全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 50−59 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971618, 30771157)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 吴先军, E-mail: wuxj@sicau.edu.cn, Tel: 028-86290906
第一作者联系方式: E-mail: wushaohua703@163.com, Tel: 0898-23306255
Received(收稿日期): 2012-03-07; Accepted(接受日期): 2012-09-05; Published online(网络出版日期): 2012-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121114.1642.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00050
双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交 F1的 DNA 甲基化位点分析
吴绍华 1,2 张红宇 1 薛晶晶 1 徐培洲 1 吴先军 1,*
1 四川农业大学水稻研究所 / 西南作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室, 四川成都 611130; 2 中国热带农业科学院橡胶研究
所, 海南儋州 571737
摘 要: 全基因组倍增或多倍化, 伴随着基因丢失和二倍化进程, 被认为是植物进化的重要推动力量。DNA 甲基化
与 miRNA的表观遗传调控机制在植物生长发育及进化过程中起着重要的作用。本文采用 MSAP (甲基化敏感扩增多
态性)技术分析同一双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交 F1的基因组 DNA 5-CCGG位点胞嘧啶的甲基化及遗
传特点。对部分甲基化位点进行切胶、回收、测序及功能注释, 并结合 miRNA靶基因预测探讨特定甲基化位点的遗
传特点及其与 miRNA 的相关性。16 对选择性扩增引物在双亲及杂交 F1中共检测了 462 个 DNA 甲基化位点, 杂交
F1甲基化水平平均为 43.20%, 与双亲相近(单倍体为 46.75%, 二倍体为 41.99%)。TargetFinder软件分析发现其中的 7
个甲基化位点基因序列上存在 1~4 个 miRNA 的结合位点, 这些基因的功能注释包括逆转录转座子蛋白、ras 相关蛋
白、H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等。同时, 探讨了逆转录转座子在植物进化中的作用。研究结果为进一步阐明水稻
基因组倍增过程中 DNA甲基化与 miRNA的关系提供了参考。
关键词: 双胚苗水稻; 单倍体; DNA甲基化; MSAP; miRNA
DNA Methylation Site Analysis of Haploid, Diploid, and Hybrids in
Twin-Seedling Rice
WU Shao-Hua1,2, ZHANG Hong-Yu1, XUE Jing-Jing1, XU Pei-Zhou1, and WU Xian-Jun1,*
1 Rice Research Institute, Key Laboratory of Southwest Crop Genetic Resources and Improvement, Ministry of Education, Sichuan Agricultural Uni-
versity, Chengdu 611130, China; 2 Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737, China
Abstract: Whole-genome duplication or polyploidy, followed by gene loss and diploidization has long been recognized as an
important evolutionary force in plants. Epigenetic mechanism, such as DNA methylation and miRNA, plays an important role in
plant growth and development, and may also change its regulation pattern to adapt genomic duplication in new species. In this
study, the DNA cytosine methylation at the 5-CpCpGpG sites was analyzed by MSAP (methylation-sensitive amplification poly-
morphism) method in haploid, diploid and their hybrids derived from twin-seedling rice. And also, the relationships between DNA
methylation and miRNA were investigated by sequencing the methylated DNA fragments and predicting the targets of miRNA. A
total of 462 DNA methylated sites were detected. The hybrid’s methylation level was 43.20% and a little different from that of its
parents (haploid, 46.75%; diploid, 41.99%). TargetFinder was used to find that seven methylated genes matched in sequence of
rice database had 1-4 binding sites of miRNAs. The annotation indicated that the genes might include retrotransposon protein,
ras-related protein and core histone H2A/H2B/H3/H4 domain containing protein. Most of the genes were annotated as retrotrans-
posons and their functions in evolution were discussed. The results might help us to understand the relationships between DNA
methylation and miRNA in rice genome duplication.
Keywords: Twin-seedling rice; Haploid; DNA methylation; MSAP; miRNA
DNA 甲基化与 miRNA 作为重要的表观遗传调
控, 存在于许多高等动植物中, 在基因表达调控、细
胞分化、基因组印记以及系统发育过程中起着非常
重要的作用。目前, 我们从水稻双胚苗群体中筛选
第 1期 吴绍华等: 双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交 F1的 DNA甲基化位点分析 51


