全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(4): 571−580 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171528)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘国振, E-mail: gzhliu@genomics.org.cn, Tel: 0312-7528250
第一作者联系方式: E-mail: fanwei_mbb@126.com (范伟); lixuejiao_mbb@126.com (李雪姣), Tel: 0312-7528787
**同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-08-08; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-02-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140214.1018.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00571
水稻几丁质酶基因的转录与表达特征
范 伟** 李雪姣** 关明俐 缪刘杨 史佳楠 窦世娟 刘丽娟
李莉云 刘国振*
河北农业大学生命科学学院, 河北保定 071000
摘 要: 几丁质酶与植物的生长发育、抗逆和防御反应相关。水稻 PR3家族几丁质酶编码基因有 19个成员, 本文分
析其转录特征, 了解到有些基因属于组成型转录, 有些基因属于组织特异型转录, 分析几丁质酶蛋白质的结构域,
并对其进行聚类和亚家族分类。利用免疫印迹技术分析几丁质酶蛋白质的表达谱, 发现 CHIT5的表达量在水稻叶片
生长过程中下调, 而 CHIT6、CHIT14、CHITC1和 CHITC2的表达量上调。在水稻与白叶枯病菌(Xoo)的不亲和反应
中, CHIT1、CHIT2、CHIT5、CHIT6、CHIT10、CHIT15和 CHIT16的表达量上调, CHIT14、CHITC1和 CHITC2的
表达下调。进一步比较几丁质酶蛋白质在水稻-Xoo 不同互作反应中的表达, 发现其在亲和及不亲和反应中的表达模
式类似, 但一般在亲和反应中强度变化较大。此外, CHIT6蛋白质在对照反应中的表达量上调, 提示 CHIT6的表达受
创伤的诱导。本文比较系统地揭示了水稻 PR3 家族几丁质酶编码基因的转录和蛋白质表达特征, 为其功能解析提供
了线索。
关键词: 水稻; 几丁质酶; 聚类分析; 白叶枯病菌; 转录; 免疫印迹
Transcriptional and Translational Characterization of Rice Chitinase Genes
FAN Wei**, LI Xue-Jiao**, GUAN Ming-Li, MIAO Liu-Yang, SHI Jia-Nan, DOU Shi-Juan, LIU Li-Juan, LI
Li-Yun, and LIU Guo-Zhen*
College of Life Sciences, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, China
Abstract: Plant chitinases play roles in plant development and stress responses. Nineteen chitinase genes, belonging to patho-
genesis related PR3 family, were found in rice genome. In this study, constitutive and tissue-specific transcripted chitinase genes
were identified, and the domain architecture of chitinase protein was predicted. Clustering analysis and subfamily classification
were also carried out. Furthermore, chitinase protein expression profiling was surveyed using western blot (WB), it was found that
the expression of CHIT5 was down-regulated in normal growth rice leaves, while the expressions of CHIT6, CHIT14, CHITC1,
and CHITC2 were up-regulated. In the incompatible interaction between rice and Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the ex-
pressions of CHIT1, CHIT2, CHIT5, CHIT6, CHIT10, CHIT15, and CHIT16 were enhanced after inoculation and three of
CHIT14, CHITC1 and CHITC2 down-regulated. In addition, the comparison of chitinase protein expression in different rice-Xoo
interactions showed that these were similar alternation patterns between compatible and incompatible reactions, with a higher
extent of alterations in incompatible interactions for most of chitinases. It is interesting to note that the expression of CHIT6 was
enhanced in mock-treated samples, suggesting that the expression of CHIT6 may be induced by a mechanic wound. The data re-
vealed in this research will provide useful clues for the understanding of the function of PR3 family chitinase genes.
Keywords: Rice; Chitinase; Clustering analysis; Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo); Transcription; Western blot
几丁质(chitin)又称壳多糖, 其在甲壳类动物的
外壳、昆虫的甲壳和真菌的细胞壁以及绿藻中广泛
存在。几丁质是由 1000~3000个 N-乙酰葡萄糖胺残
基通过 β-1,4糖苷键相互连接而成的聚合物, 其分子
572 作 物 学 报 第 40卷


