全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(8): 13711379 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2012CB113900)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 高启国, E-mail: gaoqg031@swu.edu.cn, Tel: 023-68251974
第一作者联系方式: E-mail: zhanglc201312@163.com, Tel: 023-68250974
Received(收稿日期): 2013-12-02; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-06-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140621.0844.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01371
结球甘蓝 BoLH01和 BoLH02基因的克隆与表达
张林成 1 高启国 1,* 蒲全明 1 任雪松 1 刘豫东 1 朱利泉 2 王小佳 1
1 西南大学园艺园林学院 / 南方山地园艺学教育部重点实验室, 重庆 400716; 2 西南大学农学与生物科技学院, 重庆 400716
摘 要: bHLH类转录因子在植物叶片形态建成和发育过程中发挥重要的生理功能。本文通过结球甘蓝转录组数据分
析, 筛选出莲座期和结球期的茎尖间与叶片间均显著差异表达的 2个 bHLH类转录因子, 命名为 BoLH01和 BoLH02
基因, 获得了 2个基因的编码序列, 其中 BoLH01基因 CDS全长为 966 bp、编码 321个氨基酸; BoLH02基因 CDS全
长 870 bp、编码 289个氨基酸; 序列分析表明 BoLH01和 BoLH02分别与拟南芥 AtbHLH18和 AtbHLH19氨基酸同
源相似性最高, 达 81%和 74%, 均具典型 bHLH结构域特点和完全保守的 13E-16R和 9H-13E-17R以及 Leu23对应的
关键氨基酸位点; 分子进化上 BoLH01、BoLH02与 AtTCP2/3/4/10/24亲缘关系较近, 与 AtTCP9/11/14/15较远; 转录
组和荧光定量 PCR 分析表明 BoLH01 和 BoLH02 在平展的莲座叶中表达量较低, 在卷曲的球叶中高量表达; 序列分
析 BoHB7、BoHB12和 BoILL6的 ATG上游均包含能被 bHLH功能域识别的 E-box序列, 对 BoHB7、BoHB12和 BoILL6
荧光定量 PCR 分析表明, 三者与 BoLH01 和 BoLH02 在不同时期叶片中表达量的变化趋势完全一致; 说明 BoLH01
和 BoLH02可能通过正向调控 BoHB7、BoHB12、BoILL6基因的表达来参与甘蓝叶片卷曲的调控。
关键词: 甘蓝; 叶片卷曲; 基因克隆; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of BoLH01and BoLH02 Genes in Cabbage
ZHANG Lin-Cheng1, GAO Qi-Guo1,*, PU Quan-Ming1, REN Xue-Song1, LIU Yu-Dong1, ZHU Li-Quan2, and
WANG Xiao-Jia1
1 College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University / Key Laboratory of Horticulture Science for Southern Mountainous Regions,
Ministry of Education, Chongqing 400716, China; 2 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China
Abstract: Basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors play an important role in the leaf morphogenesis and leaf develop-
ment. In this study, through transcriptome analyses, two bHLH transcription factor genes, differentially expressed in leaves and
shoot tips between cabbage rosette stage and heading stage, were screened, named BoLH01 and BoLH02 genes. The cDNA se-
quences of BoLH01 and BoLH02 were cloned from cabbage (Brasscia oleracea var. capitata). The CDS of BoLH01 was 966 bp,
which encoded 321 amino acids, and the CDS of BoLH02 was 870 bp, which encoded 289 amino acids. Sequence analysis
showed that the similarity of BoLH01 and BoLH02 with AtbHLH18 and AtbHLH19 was 81% and 74% respectively. They con-
tained the typical bHLH domains, conservative 13E-16R, 9E-13R-17H and Leu23 corresponding key amino acid sites. Phyloge-
netic tree analysis displayed that BoLH01and BoLH02 were closest to AtTCP2/3/4/10/24, and had no close genetic relationship
with AtTCP9/11/14/15. Moreover, the transcriptome and real-time fluorescence quantitative PCR analysis indicated that the rela-
tive expression levels of BoLH01 and BoLH02 were low in rosette leaves, and high in heading stage. Sequence analysis showed
that the ATG upstream of BoHB7, BoHB12, and BoILL6 contained the E-box motif, and those motifs could been recognized by
bHLH functional domains. The real-time fluorescence quantitative PCR analysis indicated that the variation in expression levels
of BoHB7, BoHB12, and BoILL6 was similar with that of BoLH01 and BoLH02 in leaves (1 cm). These results meant that
BoLH01 and BoLH02 maybe participate in the regulation of cabbage leaf curl by positively regulating BoHB7, BoHB12, and
BoILL6.