鉴定出单倍体、二倍体、三倍体等一系列同源倍性
材料, 这些材料的基因组序列无差异[1-3], 是研究物
种进化过程中基因组倍增现象的理想材料。研究发
现, 被子植物在进化上大多经历了全基因组复制(多
倍体)、基因丢失和二倍化过程[4]。在物种多倍化进
化过程中, 必然会伴随表观遗传调控的变化, 其中
DNA 甲基化和 miRNA 与物种多倍化的相关性已得
到初步证实[5-9]。因此, 探讨倍性变化过程中 DNA
甲基化的遗传特点及其与miRNA的相关性, 将为进
一步研究水稻基因组倍增过程中的表观遗传调控机
制奠定基础。
DNA 甲基化是在 DNA 甲基转移酶(DNA me-
thyltransferase, DNMTs)的作用下 , 将甲基添加在
DNA分子的碱基上, 是最常见的复制后及转录表观
遗传修饰方式之一。miRNA是一类长约 21~24个核
苷酸的非编码小分子 RNA, 是由具发卡环二级结构
的 RNA单链前体加工而来。研究发现, miRNA与甲
基化有着密切的联系, 生物体通过对 AGO (Argo-
naute)等参与 miRNA成熟过程的蛋白的编码基因甲
基化修饰影响 miRNA的产生[10], 甲基转移酶 HEN1
对 miRNA 3′末端碱基进行甲基化修饰使其免受降
解。miRNA 自身转录也受到 DNA 甲基化的严密调
控, miRNA基因内部或邻近的 CpG岛发生异常甲基
化导致某些关键 miRNAs 表达紊乱进而引起肿瘤和
疾病发生[11]。在真核生物中, small RNA作为基因转
录的潜在的调控因子能触发诸如 CpG、CpHpG、
CpHpH 等胞嘧啶发生 DNA 甲基化 [12-13]。 long
miRNAs (lmiRNAs)也能通过介导自身 MIR 基因或
靶基因 DNA 胞嘧啶位点的甲基化对染色质进行修
饰达到基因转录调控的目的[14]。在物种系统进化过
程中, 对涉及基因组倍增事件表观遗传调控机制的
了解较少, 特别是基于 DNA 甲基化与 miRNA 对基
因表达调控的变化鲜有报道。本研究采用 MSAP技
术分析同一双胚苗来源的水稻单倍体、二倍体及其
杂交 F1代基因组 DNA 甲基化位点特异性及遗传特
性, 并结合 miRNA 靶基因预测手段探讨 DNA 甲基
化与miRNA的相关性, 为进一步研究水稻多倍化过
程中 DNA甲基化及 miRNA的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
水稻双胚苗株系 SARII-628来源的单倍体(1N)、
二倍体(2N)及其杂交 F1代材料。
1.2 方法
1.2.1 倍性鉴定 取单倍体、二倍体及杂交 F1
代的分蘖发根, 待根长至 2~3 cm时剪取根尖, 经 8-
羟基喹啉处理 3~5 h 后, 用 Carnoy’s I 固定液固定
1~24 h, 再转到 70%乙醇, 于 4℃冰箱保存备用。改
良苯酚品红压片, 在光学显微镜下观察, 选分散良
好、染色适度的细胞在显微镜下观察并照相。
1.2.2 单倍体与二倍体水稻基因组差异分析 用
分布于水稻 12 对染色体的 416 对 SSR 标记对同一
双胚苗来源的单倍体、二倍体进行 DNA水平的多态
性检测。采用 TIANGEN的 DNAsecure Plant Kit提
取水稻叶片总 DNA。按照 Panaud 等[15]的方法进行
PCR扩增。
1.2.3 MSAP分析 参照 Xiong等[16]的方法进行
MSAP 分析中的酶切、连接、预扩和选扩, 双酶切
组合分别为 EcoR I+Msp I和 EcoR I+Hpa II (NEB),
接头和引物序列如表 1。采用“1, 0”赋值法统计