量往往在 1000 kD以上。它在生物体中主要是作为
身体骨架且具自身保护作用。在植物与病原物的互
作过程中, 几丁质的降解产物 N-乙酰葡萄糖胺可以
发挥病原物相关的分子模式(microbe/pathogen asso-
ciated molecular pattern, MAMP)的作用激发植物的
防卫反应 [1]。拟南芥受体激酶 AtCERK1 (chitin
elicitor receptor kinase 1 of Arabidopsis)的胞外区有 3
个赖氨酸基序(lysine motif, LysM), 它们可以与几丁
质寡糖结合从而激活植物免疫反应。几丁质诱发的
AtCERK1 的二聚化可进一步激发 AtCERK1 介导的
信号途径[2]。在水稻中, 第一个报道的几丁质酶寡糖
受体是 CEBiP (chitin elicitor binding protein), 它带
有 2个 LysM的糖蛋白, 与几丁质寡糖具有很高的亲
和力, CEBiP和激酶 OsCERK1共同作用, 可使植物
对来自几丁质寡糖的信号做出反应[3-4]。最近又有报
道表明, LYP4 (lysine motif–containing protein 4)和
LYP6与CEBiP具有同源性, 它们对水稻识别几丁质
信号也发挥着作用[2]。将 CEBiP 与水稻白叶枯病抗
性基因XA21或稻瘟病抗性基因PI-D2重组形成嵌合
基因, 可以增强水稻对稻瘟病菌的抗性[5-6]。
几丁质酶(EC 3.2.1.14)的作用是将几丁质分解为
N-乙酰葡萄糖胺, 在自然界中, 几丁质酶在细菌、真
菌、植物甚至动物中都存在。根据作用于几丁质的方
式不同, 几丁质酶可分为内切和外切几丁质酶二大
类[7], 根据氨基酸序列的相似性和几丁质结合结构域
的有无可把几丁质酶分为 Class I~Class VII [8-9]。
有大量报道表明, 几丁质酶在植物中的表达受
生物或非生物胁迫的诱导。在拟南芥中, 非亲和病
原物的侵染使 Class IV几丁质酶基因的转录更快地
积累[10], 而用亲和病原物侵染可使 Class III 几丁质
酶的转录升高[11]。在甜菜中也观察到亲和病原物的
侵染可使 Class IV几丁质酶转录增强的现象[12]。从
稻瘟病菌侵染后的叶片 cDNA 中克隆出一个属于
Class III 几丁质酶编码基因, 命名为 Oschib1, 该基
因的转录在稻瘟病菌和白叶枯病菌侵染后均大幅提
高, 且在接种非亲和稻瘟病菌的组织中 Oschib1 反
应更快速 , 另外 , 该基因的转录提升受水杨酸
(salicylic acid, SA)、乙烯、甲基茉莉酸、H2O2 和
CuSO4的诱导[13]。
也有多例报道表明, 几丁质酶在正常生长的植
物组织中也有表达。如在烟草的花形成阶段[14]、在
葡萄的果实成熟期[15]以及水稻的叶片、叶鞘、根和
分生组织中都有高表达的几丁质酶[9]。胡萝卜的EP3
几丁质酶在体细胞胚胎发生过程中发挥作用, 拟南
芥的ep3同源基因为Atep3/Atchit IV, 该基因在胚胎
细胞的周围看护细胞中表达, 但不在胚胎细胞中表
达, 在拟南芥植株中, 该基因在成熟的花粉和生长
中的花粉管中表达, 但没有检测到在胚乳和珠被中
的转录, 在胚胎形成后期, 其转录还发生在托叶、根
表皮和根毛中[16]。拟南芥类几丁质酶基因Atctl1的突
变引起了木质素的异位沉积和细胞的非正常形态突
变, Atctl1基因在大部分正常生长的组织中表达, 但
不受创伤、SA或乙烯处理的诱导[17]。水稻脆秆突变
体 bc15的控制基因编码几丁质酶类蛋白 BC15/
OsCTL1, 该基因的突变引起厚壁细胞壁变薄和纤
维素含量下降, 导致水稻茎秆机械强度降低, 表达
模式检测发现BC15/OsCTL1在水稻的各个组织器官
中均广泛表达[18]。这些事实说明几丁质酶不但在逆
境胁迫反应中有作用, 在植物正常生长发育过程中
也发挥着作用。
转基因实验也提供了几丁质酶作用的证据。在
水稻中组成型表达 Cht2 (Os05g33130)或 Cht3
(Os06g51050)基因提高了对稻瘟病的抗性 , 且几丁
质酶的高水平表达和稻瘟病抗性在后代中能稳定遗
传[19-20]。在水稻中组成型表达几丁质酶基因 RC7, 使
水稻增强了抗纹枯病的能力 [19-20]。干扰编号为
Os02g39330 或 Os04g41620 的水稻几丁质酶基因的
表达, 会使水稻提高对稻瘟病菌及白叶枯病菌的敏感
性[21]。把水稻的几丁质酶基因转入香蕉或小麦[22-23]可
提高受体植物的抗病性。
白叶枯病是危害水稻最为严重的细菌性病害 ,
在水稻育种和植病学家的努力下, 先后鉴定了30多
个水稻白叶枯病抗性基因, 其中7个已被克隆[24]。最
早克隆的 Xa21编码受体激酶, 且对白叶枯病菌具有
广谱抗性 , 过去十几年中 , 通过酵母双杂交和
Pull-down技术已经鉴定了 XB3、XB15、XB24、Bip3 [25-28]
等多个在 Xa21介导的抗病途径中的关键元件, 利用
水稻全基因组基因芯片体系 , 我们筛选出了441个
在 Xa21介导的抗病反应中的差异转录基因。采用基
于抗体的蛋白质组学策略 , 利用免疫印迹技术
(western blot, WB), 我们也检测到 PR、WRKY转录
因子等抗病相关蛋白质的表达变化[24,29-32]。
综上所述, 几丁质酶在植物正常生长发育和抗
病过程中都可能发挥作用。水稻中的几丁质酶属于
PR3家族, 有 19个成员[33], 本研究以水稻 PR3家族
的几丁质酶为对象, 分析了几丁质酶基因的转录和
第 4期 范 伟等: 水稻几丁质酶基因的转录与表达特征 573


