOC_Os12g09610
和 LOC_Os12g09620编码表达蛋白。在玉米中, SGS3

图 1 野生型和 dh3突变体的形态和组织学观察
Fig. 1 Phenotype and histology of wild type and dh3 mutant
A: 野生型小穗; B: 野生型小穗基部; C: 野生型小穗顶部; D: 野生型小穗横截面; E和 F: 图 D的局部放大。G和 M: dh3小穗; H和
N: dh3小穗基部; I和 O: dh3小穗顶部; J和 P: dh3小穗横截面; K和 L: 图 J的局部放大; Q和 R: 图 P的局部放大。dle: 退化的外稃; dpa:
退化的内稃; dlo: 退化的浆片; le: 外稃; lo: 浆片; pa: 内稃; pi: 雌蕊; rol: 棒状外稃; st: 雄蕊。标尺: A~C、G~I、M~O为 1000 μm; D、
J和 P为 500 μm; 其余 100 μm。
A: wild-type spikelet; B: lower part of wild-type spikelet; C: upper part of wild-type spikelet; D: transverse sections of wild type spikelet; G
and M: dh3 spikelet; H and N: the lower part of dh3 spikelet; I and O: upper part of dh3 spikelet; J and P: transverse sections of dh3 spikelet;
K and L: amplified part of picture J; Q and R: amplified of the part of picture P. dle: degenerated lemma; dpa: degenerated palea; dlo: degen-
erated lodicule; le: lemma; lo: lodicule; pa: palea; pi: pistil; rol: rod-like lemma. Bar = 1000 μm in A−C, G−I, and M−O; bar = 500 μm in D, J,
and P; bar = 100 μm in the others.
第 6期 龙珏臣等: 水稻颖壳退化突变体 degenerated hull 3 (dh3)的表型分析与基因定位 817



图 2 野生型和 dh3突变体小穗发育早期的扫描电镜观察
Fig. 2 Scanning electronic micrographs of early flowers in the wild type and the dh3 mutant
A~D: 野生型小穗; E~H: dh3突变体小穗。WT: 野生型; le: 外稃; lo: 浆片; pa: 内稃; rol: 棒状外稃。标尺: 100 μm。
A−D: wild-type spikelets; E−H: dh3 spikelets. WT: wild type; le: lemma; lo: lodicule; pa: palea; rol: rod-like lemma. Bar=100 μm.

表 1 用于基因定位的多态性引物
Table 1 Polymorphic markers for gene mapping
引物
Primer
正向序列
Forward sequence (5–3)
反向序列
Reverse sequence (5–3)
RM247 AAGGCGAACTGTCCTAGTGAAGC CAGGATGTTCTTGCCAAGTTGC
RM27686 ATGGGAACAACCTTATCGTCTGC GAGAGTTGGGCTTCTTGTTGAGG
RM27706 ACTCCCTCCGACACCATCATCC ATACGGGAACCCTCACGCTACC
RM27709 CGGCTCTATACCGGCAAGAATGG CTCTGGTGCAAGGTGTCCAACC
RM27735 ATCGGTTCTTCCCTTCTTCTTGC TTTGCTTATACCGCTTCCGATCC
RM4173 TCCCTCCGTACTTATAAAGGAAGTCG CCTCCATACTCACAAAGGAAGTCG
RM7102 GGGCGTTCGGTTTACTTGGTTACTCG GGCGGCATAGGAGTGTTTAGAGTGC

图 3 DH3基因在第 12染色体上的连锁图谱
Fig. 3 Linkage map of DH3 and markers on chromosome 12 in rice
818 作 物 学 报 第 42卷


直系同源基因 LEAFBLADELESS1 (LBL1)突变后导
致花、叶发育成丝状, 外稃的表型与 dh3 类似[23-24],
故将 LOC_Os12g09580 和 LOC_Os12g09590 暂定为
候选基因。
3 讨论
本研究中 dh3突变体主要表现为外轮花器官的
异常, 特别是外稃退化, 严重时成芒状。在水稻中,
之前报道的几个突变体如 rol、osrdr6-1和 osdcl4-1,
表型与 dh3十分类似。rol突变体外稃退化为芒状, 另
外花药形态特征也受到影响 , 严重时缺乏4个花室
的分化 , 转变成棒状花药 [16]。osrdr6-1突变体外稃
在气温超过32℃后发育成芒状, 随气温升高越发严
重 [17]。osdcl4-1突变体外稃也表现退化, 严重的也转
变为芒状[18]。在 dh3突变体中, 退化的外稃与 rol、
osrdr6-1和 osdcl4-1十分相似; 另外 dh3突变体还表
现出内稃和浆片的退化, 在一些小花中, 内稃边缘
和浆片出现严重的退化并完全融合在一起, 这是其
他几个芒状外稃突变体中没有发现的。
osrdr6-1和 rol都是水稻 OsRDR6基因的等位突
变体[16-17], osdcl4-1是 OsDCL4基因的突变体。RDR6
和 DCL4等基因编码的蛋白质在植物的 ta-siRNA产
生过程中都起着重要作用。在拟南芥中, ta-siRNA前
体基因在转录后先被切割成片段, 在 SGS3 蛋白的
保护下, 被 RDR6 转录成 dsRNA, 然后由 DCL4 等
蛋白切割成 siRNA 去抑制下游生长素相关基因
ARFs等在近轴面的表达, 从而调控叶、花等侧生器
官近-远轴极性的建立[25]。在水稻 OsDCL4基因的突
变体中 , 生长素相关基因 OsARFs 的表达上调 [18];
在 OsRDR6基因的突变体中, OsARFs基因在外稃、
花药等近轴面异位表达[16-17]; 这些结果表明水稻中
也存在类似的 ta-siRNA途径调控的极性发育。在本
研究中 , DH3 基因的定位区间内有 1 对基因
Os12g09580和 Os12g09590, 都编码 SGS3-like蛋白,
是拟南芥 SGS3 直系同源基因。在玉米中 ,
LEAFBLADELESS1 (LBL1)也编码 SGS3-like 基因,
lbl1 突变体侧生器官的近轴面极性不能正常建立 ,
导致叶片、外稃等发育成只有呈丝状的远轴面[23-24],
其中外稃的表型与 dh3 十分相似。所以, 我们初步将
LOC_Os12g09580和 LOC_Os12g09590作为DH3的候
选基因, 拟进行后续的进一步鉴定和功能研究。
4 结论
dh3 突变体内外稃变窄且不能正常闭合, 外稃
维管束数目减少, 边缘与内稃钩合的结构缺失, 严
重时仅剩一支中脉和周围少量细胞; 内稃的主体部
分未见明显异常, 但其边缘部分退化严重, 且与浆
片紧密的融合; 浆片也发育异常, 呈现不正常的形
状。说明 dh3突变体外轮花器官(特别是外稃)的极性
发育受到严重干扰。该性状受 1对隐性基因调控, 被
精细定位在第 12 染色体的 SSR 标记 RM27706 和
RM27709 之间, 物理距离为 44.72 kb, 该区段内未
见已知功能基因的报道。
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