表 1 接头和引物序列
Table 1 Adapter and primer sequences
接头与引物
Adapter and primer
序列
Sequence
接头与引物
Adapter and primer
序列
Sequence
EcoR I接头 EcoR I adapter 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′ 3′-CTGACGCATGGTTAA-5′
Msp I/Hpa II选扩增引物
Msp I/Hpa II selective primer
Msp I/Hpa II接头 Msp I/Hpa II adapter 5′-GATCATGAGTCCTGCT-3′ 3′- AGTACTCAGGACGAGC-5′ HM1 HM00-TAT
EcoR I预扩增引物 EcoR I preAmp primer, E00 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′ HM2 HM00-TAG
Msp I/Hpa II预扩增引物 Msp I/Hpa II preAmp primer, HM00 5′-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3′ HM3 HM00-TAC
EcoR I选扩增引物 EcoR I selective primer HM4 HM00-TTG
E1 E00-AAC HM5 HM00-TTC
E2 E00-AAG HM6 HM00-TGT
E3 E00-ACA HM7 HM00-TGC
E4 E00-ACC HM8 HM00-TCT
E5 E00-ACG HM9 HM00-TCG
HM10 HM00-TCC
52 作 物 学 报 第 39卷

PAGE条带, 相同的位点有带记为“1”, 无带记为“0”。
1.2.4 目的条带的回收、测序及序列分析 从聚
丙烯酰胺凝胶切下目的条带, 采用高盐法 [3]回收片
段, 然后用 pMD19-T Clone kit (TaKaRa)克隆差异片
段。转化后挑取白色菌落接于 3 mL LB/氨苄青霉素
液体培养基中, 37℃ 200 转 min−1振荡培养, 采用
PCR 鉴定, 将阳性克隆送上海美季生物技术有限公
司测序。用 DNAMAN 软件去除载体序列后, 采用
MSU Osa1 Release 7 (http://rice.plantbiology.msu.
edu/index.shtml)的 BLASTN程序对测序结果进行同
源性比对。
1.2.5 甲基化差异片段与 miRNA的相关性分析
通过第 1.2.4 步对回收的甲基化差异片段与水
稻数据库 MSU Osa1 Release 7的 BLAST比对分析,
确定甲基化差异片段相对应的基因编号。另外, 采
用美国俄勒冈州立大学 James C Carrington 实验室
的靶基因预测软件 TargetFinder[17-18]对 miRNA 数据
库 miRBase 15.0 中的水稻 miRNA 进行靶基因的预
测, 获得 miRNA 调控的靶基因数据(数据待发表)。
罚分系统为, 错配、单核苷酸缺口及凸起罚 1 分;
G:U配对罚 0.5分; miRNA 5′端开始 2~13位错配罚
分加倍。达到以下任何两个条件的靶基因将被排除:
(1)超过 1 个缺口或凸起; (2)总的错配、G:U 配对、
缺口、凸起超过 7 个; (3)超过 4 个错配或 4 个 G:U
配对。最后, 将符合条件, 罚分在 5分以下的基因预
测为 miRNAs的靶基因。
最后, 用甲基化差异片段相对应的基因编号在
预测的 miRNA 靶基因数据中搜索, 寻找其对应的
miRNA。对存在 miRNA 调控的甲基化差异相关基
因, 分析其miRNA调控位点与甲基化位点的分布特
征, 探讨甲基化与 miRNA调控的关系。
2 结果与分析
2.1 单倍体、二倍体筛选及杂交 F1 植株的获得
与鉴定
SARII-628 双胚苗株系每年都能出现单倍体与
二倍体(1N 2∶ N)的双苗植株。其中的单倍体植株具
有正常发育的卵细胞和极核 , 但花粉发育不正常 ;
我们以单倍体作母本, 恢复系作父本获得了正常的
杂交后代[3]。因此, 本研究以双胚苗中的二倍体作父
本, 单倍体作母本进行杂交, 杂交种子生活力较弱,
经胚拯救, 即在实验室用培养基为种子胚的发育提