蛋白质表达特征, 试图为水稻几丁质酶的功能研究
提供线索。
1 材料与方法
1.1 试验材料
水稻品种 93-11 是超级杂交稻两优培九的父本,
4021 是将白叶枯病抗性基因 Xa21 转入水稻品
TP309 后获得的纯合转基因株系 , 对白叶枯病菌
PXO99 野生型(由中国科学院遗传与发育生物学研
究所朱立煌研究员提供)表现不亲和反应, 对白叶枯
病菌突变株 PXO99ΔraxST (由美国加州大学戴维斯
分校 Pamela Ronald教授提供)表现亲和反应。
1.2 试验方法
1.2.1 水稻接种与取材 在 PSA 培养基中(0.5%
bacto peptone, 2% sucrose, 0.05% L-glutamic acid) 30℃
培养白叶枯病菌 48~72 h后, 用水稀释至 109个细胞
mL−1, 用灭菌剪刀蘸取菌液剪切叶片以接种, 以灭
菌蒸馏水作为对照(Mock)。分别于接种后 0 h、2 h、
8 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d和 10 d采集接种部位
叶片(约 1 cm), 液氮速冻后于−70℃冰箱保存。
1.2.2 多克隆抗体制备 目标几丁质酶蛋白质序
列来自水稻基因组数据库 (http://rice.plantbiology.
msu.edu), 利用 BEPITOPE软件预测抗原决定簇, 选
择峰值较高的片段, 用 BLASTP 软件对水稻蛋白质
库进行唯一性检测后, 确定目标多肽片段。以合成
多肽作为免疫原, 多克隆抗体的制备由北京华大蛋
白质研发中心有限公司完成。
1.2.3 水稻蛋白质提取 将−70℃冻存的水稻叶
片在液氮中充分研磨 , 加入蛋白质提取液 (62.5
mmol L–1 Tris-HCl, pH 7.4; 10%甘油; 0.1% SDS;
2 mmol L–1 EDTA; 1 mmol L–1 PMSF; 5% β-巯基乙
醇), 混匀, 冰上放置 10 min, 12 000转 min–1 4℃离
心 20 min, 取上清液即为总蛋白质, 具体方法可参
考本课题组以前的报道[29]。
1.2.4 WB 分析和信号采集 WB 分析实验至少
重复 3次, 使用 HSP (heat shock protein)蛋白质的检
测信号作为等量加样的内参[34]。用 ImageJ软件扫描
X 光片上的条带信号, 计算平均值及标准差, 比较
其信号的相对强度。
1.2.5 生物信息学分析 从水稻基因组数据库中,
根据几丁质酶蛋白质的 Locus 号, 获得几丁质酶基
因编码的蛋白质序列, 使用 ClustalW 进行多序列比
对, 参数使用默认值, 使用 Mega4.0 进行系统树分
析, 应用临近法, boot strap次数为 2000。用 SMART
软件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)进行结构域分
析。从水稻基因组注释项目(rice genome annotation
project)数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)找到
目标几丁质酶基因后下载 RNA-Seq 产生的 FPKM
(reads per kilobase of exon model per million mapped
reads)数据, 其高通量测序产生的转录原始数据可从
NCBI 的 SRA (Sequence Read Archive)数据库(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)根据文库的编号下载。
2 结果与分析
2.1 水稻 PR3家族的几丁质酶基因
水稻 PR3家族中有 19个几丁质酶成员[33], 表 1
列出了这些几丁质酶编码基因的 LOC号、注释和分
子量, 水稻 PR3 家族几丁质酶蛋白质的分子量大都
在 30 kD 左右, 最高为 36.7 kD, 最低的为 CHIT9,
只有 15.3 kD (154个氨基酸)。用 SMART软件预测
几丁质酶的结构域(图 1), 可以看出几丁质酶的主要
结构域有 N 端的信号肽、几丁质结合域和催化域,
其中, CHITC1 和 CHITC2 的催化域属于糖苷酶 18
家族, 而其余几丁质酶的催化域都属于糖苷酶 19家
族。需要指出的是, CHIT9中没有明显的几丁质结合
域和催化域。Nakazaki等[9]曾将当时鉴定的 12个水
稻 PR3 几丁质酶划分了类别(Class), 在此基础上,
我们补充了新鉴定的 7 个几丁质酶, 将 19 个水稻 PR3
几丁质酶进行了分类(图 2), 类别编号列于聚类图的
右侧, 其中最初鉴定的 12个水稻 PR3几丁质酶的分
类结果与原报道相同。从图 2 可见, 大部分编号相
近的几丁质酶的相似度较高, 如 CHIT7 和 CHIT8,
CHIT10 和 CHIT11, CHIT12 和 CHIT13, CHIT2 和
CHIT3 以及 CHITC1 和 CHITC2 等。其中 CHITC1
和 CHITC2 与其他几丁质酶的亲缘关系较远, 但整
个 PR3家族几丁质酶的相似度较高。属于 Class I的
几丁质酶有 11个成员, 缺失几丁质结合域的Class II
成员有 CHIT14、CHIT15和 CHIT16, 拥有糖苷酶 18
家族的催化域的 Class III成员有 CHITC1和 CHITC2,
而 CHIT1、CHIT2和 CHIT3的催化域中有 4段缺失,
它们组成了 Class VI亚类。
2.2 几丁质酶基因的转录分析
经由 RNA-Seq 分析获得了多个水稻组织(幼苗
期地上部或叶片、穗部、花药及雌蕊、授粉后未成
熟胚和胚乳等)的转录的 FPKM 数据(表 2), 比较不
同几丁质酶基因在参试组织中的转录强度可见 ,
574 作 物 学 报 第 40卷



