全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(9): 1538−1547 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171591)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10A102)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 华金平, E-mail: jinping_hua@cau.edu.cn, Tel: 010-62734748
第一作者联系方式：E-mail: lishuang2070114@163.com
Received(收稿日期): 2012-12-04; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130709.1559.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01538
哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系 orf160的克隆及遗传转化
李双双 1 刘国政 1 陈志文 1 王玉美 2 华金平 1,*
1 中国农业大学农学与生物技术学院 / 杂种优势研究与利用教育部重点实验室 / 作物遗传改良北京市重点实验室, 北京 100193;
2 湖北省农业科学院经济作物研究所, 湖北武汉 430064
摘 要: 以哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系及其保持系、恢复系为材料, 克隆并测序线粒体功能基因的侧翼序
列。通过生物信息学分析, 在 atp4下游发现一个哈克尼西棉细胞质不育系特有的 orf160。orf160全长 480 bp, N端与
atp6序列部分同源, C端序列与核 序列部分同源; 编码的 159个氨基酸序列, 与膜蛋白、细胞周期蛋白具有部分同源
性。以含有线粒体导肽的 GFP 瞬时表达载体转化后, 在洋葱表皮的细胞膜上观察到绿色荧光, 表明线粒体定向载体
正常表达。构建酵母和植物表达载体, 分别转化酵母、烟草和拟南芥; 同对照相比, 转基因酵母菌斑畸形且生长缓慢;
转基因拟南芥和烟草种子大部分畸形, T1和 T2代植株的结实率和种子发芽率降低, 花粉着色比野生型浅。结果表明,
orf160基因的表达影响受体正常发育。
关键词: 棉花; 线粒体 DNA; 细胞质雄性不育; orf160
A Unique orf160 Cloning and Genetic Transformation of Gossypium harknessii
Cytoplasmic Male Sterile Line in Upland Cotton
LI Shuang-Shuang1, LIU Guo-Zheng1, CHEN Zhi-Wen1, WANG Yu-Mei2, and HUA Jin-Ping1,*
1 College of Agronomy and Biotechnology / Key Laboratory of Crop Heterosis and Utilization of Ministry of Education / Beijing Key Laboratory of
Crop Genetic Improvement, China Agricultural University, Beijing 100193, China; 2 Institute of Cash Crops, Hubei Academy of Agricultural Sciences,
Wuhan 430064, China
Abstract: The cytoplasmic male sterile (CMS) line with the cytoplasm of Gossypium harknessii has been reported for 50 years,
and hybrids have been used in commercial production, but the mechanism remains obscure. The flanking sequences of mitochon-
drial functional gene from “three lines” (CMS line, corresponding maintainer and restorer line) were analyzed. A specific ORF
(open reading frame) of 480 bp, orf160 gene was cloned in CMS line, which located in the downstream of atp4, its N-terminal
was homologous with atp6, and the C-terminal was homologous with nuclear sequence, and encoded 159 amino acids that were
homologous with membrane proteins and cell cycle protein. The subcellular localization of onion epidermal cells showed the
green fluorescence on cell membranes, so the mitochondria-targeting carrier can be normally expressed. The expression vectors
were constructed and transformed into yeast, arabidopsis and tobacco, respectively. Compared with control, the modified yeast
was abnormal and grew slowly; transformed arabidopsis and tobacco showed that the most seeds were abnormal, small and shriv-
eled; lower seed setting rate, germinate activety and pollen grain vitality showed in individuals in T1 and T2 generations. All these
showed that orf160 affects on the development of transformants, and further research should verify if the function of orf160 re-
lates to the cytoplasmic male sterility of cotton.
Keywords: Gossypium; Mitochondrial DNA; Cytoplasmic male sterility; orf160
线粒体编码的蛋白质主要是氧化呼吸链的结构
蛋白和生物合成蛋白 , 在能量代谢中起关键作
用[1-2]。植物线粒体影响一些重要的农艺性状, 还参
与细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)
形成与遗传。植物细胞质雄性不育在高等植物中普
遍存在, 早前在 43个科 162个属 320种植物中发现
617 例天然或种属间杂交来源的雄性不育[2-3]。CMS
与线粒体 DNA 的重组重排和一些基因的特异性表
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达有关[4]。相关研究在杂种优势利用和核质互作分
析方面具有重要的意义。
植物的线粒体基因组非常复杂[5-6], 包括内含子
的顺式和反式剪切[7], 重复序列的重组重排[8], 外源
序列的迁入[9], 亚分子计量序列的变异[10], RNA 加
工[11], RNA 编辑, 转录后调控[12-14], 细胞核基因的
调控等[15-18]。这些伴随进化而不断发生的变异, 是
引起细胞质雄性不育的重要原因[6]。
迄今, 已在许多植物中相继发现 CMS基因并阐
释其败育机制, 例如玉米的 CMS-T (urf13/atp4) [19],
CMS-S (orf355+orf77/atp9) [20], 芸薹属 CMS-nap
(orf222/nad5c/orf139) [21], CMS-pol (orf224/atp6) [22],