供营养, 待其成苗后再移栽至大田, 最后获得正常
杂交 F1植株 5 株, 田间编号为 22-1~22-5。这些 F1
代植株具有正常的表型及二倍的染色体(图 1)。
2.2 单倍体与二倍体水稻基因组差异分析
用均匀分布于水稻 12 对染色体的 416 对 SSR
标记对来源于同一双胚苗的单倍体、二倍体水稻进
行基因组 DNA水平上的多态性验证, 其中 310对标
记能扩增出清晰条带。在这些位点上, 单倍体与对
应二倍体带型表现一致, 没有差异(图 2), 与 Zhang
等 [1]的研究结果一致, 表明同一双胚苗来源的单倍
体和二倍体基因组是一致的, 适合进行 DNA 甲基
化、small RNA等表观遗传调控的研究。
2.3 基因组 DNA甲基化分析
运用 MSAP技术分析单倍体、二倍体及它们杂
交 F1代孕穗期(取材时以“叶枕距=0”作为标准)剑叶
基因组 DNA 5-CCGG 位点胞嘧啶的甲基化水平和
甲基化遗传模式。由于单倍体与对应二倍体在基因
组 DNA 上无差异, 获得的杂交 F1代的基因组在理
论上应该与二倍体相同。因此, 选择多态性较好的
16 对标记(E1HM1、E2HM1、E2HM2、E2HM8、
E2HM10、E3HM1、E3HM5、E3HM6、E3HM7、
E4HM1、E4HM6、E4HM8、E4HM10、E5HM1、
E5HM2、E5HM4)对单倍体、二倍体及其杂交 F1代
进行 MSAP分析。从 1N、2N及杂交后代中检测到
462个位点(表 2), 同时分析这些位点的甲基化状
况。结果表明, 单倍体的甲基化水平及全甲基化率
均高于二倍体; 不同单株的 F1甲基化水平略有差异,
与双亲的甲基化水平相差不大; F1 甲基化总体水平
低于母本单倍体, 而与二倍体相近(表 2)。
另外, 甲基化遗传模式分析结果显示, 1N×2N
的杂交 F1基因组 DNA 5′-CCGG位点的甲基化主要
有 4 种情况(表 3 和图 3): ①杂交 F1、1N、2N 三者
的甲基化状态一致, 占全部位点的 86.93%; F② 1甲
基化状态同母本 1N, 占全部位点的 3.03%; F③ 1甲
基化状态同父本 2N, 占全部位点的 7.53%; F④ 1甲
基化状态不同于双亲, 占全部位点的 4.12%。推测可
能是双亲互作造成, 或是环境因素及个体差异导致
的甲基化改变。
DNA 甲基化片段经 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分
离后, 通过比较 1N、2N 和 F1的甲基化状况, 切胶
回收了 18个甲基化差异位点, 经二次 PCR回收目的
片段并进行亚克隆测序, 最后获得 11条能与基因组
匹配的序列(表 4)。这些序列对应的基因编码一系列
蛋白, 包括逆转录转座子蛋白、GDSL 类脂肪酶/酰
第 1期 吴绍华等: 双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交 F1的 DNA甲基化位点分析 53



图 1 单倍体、二倍体及其杂交 F1 植株表型和根尖细胞染色体
Fig. 1 Chromosomes of root tip cells and phenotypes of the haploid, diploid, and their hybrids
A: 单倍体与二倍体表型; B: 杂交 F1(22-3)结实图; C: F1代种子的胚拯救; D~F: 依次为单倍体、二倍体、F1(22-3)的根尖细胞染色体。
A: phenotype of the haploid and diploid; B and C: hybrids; D, E, and F: root’s cell chromosomes of the haploid, diploid, and their hybrids.

图 2 SSR 引物 RM204~208 对二倍体与对应 2 株单倍体 DNA 的扩增结果
Fig. 2 The bands of the one diploid and two haploids amplified with RM204–208
2N表示双胚苗来源的二倍体; 1N-1, 1N-2表示同一双胚苗株系在不同年度筛选获得的两株单倍体, 本研究中的材料为当年筛选的单倍体 1N-2。
2N:diploid; 1N-1 and 1N-2: haploid. The object of this study is 1N-2.