图 1 水稻 PR3家族几丁质酶的结构域
Fig. 1 Predicted domains of rice PR3 family chitinases

表 1 水稻 PR3家族几丁质酶编码基因的相关信息
Table 1 Information of rice PR3 family chitinase genes
基因
Gene
编号
Locus code
简要注释
Brief annotation
分子量
Molecular weight (kD)
Chit1 Os02g39330 CHIT1—Chitinase family protein precursor, expressed 28.5
Chit2 Os04g41620 CHIT2—Chitinase family protein precursor, expressed 25.2
Chit3 Os04g41680 CHIT3—Chitinase family protein precursor, expressed 30.5
Chit4 Os03g30470 CHIT4—Chitinase family protein precursor, expressed 33.6
Chit5 Os05g33140 CHIT5—Chitinase family protein precursor, expressed 34.4
Chit6 Os05g33150 CHIT6—Chitinase family protein precursor, expressed 35.3
Chit7 Os06g51050 CHIT7—Chitinase family protein precursor, expressed 33.8
Chit8 Os06g51060 CHIT8—Chitinase family protein precursor, expressed 36.7
Chit9 Os12g13610 CHIT9—Chitinase family protein precursor, expressed 15.3
Chit10 Os01g18400 CHIT10—Chitinase family protein precursor, expressed 31.3
Chit11 Os05g04690 CHIT11—Chitinase family protein precursor, expressed 32.1
Chit12 Os08g41100 CHIT12—Chitinase family protein precursor, expressed 34.6
Chit13 Os09g32080 CHIT13—Chitinase family protein precursor, expressed 36.5
Chit14 Os10g39680 CHIT14—Chitinase family protein precursor, expressed 27.5
Chit15 Os10g39700 CHIT15—Chitinase family protein precursor, expressed 18.9
Chit16 Os03g04060 CHIT16—Chitinase family protein precursor, expressed 27.7
Chit17 Os05g33130 CHIT17—Chitinase family protein precursor, expressed 35.6
ChitC1 Os01g43220 Chitinase domain—containing protein 1 precursor, putative 29.7
ChitC2 Os10g28050 Chitinase 2—putative, expressed 33.7
第 4期 范 伟等: 水稻几丁质酶基因的转录与表达特征 575