CMS-ogrua (orf138/atp8) [23], CMS-junce a (orf108/
atpA)[24], 小麦 CMS-T (orf256/cox1) [25], 向日葵
CMS-pet1 (orf522/atpA)[26], 水稻 CMS-BT (orf79/atp6)[27],
CMS-HL (orfH79/atp6)[28], 萝卜 CMS-kos (orf125/
atp8) [29], 以及矮牵牛 CMS-S (pcf/nad3/rps12) [30]。
这些 orf具有胞质和种属特异性, 多由线粒体保守序
列与未知序列组成 [31]; 与功能基因共转录, 影响线
粒体中 ATP 合成途径, 造成能量供给不足, 致使花
器官不能正常行使功能, 导致败育。
棉花是重要的天然纤维作物, 同时也是重要的
油料作物 , 其主要栽培种陆地棉(Gossypium hirsu-
tum L.)具有显著的杂种优势[32]。棉花细胞质雄性不
育研究始于 20 世纪 60 年代, 通过远缘杂交和回交
获得以陆地棉核为背景的分别具有亚洲棉 (G. ar-
boreum L.)、异常棉(G. anomalum Wawr. & Peyr)和哈
克尼西棉(G. harknessii Brand.)细胞质的胞质雄性不
育系, 其中哈克尼西棉细胞质不育系的不育性遗传
稳定。1988 年我国实现了哈克尼西棉胞质 CMS 三
系配套, 稍后的陆地棉三系、海岛棉三系配套研究,
为陆地棉三系育种提供了丰富的基础材料; 棉花三
系广泛应用于生产实践中, 但是棉花的细胞质雄性
不育、育性恢复以及杂种优势等的分子遗传机理仍
不清楚[33-34]。现有研究主要集中于线粒体基因组结
构、转录和翻译产物等方面的差异, 然而结果不尽
相同。采用 RAPD技术分析棉花 CMS三系线粒体基
因组和叶绿体基因组的差异发现, CMS 主要与线粒
体异常有关。以哈克尼西棉 CMS系和保持系的花药
和黄化苗为材料 , 分别对线粒体蛋白质进行
SDS-PAGE、RAPD和 RFLP分析比较, 不育系与保
持系线粒体相比, 发现缺少一个大小为 1.9 kb 与
cox2 基因具有同源序列的片段, 表达产物缺少约 31
kD的多肽[35]。通过 RFLP分子标记技术, 发现 cox2
探针在陆地棉不育系 CMS-D2-2比保持系多出 1条片
段[36]。以哈克尼西棉 CMS系和保持系为材料, 得到
扩增片段大小存在差异的 atpA 基因及其侧翼序列;
RACE方法获得 atpA基因 cDNA全长测序后发现, 不
育系为 1582 bp, 保持性为 1566 bp, 两者预测的编码
蛋白质不同, 认为这可能是导致 CMS的原因[37-38]。
本研究通过比较基因组方法 , 克隆一个位于
atp4 下游的差异 orf160, 构建表达载体, 进行转基
因验证, 通过转化酵母, 发现 orf160 影响酵母正常
生长; 在拟南芥和烟草中, orf160的表达可能影响转
基因后代花粉的形成, 导致后代结实率和种子活力
下降, 可能在导致不育方面发挥一定的作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
陆地棉不育系 2074A 遗传稳定, 是哈克尼西棉
细胞质CMS-D2-2不育系, 由原始不育系DES-HAMS
277 经过多代回交选育而来, 系谱为({[(DES-HAMS
277×E369)×中 7] BC13F1×鄂棉 18}BC12F1×徐 244)
BC6F1。保持系 2074B是苏棉 20 (徐棉 244), 恢复系
E5903是 Z834R, 来自 DES-HAF 277的多代选育后
代[33]。
哥伦比亚野生型拟南芥 (Arabidopsis thaliana
columbia)和本氏烟草(Nicotiana benthamiana)用于转
化。大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α, 根瘤农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens) GV3101, 植物表达载体
pCAMBIA2301M 和 pCF203 、 酵 母 表 达 载 体
p426HXT7均由本实验室保存。
1.2 线粒体 DNA和 RNA的提取
棉花线粒体 DNA/RNA 提取, 包括线粒体分离
和线粒体裂解 2个主要环节[39]。
将脱绒的棉花种子种植于经过灭菌处理的沙土,
28℃暗培养 4~6 d; 取 200~300 g黄化苗在匀浆缓冲
液(300 mmol L–1 蔗糖, 20 mmol L–1 KH2PO4, 10
mmol L–1 KCl, 5 mmol L–1 EDTA-Na2, 10 mmol L–1
Tris-HCl, 0.1% (W/V) BSA, 6 mmol L–1 β-mer-
captoethanol, pH 7.5)中差速匀浆, 6层纱布过滤, 低
速离心去除细胞核和细胞碎片; 用漂洗缓冲液(300
mmol L–1蔗糖, 20 mmol L–1 KH2PO4, 10 mmol L–1
KCl, 5 mmol L–1 EDTA-Na2, 10 mmol L–1 Tris-HCl,
0.1% (W/V) BSA)漂洗 2次, 去除大分子杂质; 获得
粗制线粒体, 加入悬浮缓冲液用毛刷将其轻轻刷起,
转到蔗糖密度梯度(蔗糖梯度 18%、36%、52%)上,
40 000×g 离心 90 min, 吸取 36%~52%之间的线粒体,
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用漂洗缓冲液漂洗 2次, 即为完整的线粒体。
用 CTAB裂解液(0.1 mol L–1 Tris-HCl, 0.02 mol
L–1 EDTA-Na2, 2% CTAB, 1.4 mol L–1 NaCl, 2% PVP
40, 2%~3% β-疏基乙醇)裂解线粒体, 无水乙醇沉淀
DNA, 70%乙醇漂洗 2次, 得到纯度较高、较完整的
线粒体 DNA。
用 DEPC 处理过的 CTAB 裂解液裂解线粒体,
无水乙醇沉淀 RNA, 得到纯度较高、较完整的线粒
体 RNA (华金平等 , 中国发明专利 , 申请号 2010
10268760.2), 利用 TaKaRa试剂盒, 随机引物反转录
获得线粒体 cDNA。
1.3 不育相关基因 orf的克隆
利用生物信息学比较不育系、保持系和恢复系
线粒体功能基因的侧翼序列, 获得差异基因 orf, 设
计相应引物, 扩增全长并测序验证。利用对应的 orf
引物, 以 RT-PCR检测差异 orf在“三系”中的表达情
况, 最终确定差异 orf160。
1.4 表达载体的构建与转化
以溶菌酶法获得酵母 Y189 的 DNA, 扩增获得
cox4的序列[40-41]。连接至 pMD18-T easy vector, 挑
选单克隆测序, 选择正向插入的单克隆。利用 Sal I
和 Hind III双酶切 pMD18-cox4质粒 DNA和 orf160,
T4 连接, 用引物 cox4F 和 orf160R2 组合扩增 cox4
和 orf160, 将酶切位点替换为 BamH I和 Sac I, 并用
这 2个限制性内切酶对 PCR产物、pCAMBIA2301M
和 pCF203质粒 DNA进行双酶切, T4连接, 转化大
肠杆菌感受态 DH5α, 挑取阳性克隆进行验证, 即完
成含有线粒体导肽(cox4)的植物表达载体和 GFP 瞬时
表达载体的构建 , 重组质粒分别被命名为 pCAM
BIA2301M-cox4-orf160 和 pCF203-cox4-orf160。将构
建好的植物表达载体和瞬时表达载体提取质粒, 转
化农杆菌感受态 GV3101, 用于遗传转化。利用农杆
菌介导法将植物表达载体转化拟南芥和烟草。利用
基因枪法将瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞, 观察
线粒体导肽定位情况。
酵母表达载体构建: 在 pMD18-T easy vector上
直接用 BamH I和 Hind III双酶切质粒 DNA, 将回收
片段与 p426HXT7 连接 , 即为 p426HXT7-cox4-
orf160; 试验处理还包括阳性对照 (p426HXT7-
GhPAT1), 插入基因 GhPAT1和阴性对照(p426HXT7)。
转化试验 3 次重复, 分别涂于尿嘧啶缺失抗性平板,
观察酵母生长情况。
1.5 转基因后代、阳性植株检测与育性分析
阳性植株的鉴定, 通过 2 轮 4 次筛选。首先在
50 mmol L–1卡那霉素 MS平板上筛选抗性绿苗, 移
栽绿苗; 三叶期取叶片提取总 DNA, 用卡那霉素抗
性基因标记 Kan、线粒体导肽 cox4 标记和基因
orf160标记引物扩增。