表 2 1N、2N 和 F1 甲基化水平分析
Table 2 Methylation levels of haploid, diploid, and F1
带型 Band F1 类型
Type
甲基化
Methylation H M
1N 2N
22-1 22-2 22-3 22-4 22-5
I
5mC5mCGG
GG5mC5mC 0 0 28 17 13 14 10 15 13
II C
5mCGG
GG5mCC 0 1 107 115 119 117 122 114 116
III
5mCCGG
GGCC 1 0 81 62 64 66 83 65 67
IV CCGG GGCC 1 1 246 268 266 265 247 268 266
甲基化总位点数 TMS 216 194 196 197 215 194 196
甲基化敏感扩增多态性 MSAP (%) 46.75 41.99 42.42 42.64 46.54 41.99 42.42
全甲基化带数示 FMB 135 132 132 131 132 129 129
全甲基化率 FMR (%) 29.22 28.57 28.57 28.36 28.57 27.92 27.92
甲基化总带数 = I+II+III; 全甲基化带数 = I+II; H: EcoRI+HpaII; M: EcoRI+MspI。相同的位点有带记为“1”, 无带记为“0”。
TMS: Total methylated sites = I+II+III; FMB: Full methylated bands = I+II; FMR: Full methylated ratio. MSAP: methylation-sensitive
amplification polymorphism.The bands were recorded by ‘0’ and ‘1’. ‘1’ represented the bands presented, and ‘0’ represented no bands
54 作 物 学 报 第 39卷

表 3 F1 甲基化遗传模式分析
Table 3 Methylation type of haploid, diploid, and F1
带型 Banding pattern 位点数 Site
1N 2N F1
H M H M H M
22-1 22-2 22-3 22-4 22-5 位点数平均值
Average for sites
①杂交 F1、1N、2N三者的甲基化状态一致 The methylated sites of F1, 1N, and 2N were identical.
1 1 1 1 1 1 252 253 245 254 252 401.6
0 1 0 1 0 1 98 94 94 91 91
1 0 1 0 1 0 52 51 51 47 48
0 0 0 0 0 0 9 8 4 7 7
②F1甲基化状态同母本 1N The methylated sites of F1 were identical with haploid.
1 1 0 1 1 1 2 2 1 1 1 14.0
0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1
0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0
0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1
0 1 1 1 0 1 1 2 2 2 2
1 0 1 1 1 0 2 7 10 7 8
0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0
③F1甲基化状态同父本 2N The methylated sites of F1 were identical with diploid.
0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 34.8
0 1 1 1 1 1 3 2 2 2 2
0 0 0 1 0 1 12 11 11 10 11
1 0 1 1 1 1 17 13 10 13 12
0 0 1 0 1 0 2 2 2 2 2
1 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 1 1 1 2 2 2
1 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2
0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1
④F1甲基化状态不同于双亲 The methylated sites of F1 differ from parents.
0 1 0 1 1 1 0 1 1 3 5 19.0
1 1 1 1 0 1 1 0 2 0 1
1 1 1 1 1 0 0 0 8 0 1
0 0 0 0 0 1 2 3 6 4 4
1 0 1 0 1 1 0 3 1 5 4
0 1 0 1 0 0 0 1 1 2 1
0 0 0 0 1 0 1 1 2 2 1
0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0
H: EcoR I+Hpa II; M: EcoR I+Msp I。相同的位点有带记为“1”, 无带记为“0”。
The bands were recorded by ‘0’ and ‘1’. ‘1’ represented the bands presented, and ‘0’ represented no bands.