图 2 基于氨基酸序列同源性的水稻几丁质酶蛋白质聚类分析
Fig. 2 Cluster analysis of rice chitinase proteins based on
amino acid sequences
用Mega4.0进行系统树分析, 应用临近法构建, 并做 2000次检验。
分支上的数字为贝叶斯后验概率, 分支长度表示每个核苷酸的替
代率, 对应每个位点 0.1个估计的替换的标尺列于图的左上方。
Tree: Mega4.0, Neighbor-Joining, bootstrap=2000; Bayesian poste-
rior probabilities are showed by number of branch; the length of
branch represents the substitution rate of each nucleotide, estimated
replacement corresponding scale shown in the upper left graph.

Chit6的 FPKM值最高, 表明其转录强度高, 其转录
主要发生在穗部, 尤其是在雌蕊中, 而在其他组织
中的转录强度较低, 该基因的转录呈现明显的组织
特异性。Chit12、Chit13、ChitC2和 Chit5在大部分
参试组织中都有一定的转录信号, 呈现组成型转录
的特点。Chit9在所有参试材料中都没有被检测到转
录信号, 结合 CHIT9 的结构特征可以推测该基因具
有某种特殊性。整体来看, 除 Chit6在穗部表达量较
高外, 大部分 Chit 基因在水稻苗期叶片和授粉后的
种子或胚乳中表达量均较低。根据 RNA-Seq提供的
转录信息对几丁质酶也进行了聚类分析, 结果见图
3。比较图 2 和图 3 结果可见, 2 种方法聚类的结果
有相似之处, 说明序列相似、进化关系较近的基因
可能有相似的转录谱, 表达谱的相似性支持其功能
上的互补性。
2.3 几丁质酶蛋白质在水稻叶片生长过程中的
表达分析
为了解水稻 PR3家族几丁质酶蛋白质的表达特
征, 我们制备了几丁质酶蛋白质特异的抗体, 采用
免疫印迹技术分析了不同时期的水稻叶片, 检测到
部分几丁质酶蛋白质在正常生长的水稻叶片中有表
达(图 4)。从图 4可见, CHIT5在幼苗期的表达强度
较高, 在 15 cm 幼苗及后续时期样品中均检测不到
信号。CHIT6 和 CHIT11 表现为随叶片生长表达强
度逐步提高, 在开花期达到最高峰, 成熟期有所下
降, CHIT14 的表达上调在苗期即达到最高峰, 在以
后的时期保持恒定, CHITC2的表达呈现逐步上升的
特点, 到成熟期达到最高峰。

图 3 基于转录谱的水稻 PR3家族几丁质酶的聚类分析
Fig. 3 Cluster analysis of rice chitinase genes in PR3 family based on transcription data
Shoot: 苗期地上部; 4-leaf: 四叶期; 20 d: 20 d叶片; Pre-E: 花序出现前; Post-E: 花序出现后; Anther: 花药; Pistil: 雌蕊;
DAP: 授粉后天数; Em: 胚; En: 胚乳。
Pre-E: pre-emergence inflorescence; Post-E: pre-emergence inflorescence; DAP: days after pollination; Em: embryo; En: endosperm.