表 1 本研究使用的引物序列
Table 1 Oligonucleotides used in this study
引物
Primer
引物序列
Sequence (5′–3′)
酶切位点
Restriction site
cox4F CGGGATCCATGCTTTCACTACGTCAATCTATAAGATTTTTCAAGCCAGCCACAAGAACTTTG BamH I
cox4R ATGGTACCCTGAAGCAGATATCTAGAGCTACACAAAGTTCTTGTGGCTGGCTTG Kpn I
orf160F ACTGTCGACATGATTGGCCGTCACTGT Sal I
orf160R1 CCAAGCTTCAGGATTGGAAGGGATGG Hind III
orf160R2 CGAGCTCGCAGGATTGGAAGGGATGG Sac I
orf160F3 ATGATTGGCCGTCACTGT
orf160R3 CAGGATTGGAAGGGATGG
orf160F4 ATGTCTTTCGTCACCAGC
orf160R4 TCTTTCCGCATCATCACC
orf160F5 ATAGTTAGTTATCAACCGCCCCAT
orf160R5 GGTTTCTCCGTCCGAACTTCTTTG
Kan1F CACTGAAGCGGGAAGGGACT
Kan1R CGATACCGTAAAGCACGAGGAA
下画线标注酶切位点。The restriction enzyme sites are underlined.