基水解酶、ras 相关蛋白、黏液素表面蛋白、VHS
和 GAT结构域相关蛋白及 H2A/H2B/H3/H4核心组
蛋白等。其中逆转录转座子蛋白包括未分类的逆转
录转座子、Ty3-gypsy亚类逆转录转座子以及着丝粒
特异性的逆转录转座子。
2.4 DNA甲基化位点与miRNA结合位点的分布
采用 TargetFinder 软件, 根据 1.2.5 描述的罚分
系统, 对甲基化差异的相关基因的miRNA结合位点
预测显示, 其中的 7 个甲基化位点基因序列上存在
miRNA的结合位点(表 5和图 5)。这些基因的miRNA
结合位点分布具有以下特点:
(1)同一个 miRNA 结合位点分布于不同的基因
上, 如逆转录转座子蛋白 Ty3-gypsy 亚类的编码基
因 LOC_Os03g30710 和 LOC_Os04g54650 均存在
miR2919 的结合位点。(2)同一个基因存在不同的
miRNA 结合位点 , 如 ras 相关蛋白编码基因
第 1期 吴绍华等: 双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交 F1的 DNA甲基化位点分析 55


LOC_Os08g41340 存 在 多 个 miRNA (miR164e,
miR807a/b/c)结合位点 ; LOC_Os10g08010 存在
miR1848、miR2925的结合位点; 未分类逆转录转座
子蛋白基因 LOC_Os06g05680、LOC_Os07g18970
存在 miR2927、miR820a/b/c 的结合位点。图 5 是
5′-CCGG 甲基化及 miRNA 在 7 个基因上的分布特
点, 这些基因的功能注释涉及逆转录转座子蛋白、
ras相关蛋白、H2A/H2B/H3/H4核心组蛋白等。图 5
的结果显示 , miRNA 结合位点主要分布于外显子
区。除了 Ty3-gypsy 亚类逆转录转座子蛋白编码基
因 LOC_Os03g30710 和 LOC_Os04g54650 的 5′-CC
GG甲基化差异位点位于内含子区域外, 其他 5个基
因的 5-CCGG 甲基化差异位点及 miRNA 调控位点
均分布于外显子区域。

图 3 1N、2N、1N×2N 甲基化类型
Fig. 3 Type of special methylated sites in haploid, diploid and
hybrids
①、②、③和④的意义同表 3。
The meanings of ①, ②, ③, and ④ are the same as given in Table 3.

表 4 DNA 甲基化差异片段序列功能分析
Table 4 Annotation of the DNA methylated sites
序列编号
Code of
sequence
长度
Length
(bp)
同源序列 a
Homo sequence a
功能注释
Annotation
E值
E-value
类型
Type
miRNA b
1 372 LOC_Os12g02900 Retrotransposon protein, putative, unclassified 2.20E–74 ③
2 249 LOC_Os07g04350 Expressed protein 2.20E–49 ③
3 277 LOC_Os02g19040 GDSL-like lipase/acylhydrolase, putative, expressed 2.60E–44 ②
4 314 LOC_Os09g14110 Retrotransposon protein, putative, unclassified 3.00E–59 ③
LOC_Os03g30710 Retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass 1.40E–58 miR2919
LOC_Os09g06650 Retrotransposon, putative, centromere-specific 2.00E–58
LOC_Os04g54650 Retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass 7.80E–58 miR2919
5 144 LOC_Os08g41340 Ras-related protein, putative, expressed 4.50E–26 ② miR164e, miR807a/b/c
6 91 LOC_Os10g08010 Expressed protein 6.10E–15 ②③ miR1848, miR2925
7 158 LOC_Os02g34030 Retrotransposon protein, putative, unclassified 1.60E–27 ③④
8 441 LOC_Os08g38280 Mucin-associated surface protein, putative, expressed 7.10E–94 ③
9 370 LOC_Os09g14340 Retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass 2.60E–73 ②③
…
10 257 LOC_Os10g28230 4.90E–52 ③ miR3979-5p

Core histone H2A/H2B/H3/H4 domain containing
protein, putative, expressed

11 159 LOC_Os06g05680 Retrotransposon protein, putative, unclassified 2.50E–28 ③ miR2927, miR820a/b/c
LOC_Os07g18970 Retrotransposon protein, putative, unclassified 2.70E–28 miR2927, miR820a/b/c
…
LOC_Os10g41510 Calcineurin B, putative, expressed 2.00E–27
LOC_Os11g09329 VHS and GAT domain containing protein, expressed 2.10E–27
a: 数据库为 MSU Osa1 Release 7.1 (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml); b: miRNA 的信息可从 miRBase (http://www.
mirbase.org/)数据库中获取。①、②、③和④的意义同表 3。
a: the database is MSU Osa1 Release 7.1 (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml); b: miRBase (http://www.mirbase.org/). The
meanings of ①, ②, ③, and ④ are the same as given in Table 3.