576 作 物 学 报 第 40卷


表 2 水稻几丁质酶基因在不同组织中的 FPKM数据
Table 2 FPKM value of rice chitinases genes at different tissue/organs
叶片 Leaf 花序 Inflorescence 种子 Seed 基因
Gene 地上部
Shoot
四叶期
4-leaf stage
20 d Pre-E Post-E
花药
Anther
雌蕊
Pistil 5 DAP 10 DAP
25
DAP-Em
25
DAP-En
合计
Total
Chit1 27.5 6.9 13.9 0 0 4.7 3.7 1.7 0 0 0 58.4
Chit2 5.1 42.2 29.6 0 70.3 0 0 1.0 0 0 0 148.1
Chit3 1.8 27.9 16.2 0 27.8 0 0.5 1.2 0 0.6 0 75.9
Chit4 3.9 2.4 0 2.2 0.6 0.6 6.6 6.1 0 0 0 22.5
Chit5 12.6 3.0 0 2.5 137.1 7.2 174.2 0.7 0 0 0 337.4
Chit6 0 1.0 0 203.2 7592.8 857.8 16011.2 7.5 0 0 0 24673.6
Chit7 0.7 1.5 2.5 0 2.6 9.1 0 2.1 0 0 1.7 20.1
Chit8 4.7 6.3 22.0 0.6 15.2 25.9 0 5.1 1.7 1.4 16.6 99.4
Chit9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Chit10 0 2.2 1.8 0.5 1.8 0 0 0 0 0 0 6.3
Chit11 0 0.4 0 0 0 1.0 0 0 0 0 0 1.3
Chit12 21.3 22.4 7.1 23.9 69.9 16.3 34.6 77.7 60.6 18.9 54.8 407.5
Chit13 79.0 70.0 7.5 91.7 99.9 6.7 24.7 44.7 15.5 10.2 21.0 470.9
Chit14 4.4 5.0 27.0 0 2.6 1.9 0.7 4.1 0 0 0.5 46.3
Chit15 1.3 0.8 5.1 0 0.5 0.3 0 0.9 0 0 0 9.0
Chit16 40.1 3.5 22.8 0 9.6 4.5 26.9 2.5 0 0 0 109.9
Chit17 0 0.9 0.8 0 1.3 0 1.0 4.4 0.5 13.5 0 22.4
ChitC1 0.3 0.8 0.7 6.1 5.1 1.8 5.1 2.1 0 1.7 0 23.7
ChitC2 79.1 5.4 27.8 5.5 16.6 17.0 44.9 12.3 2.7 3.2 2.4 216.8
小计 Sub-total 281.7 202.7 184.7 336.3 8053.8 954.7 16334.2 174.1 81.1 49.5 96.9 26749.8
FPKM: 每百万被测到的外元中每一千碱基所含目标片段数; Pre-E: 花序出现前; Post-E: 花序出现后; DAP: 授粉后天数; Em: 胚;
En: 胚乳。表中数据来源的文库编号: 苗期地上部叶片: SRR042529; 四叶期: SRX016110; 20 d叶片: OSN_AA; 花序出现前: OSN_AC;
Post-E: 花序出现后: OSN_AB; 花药: OSN_AD; 雌蕊: OSN_AE; 授粉后 5 d: OSN_AF; 授粉后 10 d: OSN_AK; 胚: OSN_AG; 胚乳:
OSN_AH。
FPKM: fragments per kilobase of exon per million fragments mapped; Pre-E: pre-emergence inflorescence; Post-E: post-emergence in-
florescence; DAP: Days after pollination; Em: embryo; En: endosperm. Data derived from Libraries: Shoots: SRR042529;4-leaf:
SRX016110;20 d: OSN_AA; Pre-E: OSN_AC; Post-E: OSN_AB; Anther: OSN_AD;Pistil:OSN_AE; 5DAP: OSN_AF; 10DAP: OSN_AK;
Em: OSN_AG; En: OSN_AH.

图 4 水稻 PR3家族几丁质酶蛋白质在叶片中的表达谱
Fig. 4 Expression patterns of rice PR3 family chitinase proteins in normal growth leaves
上部图片为相应 CHIT特异抗体检测水稻叶片蛋白质的 WB结果; 中部为用 HSP抗体检测的 WB结果(示样品的等量加样); 下部为采
集 3次WB数据, 计算平均值和方差绘制的折线图, 纵坐标为相对信号强度, 横坐标与泳道对应。泳道 1~9分别代表水稻的苗期 1 cm、
2 cm、5 cm、10 cm和 15 cm地上部, 分蘖期叶片、孕穗期叶片、开花期叶片和成熟期叶片的总蛋白质样品。
Upper panels: WB detection of the expression of CHIT at different time points in rice leaves; Middle panels: WB detection of HSP expression
in rice leaves to demonstrate equal loading; Lower panels: Lanes 1–9: Protein samples isolated from normal rice leaves at seedling stage
(1 cm, 2 cm, 5 cm, 10 cm, and 15 cm), tillering stage, booting stage, flowering stage and mature stage, respectively.
第 4期 范 伟等: 水稻几丁质酶基因的转录与表达特征 577