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拟南芥 T1和 T2代种子, 用经 5%的次氯酸钠溶
液(0.1%的Triton X-100)表面消毒 15 min和灭菌水洗
涤; 铺种在 50 mmol L–1卡那霉素的 MS 培养基上,
4℃春化处理 2 d后, 转至 21℃、光照 16 h/黑暗 8 h
和 60%~75%相对湿度的转基因室生长一周后, 统计
分离比。选择绿苗移栽到无菌土中(蛭石和营养土,
体积比 2∶1); 单株收获 T1 和 T2 代植株, 统计结
实率。
用 5%的次氯酸钠溶液(0.1%的 TritonX-100)表
面消毒烟草 T1和 T2代种子 20~30 min, 用灭菌水洗
涤后铺种含 50 mmol L–1卡那霉素的 MS培养基, 在
28℃、光照 16 h/黑暗 8 h和 60%~75%相对湿度的条
件下培养 1 周, 调查 T2代烟草发芽率。烟草苗直接
在 28℃、光照 16 h/黑暗 8 h和 60%~75%相对湿度的
无菌室中培养。烟草 T2代植株生长缓慢, 且长势弱。
取开花当天的烟草 T1代和拟南芥 T1、T2代植株花粉,
利用 I2-KI 染色, 观察败育情况。单株收获, 统计结
实率。
将转化后的酵母涂在尿氨酸缺失的 YPD (yeast
extract peptone dextrose)培养基上, 30℃培养 2~3 d,
观察酵母生长情况, 分析 orf160 表达产物对酵母生
长的影响。
2 结果与分析
2.1 orf160基因的克隆与序列分析
orf160上游为功能基因 atp4。设计不同引物 PCR
验证 , 在保持系和恢复系中没有获取扩增条带
(图 1), 证明 orf160在保持系和恢复系中不存在。
在不育系中扩增获得 orf160全长 480 bp, N端与
atp6编码序列同源, C端含有部分序列与核编码序列
同源, 编码 159 个氨基酸; 氨基酸序列与链霉菌属
蛋白序列具有一定的同源性, 与紫黑链霉菌膜蛋白
[putative membrane protein, gi|345007990 (Strepto-
myces violaceusniger Tu 4113)]和灰黄链霉菌细胞周
期蛋白(cell cycle protein, gi|302559642 (Streptomyces
griseoflavus Tu4000))同源性分别为 28%与 31%
(图 2)。