另外 , 除了 LOC_Os08g41340 基因外 , F1 代
5′-CCGG 位点的甲基化状况主要是遗传双亲中甲基
化水平较低的亲本, 这与我们在单倍体与恢复系杂
交后代中得到的结果一致[3]。
表 5 甲基化位点基因 miRNA 的分布
Table 5 miRNA sites of target gene
靶基因
Target gene
miRNA名称
miRNA name
miRNA序列
miRNA sequence (5–3)
靶基因结合位点序列
Target gene sequence (5–3)
得分
Score
染色体
Chr.
起始点
Start
终点
End
比对
Alignment
LOC_Os03g30710 miR2919 AGAAAGGGGGGGGGGGGAA TTTGGTCCCCCTCCCCCTC 5.0 3 2882 2900 :.: .:::::.::::::
LOC_Os04g54650 miR2919 AGAAAGGGGGGGGGGGGAA TTTGGTCCCCCTCCCCCTC 5.0 4 3263 3281 :.: .:::::.::::::
LOC_Os08g41340 miR164e GAGUGCACGGGACGAAGAGGU CTCACCTCCTCTGCTTCTCCC 4.0 8 8 27 ::::: : :.::::::::::
miR807a CCUAAGUGGACACUCUACUGC GGATTCACTGTGATATGAAG 5.0 8 2721 2740 ::::::: :::::: :::: :
miR807b CCUAAGUGGACACUCUACUGC GGATTCACTGTGATATGAAG 5.0 8 2721 2740 ::::::: :::::: :::: :
miR807c CCUAAGUGGACACUCUACUGC GGATTCACTGTGATATGAAG 5.0 8 2721 2740 ::::::: :::::: :::: :
LOC_Os10g08010 miR1848 ACGUGCGCGCGCGGCCGCUCC GCTGCGCGCGCCCCGGCGAGG 5.0 10 440 460 ..::::::: :::::::::
miR2925 UGCUUCGGGCGCCGGCGGU ACGGAGCACGCCGCCGCCA 4.5 10 259 277 :::.::: ::: :::::::
LOC_Os10g28230 miR3979-5p UCGGAAGUUCCCUCUCUCUCU AGCGAGGAAGGGGGAGAGAGA 5.0 10 108 128 ::: :::::.::::::::
LOC_Os06g05680 miR2927 GUACCCGAGGUAGCUGCUGCUGU CAACGGCTCCATCGCCGGCGACA 5.0 6 239 261 :: :::::::::: ::.:::::
miR820a GACCAGGUAGGUGCUCCGGCU CTGTCCAGCTGCGAGGCCGA 5.0 6 4437 4456 :: ::::: :..:::::::::
miR820b GACCAGGUAGGUGCUCCGGCU CTGTCCAGCTGCGAGGCCGA 5.0 6 4437 4456 :: ::::: :..:::::::::
miR820c GACCAGGUAGGUGCUCCGGCU CTGTCCAGCTGCGAGGCCGA 5.0 6 4437 4456 :: ::::: :..:::::::::
LOC_Os07g18970 miR2927 GUACCCGAGGUAGCUGCUGCUGU CAACGGCTCCATCGCCGGCGACA 5.0 7 239 261 :: :::::::::: ::.:::::
miR820a GACCAGGUAGGUGCUCCGGCU CTGTCCAGCTGCGAGGCCGA 5.0 7 4437 4456 :: ::::: :..:::::::::
miR820b GACCAGGUAGGUGCUCCGGCU CTGTCCAGCTGCGAGGCCGA 5.0 7 4437 4456 :: ::::: :..:::::::::
miR820c GACCAGGUAGGUGCUCCGGCU CTGTCCAGCTGCGAGGCCGA 5.0 7 4437 4456 :: ::::: :..:::::::::