2.4 几丁质酶蛋白质在水稻抗白叶枯病过程中
的表达
白叶枯病是危害水稻生产最为严重的细菌性病害,
为了检测 CHIT 蛋白质在水稻抗病过程中的表达, 我
们将白叶枯病菌接种到带有白叶枯病抗性基因 Xa21
的转基因水稻 4021叶片上。为了确证 4021对白叶枯
病菌的抗性反应, 我们在叶片接种后 15 d, 量取叶片
病斑长度, 发现 4021的病斑长度在 1 cm以下, 呈现典
型的抗病反应, 而接种 TP309 后的病斑长度在 18 cm
以上, 呈现典型的感病特征, 同时接种蒸馏水的 Mock
对照没有明显的病斑, 水稻接种白叶枯病菌后的表型
变化与我们以前的报道一致[24]。同时, 在接种后不同
时间点取样, 提取总蛋白质进行WB分析(图 5)。由图
5可见, 随接种后时间的延长, CHIT1、CHIT2、CHIT5、
CHIT6、CHIT10、CHIT15和 CHIT16蛋白质都上调或
诱导表达, 而 CHIT14、CHITC1和 CHITC2均下调表
达。由图 5 还可看出, 可检测的蛋白质表达变化大都
在接种后 3 d或以上。二个属于 Class III的几丁质酶
蛋白质(CHITC1和CHITC2)都下调表达, 而其他Class
的几丁质酶蛋白质大都上调表达。

图 5 水稻 PR3几丁质酶蛋白质在抗白叶枯病反应中的表达谱
Fig. 5 Expression patterns of rice PR3 family chitinase proteins in the incompatible reactions between rice and Xoo
上部图片为相应 CHIT特异抗体检测接种白叶枯病菌后不同时间点的水稻叶片蛋白质的 WB结果; 中部为用 HSP抗体检测的 WB结
果(示样品的等量加样); 下部为采集 3次 WB数据, 计算平均值和方差绘制的折线图, 纵坐标为相对信号强度, 横坐标与泳道对应。泳
道 1~9分别为接种后 0 h、2 h、8 h和 1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d的蛋白质样品。
Upper panels: WB detection of the expression of CHIT at different time points in the incompatible interaction between rice and Xoo; Middle
panels: WB detection of HSP expression in rice leaves to demonstrate equal loading; Lower panels: plot of average and standard deviation
among three repeats of WB analysis. Lanes 1–9: protein samples isolated from rice leaves at 0 h, 2 h, 8 h, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d, and 10 d
after inoculation with Xoo, respectively.

2.5 几丁质酶蛋白质在不同水稻-Xoo 互作反应
中的表达比较
比较几丁质酶蛋白质在 3个时间点(0 h、3 d和
5 d)在抗病(R: 4021-PXO99)、感病(S: 4021-PXO99
ΔraxST)和对照(M: 4021-H2O)反应中的表达表明(图
6), 在抗病和感病反应中 , 各几丁质酶蛋白质的表
达具有相近的模式, 与 Mock 反应都有明显的区别,
且一般在感病反应中的变化程度高于抗病反应。有
意思的是, CHIT6 在 Mock 反应中的表达量表现上升,
说明其表达可能受创伤的诱导, 其他几丁质酶蛋白
质表达量在 Mock 反应中表现一致, 说明这些蛋白
质的表达不受创伤的诱导。
578 作 物 学 报 第 40卷



图 6 PR3家族几丁质酶蛋白质在不同水稻-Xoo互作反应中的表达比较
Fig. 6 Expression comparison of rice PR3 family chitinases proteins among different rice-Xoo interactions
0 h、3 d和 5 d为水稻接种白叶枯病菌后的时间点; R: 抗病反应; S: 感病反应; M: Mock对照。上部图片为用相应 CHIT特异性抗体检
测的WB结果; 中部为用HSP抗体检测的WB结果(示样品的等量加样); 下部为采集 3次WB数据, 计算平均值和方差绘制的框图, 纵
坐标为相对信号强度, 横坐标与泳道对应(实心柱、空心柱和线条柱分别表示 R、S和 M的数据)。
0 h, 3 d, and 5 d were the time points post inoculation with Xoo; R: incompatible interaction; S: compatible interaction; M: mock control. Upper
panels: WB detection of the expression of CHIT; Middle panels: WB detection of HSP expression in rice leaves to demonstrate equal loading;
Lower panels: plot of average and standard deviation among three repeats of WB analysis (black bars, white bars and lined bars designate the data
of R, S, and M, respectively).