图 1 orf160基因的克隆
Fig. 1 Cloning of orf160
不同 mtDNA模板和 3对 orf160引物的 PCR扩增结果。图中,
mtDNA模板依次是: 1, 4, 7: 保持系 2074B; 2, 5, 8: 恢复系
E5903; 3, 6, 9: 不育系 2074A。M: D2000。样品 1, 2, 3的扩增引
物为 orf160F3与 orf160R3; 样品 4, 5, 6的扩增引物为 orf160F4
与 orf160R4; 样品 7, 8, 9的扩增引物为 orf160F5与 orf160R5。
PCR amplified products of mtDNA in different lines using
different primers of orf160. 1, 4, 7: maintainer line 2074B; 2, 5, 8:
restore line E5903; 3, 6, 9: CMS line 2074A. Primers used in am-
plification as follow: orf160F3 and orf160R3 for the sample 1, 2, 3;
orf160F4 and orf160R4 for the sample 4, 5, 6; orf160F5 and
orf160R5 for the sample 7, 8, 9.



图 2 orf160基因序列分析
Fig. 2 Sequence analysis of orf160
ORF160蛋白与其他相关蛋白的氨基酸序列比对分析。序列比对图中, 完全相同与基本相同的氨基酸残基分别用黑色与灰色背景表示。
Amino acid sequence alignment of ORF160 with other related proteins. Identical and conservative residues are
denoted by black shading, grey shading, respectively.
1542 作 物 学 报 第 39卷

2.2 表达载体构建
以酵母 DNA 为模板, 扩增获得线粒体导肽 78
bp, 引物参见 Kim 等 [41], 插入到 pMD18-T easy
vector, 单克隆测序; 选择正向插入 cox4片段的单克
隆, 提取质粒 DNA, 酶切回收获得 cox4 片段; 另外
从不育系线粒体 DNA 中扩增 orf160, 酶切回收, 分
别将 cox4 和 orf160 插入到载体 pCAMBIA2301M,
重组质粒被命名为 pCAMBIA2301M-cox4-orf160
(图 3-A)。同时, 构建了GFP (green fluorescent protein)
瞬时表达载体, 将 cox4 和 orf160 片段插入到含有
GFP 基因的载体 pCF203 中 , 重组质粒被命名为
pCF203-cox4-orf160 (图 3-B), 转化洋葱表皮细胞 ,
确定 cox4 导肽的作用。在荧光电子显微镜下, 只有
细胞膜上观察到绿色荧光, 而细胞核中没有观察到
绿色荧光, GFP 只被定位到细胞膜的周围(图 4-A);
而阳性对照即空载质粒转化洋葱表皮细胞, 细胞膜
和细胞核中都能观察到绿色荧光, GFP 被定位到细
胞核和细胞膜上(图 4-B)。



图 3 植物表达载体的构建
Fig. 3 Vector of pCAMBIA2301M-cox4-orf160 and pCF203-cox4-orf160 for plant transformation
A: 拟南芥和本氏烟草表达载体 pCAMBIA2301M-cox4-orf160; B: 瞬时表达载体 pCF203-cox4-orf160。
A and B: Constructed vectors of cox4 and orf160 for Arabidopsis and Nicotiana Benthamiana transformation. The diagram shows the strategy
for constructing each cloned gene into the modified pCAMBIA2301M and pCF203 plant transformation vector. The GFP indicates the green
fluorescent protein (GFP). NPTII: Neomycin phosphotransferase II gene; MCS: multiple cloning site; NOS ter: NOS terminator site; LB: left
border; RB: right border; Kmr: kanamycin resistance gene.



图 4 GFP瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞的结果
Fig. 4 Results of transformation of onion epidermal cell with
GFP transient expression vector
A: 瞬时表达载体荧光显微镜下镜检; B: 瞬时表达载体阳性对照。
A: Image of pCF203-cox4-orf160 GFP fluorescence in the onion
transient expression assay; B: Image of pCF203 GFP fluorescence
in the onion transient expression assay.