第 1期 吴绍华等: 双胚苗水稻来源的单倍体、二倍体及其杂交 F1的 DNA甲基化位点分析 57








图 5 5′-CCGG 位点胞嘧啶甲基化与 miRNA 调控位点在基因上的分布
Fig. 5 Distribution of DNA methylation and the targets of miRNAs

3 讨论
关于 DNA甲基化及 miRNA多分布于外显子区
域的特点, 我们推测是由甲基化和miRNA的调控特
点决定的, 内含子 5-CCGG 位点的甲基化修饰可能
通过影响基因的结构来调控基因的表达, 而 miRNA
主要是在转录后水平对基因调控。已知 DNA甲基化
是抑制基因表达的一种有效手段, 即甲基化发生在
启动子区域 , 可以抑制基因的表达 , 而发生在
GENE BODY区的甲基化, 对转录水平的影响不大。
但是 miRNA 水平的高低是否一定就会对其靶基因
的表达产生影响, 需要进一步检测靶基因的转录水
平及基因表达量才能确定。
DNA甲基化修饰与 small RNA (smRNA)两者对
基因的表达调控在植物的生长发育中起着非常重要
的作用。前人[10-14]的研究表明, miRNA与 DNA甲基
化具有密切的联系。如, 植物 miRNA在形成过程中
的中间产物 miRNA/miRNA*寡核苷酸二聚体在甲
基转移酶 HEN1 (HUA ENHANCER1)的作用下, 其
3′末端碱基会发生甲基化修饰以确保该二聚体在运
输过程中的稳定性[19-20]。另外, miRNA能介导 DNA
胞嘧啶甲基化的发生、传播及去除[21]。Bao 等[22]在
植物中发现了 miRNA 介导 DNA 甲基化的现象, 其
在拟南芥中发现 miR165/166在 miRNA结合位点下
游介导其靶基因 PHABULOSA (PHB)和 PHAVOLUTA
(PHV)的 DNA甲基化。Wu等[14]在水稻中发现 24 nt
long miRNAs (lmiRNAs)通过介导自身 MIR 基因或
靶基因 DNA 胞嘧啶位点的甲基化对染色质进行修
饰达到基因转录调控的目的。Khraiwesh 等[23]在苔
藓(Physcomitrella patens)中也发现存在 miRNA介导
58 作 物 学 报 第 39卷

的 DNA甲基化。
通过 TargetFinder软件分析 DNA甲基化差异位
点中miRNA的靶序列分布特点, 发现这些差异位点
的相应基因具有 1~4个miRNA结合序列, 初步推测
DNA 甲基化与 miRNA 具有相关性。然而, 具体的
调控方式还需要进一步实验验证。
此外, 同时分布有 DNA 甲基化和 miRNA 靶序
列的 7个基因中, 逆转录转座子基因占了 4个, 而逆
转录转座子是由RNA介导转座的转座子元件, 通过
转录合成 mRNA, 再逆转录合成新的元件整合到基
因组中完成转座, 每转座 1次拷贝数就会增加 1份。
逆转录转座子广泛存在于高等植物中, 是基因组的
重要成分之一, 对基因组的大小、结构、功能和进
化有着重要的影响, 因此, 我们推测 DNA甲基化与
miRNA通过对逆转录转座子调控, 或许间接影响着
物种的进化。
4 结论
F1 甲基化水平略低于母本单倍体, 而与二倍体
相差不大。7个甲基化位点基因序列上存在 1~4 个
miRNA的结合位点, 这些基因的功能注释包括逆转
录转座子蛋白, ras相关蛋白, H2A/H2B/H3/H4核心
组蛋白等。结果为进一步探讨水稻基因组特定位点
的 DNA甲基化及 miRNA的关系提供了依据。

致谢: 感谢华盛顿大学(圣 .路易斯 )章伟雄教授在
miRNA靶基因预测工作上的帮助。
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