3 讨论
有大量报道表明, 植物几丁质酶在抵抗生物或
非生物逆境胁迫及生长发育过程中发挥作用。近年
来, 经由几丁质与受体激酶的结合启动抗病信号传
导途径的发现进一步激发了人们对几丁质酶研究的
兴趣。水稻基因组序列的解析为在全基因组水平系
统开展几丁质酶家族的研究提供了可能。
在完成水稻全基因组序列解析和基因预测及注
释的基础上, 人们可以对不同基因家族的整体情况
有更为全面的了解。通过系统的分析发现, 水稻的
病程相关基因(PR)有900多个, 占全基因组编码基因
的 2%左右, 其中 PR3为几丁质酶, 在水稻中注释为
几丁质酶的基因共有 19个[33]。根据基因组注释提供
的几丁质酶氨基酸序列, 我们对几丁质酶进行了聚
类分析, 进而对其蛋白质结构域进行了预测, 并将
其划分为 4个亚类。随着高通量测序技术的进步, 基
于深度测序技术获得的转录谱数据更为灵敏、准确,
为转录谱的分析提供了重要的资源。本试验发现 ,
在正常生长的水稻组织中, 几丁质酶基因的转录是
相当普遍的, 其转录也佐证了这些基因在正常发育
过程中可能发挥功能。Chit6在雌蕊中有很高的转录
丰度, 是典型的组织特异性转录基因, 还发现了多
个组成型转录的几丁质酶基因, 也注意到在所有参
试材料中未检测到 Chit9表达。
基于氨基酸序列相似性和基于表达谱相似性的
二种聚类分析表明, 二者间有一定的相似性, 前者
可能来自进化过程中的关联, 后者可能支持其功能
的互补性, 暗示亲缘关系相近的基因更可能有功能
的互补性。随着转录谱数据的积累, 可能在更大范
围上分析基因转录的关联, 从而获得其功能以及功
能互补相关的线索。我们对 PR3家族几丁质酶基因
的分析可以说是进行了一个尝试。
检测水稻 PR3家族几丁质酶蛋白质在正常生长
及与白叶枯病菌互作的叶片中的蛋白质表达, 仅发
现5个几丁质酶蛋白质在正常叶片中有表达, 而在水
稻与 Xoo 不亲和反应中, 有10个几丁质酶蛋白质的
第 4期 范 伟等: 水稻几丁质酶基因的转录与表达特征 579


表达发生了变化, 其中 CHIT1、CHIT2、CHIT5、
CHIT10、CHIT15和 CHIT16的表达都是受诱导后发
生的, 多个几丁质酶的表达受白叶枯病菌接种的诱
导, 提示它们在抗病反应中可能发挥作用。有3个几
丁质酶蛋白质的表达在接种白叶枯病菌后下调, 它
们是 CHIT14、CHITC1和 CHITC2, 提示它们可能发
挥负调控的作用, 另外, CHITC1和 CHITC2都属于
ClassIII, 提示其表达下调可能是该类别几丁质酶的
特征。有意思的是, CHIT6在对照(Mock)反应中表达
上调, 可能是受创伤诱导的基因, 暗示其启动子与
创伤的关联性。
我们试图分析转录和蛋白质表达数据的相关性,
但并没有发现二者的明显关联, 实际上, 转录和翻
译是二个层面的调控机制, 有大量的数据揭示了二
者的独立性。从转录和蛋白质表达特征都可以看出,
水稻几丁质酶在正常生长发育中可能发挥作用, 在
水稻-Xoo 互作过程中可能发挥作用。但值得指出的
是, 在水稻中并没有发现几丁质, 几丁质也不是白
叶枯病菌这类细菌的组成成分, 那么在水稻正常生
长中几丁质酶的底物是什么?其功能又是通过什么
方式发挥的呢？已经鉴定的水稻 bc15基因编码几丁
质酶(Os09g32080, 本文中 Chit13), 该基因也呈组成
型表达, 但体外表达的蛋白质没有检测到几丁质酶
活性[18], 深入开展酶学分析将有助于了解其功能的
生化机理。
本文制备了水稻 PR3 家族几丁质酶蛋白质的抗
体, 并用免疫印迹揭示了其在不同条件下的蛋白质
表达谱。这种基于抗体的策略[35]可以对特定目标蛋白
质开展研究, 其灵敏度较高。此外, 这些抗体也将是
几丁质酶蛋白质定位、免疫沉淀等研究的重要资源。
本研究对水稻 PR3家族的 19个成员的聚类分析、
结构域分析和亚类划分, 并根据深度测序获得的转录
数据鉴定了组成型和组织特异型转录的基因, 在此基
础上调查了正常生长和收白叶枯病菌侵染后的水稻叶
片中的蛋白质表达特征 , 发现随水稻的生长发育
CHIT6、CHIT14、CHITC1、CHITC2为上调表达, CHIT5
为下调表达; 在水稻与 Xoo 互作中 CHIT1、CHIT2、
CHIT5、CHIT6、CHIT10、CHIT15和 CHIT16蛋白质
为上调表达, CHIT14、CHITC1和CHITC2为下调表达,
另外, CHIT6的表达可能受创伤诱导。
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