构建酵母表达载体, 以 p426HXT7 为载体, 插
入 cox4 和 orf160, 即为 p426HXT7-cox4-orf160; 同
时将阳性对照 p426HXT7插入棉花功能基因GhPAT1
(载体 p426HXT7-GhPAT1)(图 5和图 6), 转化后涂在
尿氨酸缺失的 YPD培养基上, 30℃培养 2~3 d, 观察
到空白对照和阳性对照材料酵母转化正常 , 而
p426HXT7-cox4-orf160 转化后酵母生长异常, 酵母
斑较少(图 7)。说明 orf160的表达对酵母的生长有一
定抑制作用。
2.3 转基因后代分析
将拟南芥 T1 植株铺种在 50 mmol L–1 卡那霉
素抗性的 MS 平板上 , 筛选抗性绿苗 (图 8-A);
提取移栽绿苗总 DNA, 利用卡那霉素抗性标记
(NPTII) Kan进行 PCR检测(图 9), 从 T1代植株筛选
得到 3棵阳性植株, 编号为 T101、T102和 T103, 其
中 T103 植株长势较好, T101 和 T102 生长较慢, 结
实率低。
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图 5 酵母表达载体构建
Fig. 5 Vector construction of p426HXT7-cox4-orf160 and p426HXT7-GhPAT1
A: 含有 cox4-orf160酵母表达载体 p426HXT7-cox4-orf160构建图; B: 含有 GhPAT1阳性对照载体 p426HXT7-GhPAT1构建图。
A: Vector construction of p426HXT7-cox4-orf160; B: Vector construction of p426HXT7-GhPAT1 as a control.



图 6 酵母表达载体构建酶切验证
Fig. 6 Verification of vector construction for yeast transform-
ing by restriction endonuclease analysis
限制性内切酶 BamH I和 Hind III双酶切验证载体构建, 1和 2阳
性克隆质粒 DNA经过 BamH I和 Hind III双酶切电泳检测结果;
M1: marker D2000; M2: marker D15000。
Restriction analysis of p426HXT7-cox4-orf160 using BamH I and
Hind III two restriction endonuclease; M1: marker D2000; M2:
marker D15000.
T2 代植株黄绿苗符合 1∶3 分离比 (原始数
据 : T101 为 12∶32, T102 为 29∶32, T103 为
25∶93)。在电子显微镜下观察 T103的 T2代植株花
器官 , 花粉少量散出 (图 8-B), 花粉粒着色浅 (图
8-C); 野生型本氏烟草花粉粒饱满, 且染色较深(图
8-D)。
对转基因烟草 T1代植株, 首先进行 PCR 检测,
筛选出阳性植株(图 10), 收获 17 个阳性单株, 依次
编号为 T01-T17。然后, 对 T1代植株 T01 单株的花
粉进行 I2-KI 染色, 发现花粉粒大小不均一, 形状不
同 , 着色深浅也不同 , 说明花粉粒活性不相同 , 畸
形的花粉粒可能无活性或活性较低(图11-a); 而野生
型烟草的花粉粒着色较深(图 11-d)。观察种子发现,
T1代转基因烟草种子多数不饱满、畸形干瘪(图 11-b,
e)。种子萌发实验表明, T1代种子发芽率为 67.3% (图
11-c), 野生型烟草的种子发芽率为 99.7% (图 11-f),
说明 orf160 的表达影响转基因烟草后代的种子
发育。



图 7 酵母表达载体转化子检测
Fig. 7 Results of the yeast transformants
A: 空白对照; 空载体 p426HXT7转化酵母; B: 阳性对照; p426HXT7-GhPAT1转化酵母; C: p426HXT7-cox4-orf160转化酵母。
A: Yeast colonies transformed by vector p426HXT7; B: yeast colonies transformed by vector p426HXT7-GhPAT1; C: Yeast colonies
transformed by vector p426HXT7-cox4-orf160.
1544 作 物 学 报 第 39卷



图 8 转基因拟南芥生物学表型观察
Fig. 8 Biological phenotypes of transgenic Arabidopsis
A: T1代转基因拟南芥抗性平板上筛选阳性植株; B: T2代转基因拟南芥花器官; C: T2代转基因拟南芥花粉粒 I2-KI染色(×100);
D: 野生型拟南芥花粉粒 I2-KI染色(×100)。
A: transgenic Arabidopsis plants of T1 generation on resistance flat-panel; B: floral organs of T2 generation transgenic Arabidopsis;
C: I2-KI stained pollen grains of T2 generation transgenic Arabidopsis; D: I2-KI stained pollen grains of wild Arabidopsis.



图 9 转 cox4-orf160基因拟南芥 Kan标记 PCR检测结果
Fig. 9 PCR result of transgenic cox4-orf160 Arabidopsis plants with primer of Kan resistance mark
M: marker D2000; A: T1代阳性单株; B: T2代单株。
M: marker D2000; A: monoclonal individuals from T1 generation; B: monoclonal individuals from T2 generation.



图 10 转基因烟草 T1代阳性株 Kan标记 PCR检测结果
Fig. 10 PCR result of transgenic cox4-orf160 tobacco lines
with primer of Kan resistance mark
M: marker D2000; 1~8: T1代阳性单株。
M: marker D2000; 1–8: T1 monoclonal individuals.

调查 10个转基因烟草单株结实率、株高和第一
果枝高度(图 12), 发现野生型植株和转基因植株第
一果枝高度(P=0.02)和第一果节位(P=0.035), 存在
显著差异, 其余性状如株高、果枝数和种子总数无
显著差异, 种子总数虽然未达显著差异, 但是总体
要比野生型的数量少, 而且有一株没有结实, 说明
转基因 orf160 对种子发育和节间伸长有一定的影
响。
种植拟南芥 T1代 3 个单株全部种子, 随机选择
T2代单株移栽。PCR 鉴定的阳性植株 119 个, 其中
正常植株 32株, PCR鉴定的阴性植株的表型与野生

图 11 转基因烟草 T1代生物学表型观察
Fig. 11 Biological phenotypes of T1 generation transgenic
tobacco
a: T1代转基因烟草花粉粒 I2-KI染色; d: 野生型花粉粒 I2-KI染
色; b: T1代转基因烟草种子; e: 野生型烟草种子; c: T1代转基因
烟草种子发芽试验; f: 野生型烟草种子发芽试验。
a: I2-KI stained pollen grains of T1 generation transgenic tobacco;
d: I2-KI stained pollen grains of wild type tobacco; b: seeds of T1
generation transgenic tobacco; e: seeds of wild type tobacco;
c: seeds germination test of T1 transgenic tobacco; f: seed
germination test of wild type tobacco.

型相同, 完全可育; 部分不育株 73株, 完全不育株 14
株, 即约 70%的植株表现部分不育或完全不育(表 2)。
第 9期 李双双等: 哈克尼西棉细胞质陆地棉雄性不育系 orf160的克隆及遗传转化 1545




图 12 转基因烟草 T1代植株和野生型植株生物学性状比较
Fig. 12 Comparison of biological characters on individuals of T1 transgenic tobacco and wild type tobacco
A: 转基因与野生型烟草 T1代植株株高, 第一果枝高度和果枝数; B: 转基因与野生型烟草种子数。
A: plant height, the first branch height and fruit branch number of transgenic T1 generation plant and wild type tobacco;
B: total seed number of transgenic and wild type tobacco.

转基因烟草 T1代 12 个单株, 种植每个单株 T2
代的 6个单株, 共 72个单株。PCR随机鉴定、移栽
的阳性单株 37个, 25个植株表现部分不育或完全不
育(表 2)。
在调查拟南芥转基因植株中, T3 代没有发现明
显的雄性不育共分离的现象, 分离比差异大(表 3)。
对于 T0118 植株 , T3 代植株没有黄苗 , 全是绿苗;
T0128、T0215、T0369和 T0360的 T3代植株后代也
多是绿苗。
3 讨论
卡那霉素基因作为选择标记基因之一 , 应用
于转基因实验的大田试验植株活体表型鉴定和室
内阳性植株鉴定 , 方便快捷。pCAMBIA2301M 载
体中 T-DNA 内的 NPTII 是新霉素磷酸转移酶基
因 , 编码蛋白具有卡那霉素抗性 , 用于转基因植
株的筛选; T-DNA 外的 Kmr 也是编码卡那霉素抗
性基因, 用于载体构建过程中阳性单菌落筛选。而
用于 PCR 筛选的 Kan 标记是根据这个基因的保守
序列设计的, 在阳性单克隆和阳性植株中都能被检
测到。
未知功能 orf存在部分同源序列。这种同源性与
线粒体基因组、核基因组进化是否相关, 目前还不
清楚。orf160的 N端与线粒体功能基因 atp6序列部
分同源, C端与核序列部分同源。其他作物不育基因
结构已有类似的报道 , 如水稻 BT-orf79 和 HL-

表 2 转 orf160基因拟南芥和烟草后代育性
Table 2 Male sterility of transgenic orf160 plants from Arabidopsis and tobacco
受体物种
Species
T1代不育植株
数目
No. of T1 sterile
plants
T2代 PCR鉴定
阳性植株数目
No. of PCR positive
transgenic plants (T2)
T2代半不育植株数目
No. of semi-sterile
plants (T2)
T2代完全不育
植株数目
No. of sterile
plants (T2)
T2代不育和正常植株比例
Ratio of sterile plants to
normal plants
Arabidopsis 3 119 73 14 2.7:1.0
Tobacco 12 37 19 6 2.1:1.0
T2代完全不育植株即没有花粉散出, 完全没有结实的植株。
The completely sterile plants in T2 of transgenic plant had no pollen spilt out, so they were barrenness.

表 3 转基因 orf160拟南芥转基因 T2代分离
Table 3 Segregation of the orf160 in Arabidopsis T2 transgenic plants
T1代单株
T1 plants
T2代阳性植株
T2 positive transgenic plants
T3代绿苗植株数目
No. of green plants (T3)
T3代黄苗植株数目
No. of yellow plants (T3)
T3代绿黄苗比例
Ratio of green plants to
yellow plants
T0118 102 0 — T101
T0128 49 38 1.3:1.0
T102 T0215 54 34 1.7:1.0
T0369 112 3 37.3:1.0 T103
T0360 88 23 3.8:1.0
1546 作 物 学 报 第 39卷

orfH79 N端与 cox1序列相似, C端与微球菌 Kocuria
rhizophila DC2201的 putative ABC transporter per-
mease/ATP-binding protein相似[27-28]。一般来说, 动
物线粒体基因组比较保守, 而植物基因组变异广泛
[5-6]。在进化过程中, 植物线粒体基因组经历了多种
多样的基因组变异, 其中包括来自叶绿体和/或核基
因组广泛的基因转移, 发生一系列的重组、重排、
重复等变化, 产生许多未知 orf。
线粒体转录组非常复杂, 功能基因表达不尽相
同, 最重要的是未知功能 orf的表达各异[42-43]。目前
对线粒体转录组测序的相关报道不多。从转录水平
上推测, 这些未知的 orf表达差异很大, 而细胞质雄
性不育通常就是未知功能的 orf差异表达造成的。本
研究通过扩增获得不育系和保持系线粒体功能基因
的的侧翼序列, 在不育系中 atp4 下游发现一个全长
480 bp 特有的 orf160, 功能同样未知。cox4 是克隆
于酵母的基因, 仅 78 bp, 利用 cox4作为线粒体导肽
靶向定位应用广泛, 如向日葵不育基因 orf522 和辣
椒不育基因 orf456等线粒体转基因载体中[41, 44]。本
实验瞬时表达载体亚细胞定位结果显示 , 外源
orf160 确实能在线粒体中正常表达, 这与 Kim 等[41]
报道结果相同, 即 cox4能定位到线粒体中。
前人报道, 败育 orf在不同的植物种中不一定能
够导致败育, 例如萝卜和油菜 Ogura-orf138 转入拟
南芥没有产生不育表型。所以, 本研究将 orf160 转
基因导入拟南芥和烟草中, 转基因植株没有产生完
全的败育, 并不能够直接排除 orf160 是哈克尼西棉
细胞质的不育基因。事实上, 转基因后代均表现出
部分不育; 拟南芥T2代植株不育和可育以 3∶1的分
离比分离(表 3); 转基因植株结实率、种子发芽势、
花粉生活力降低; 转基因烟草的花粉着色浅、种子
出现明显畸形, 说明 orf160 表达影响转基因受体的
正常发育; orf160 对酵母的生长的抑制作用也进一
步证明了这一点, 相关机理以及机制、编码蛋白是
否具有毒性还需进一步实验验证。
4 结论
不育系 atp4 下游发现的 orf160, 全长 480 bp,
编码 159 个氨基酸序列与膜蛋白和细胞周期蛋白具
有部分同源性, 该基因的转基因酵母菌斑畸形、生
长缓慢; 转基因拟南芥和烟草后代植株的结实率降
低, 种子大部分畸形, 且发芽率低。说明 orf160基因
的表达影响转基因受体的正常发育。
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