Keywords: Brassica oleracea L.; Leaf curl; Gene cloning; Expression analysis
1372 作 物 学 报 第 40卷


结球甘蓝(Brassica oleracea var. capitata L.)属
于十字花科芸薹属植物 , 营养生长阶段经历幼苗
期、莲座期和结球期。每个时期均具有明显的形态
特征, 其中莲座期主要进行莲座叶的平展扩张生长,
结球期主要进行球叶的分化和叶片向上向内弯曲生
长, 球叶呈现抱合状态, 形成叶球[1]。球叶数目和卷
曲程度直接决定结球甘蓝重量和结球紧实度2个重
要的农艺性状, 同时球叶也为研究叶片卷曲提供了
一个较为理想的材料。球叶的分化、向内弯曲生长
以及叶球的形成过程受光照、温度、碳素营养以及叶
片内源激素不均衡分布等多种因素的影响, 是环境
因子影响下的复杂的形态学反应[2]。目前人们对结球
甘蓝叶片卷曲和叶球发育的分子机制还知之甚少。
研究表明TEOSINTE BRANCHED1 CYCLOIDIA
PCF (TCP)蛋白是一种植物体特异存在的蛋白, 参与
多种生长发育过程[3]。金鱼草cin突变体中发现一类
TCP蛋白 , 能使平展叶片边缘皱缩卷曲 [4]。拟南芥
microRNA介导TCP4基因信使RNA的分裂来阻止
TCP4正常表达, 进而控制叶片的发育, 产生叶片的不
正常卷曲[5], 随后和TCP4同属于家族II、具有相似功能
的其他CINCINNATA (CIN)基因TCP2、3、10、24又相
继被报道[6-7]。此外, 一些非家族II的TCP基因在叶片发
育过程中对叶片边缘的扩张、卷曲也有重要影响[8-10]。
序列分析表明TCP家族转录因子具有典型的basic Helix-
Loop-Helix (bHLH)功能域[11]。同时含有bHLH结构域
的SPATULA(SPT)在拟南芥叶片中超表达会减小叶片
尺寸[12], 含有非典型性bHLH结构域转录因子PACL-
OBTRAZOL RESISTANCE1 (PRE1)和 INCREASED
LEAF INCLINATION1 (ILI1)同一些bHLH类转录因子
结合, 负调控叶片细胞的生长, 引起植株矮小、叶片边缘
卷曲等性状[13-14]。上述结果表明含有bHLH结构域的转录
因子在叶片发育和卷曲过程中起着重要的调控作用。
本试验通过结球甘蓝 519 莲座期、结球期茎尖
和叶片的转录组对比 , 筛选出差异表达且含有
bHLH结构域的 BoLH01和 BoLH02基因, 经 PCR扩
增和测序验证后对其序列进行了生物信息学分析 ,
利用荧光定量 PCR技术分析 BoLH01 和 BoLH02以
及上游含有 bHLH 识别序列的 BoHB7、BoHB12、
BoILL6 基因的表达情况 , 以期为进一步鉴定
BoLH01和 BoLH02的生物学功能提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
将结球性好、扁圆形的中晚熟结球甘蓝纯合系
519, 播种于西南大学十字花科研究所歇马试验基
地。2012年9月至12月分别于叶片长度(从叶尖到叶
片基部)大于1 cm叶数为21片叶的莲座期, 从每株取
叶片长度(从叶尖到叶片基部)为1 cm的2个叶片和长
度为3 mm的茎尖(带3~5片未展开的叶片), 共30株;
于叶片长度(从叶尖到叶片基部)大于1 cm叶数为50
片的结球期, 从每株取叶片长度(从叶尖到叶片基部)
为1 cm的2个叶片和长度为3 mm的茎尖(带3~5片未
展开的叶片), 共30株。用于总RNA提取和转录组测
序。2012年12月至2013年4月分别于叶片长度(从叶
尖到叶片基部)大于1 cm叶数为24片的莲座期, 从每
株取叶片长度(从叶尖到叶片基部)为1 cm的2个叶片
和长度为3 mm的茎尖(带3~5片未展开的叶片), 共
30株; 于叶片长度(从叶尖到叶片基部)大于1 cm叶
数为40片叶的中间期(莲座到结球的过渡期), 从每
株取叶片长度(从叶尖到叶片基部)为1 cm的2个叶片
和长度为3 mm的茎尖(带3~5片未展开的叶片), 共
30株; 于叶片长度(从叶尖到叶片基部)大于1 cm叶
数为60片的结球期, 从每株取叶片长度(从叶尖到叶
片基部)为1 cm的2个叶片和长度为3 mm的茎尖(带
3~5片未展开的叶片), 共30株 , 用于总RNA的提取
和基因表达分析。
植物总RNA提取试剂盒RNAprep Pure Plant Kit
DP432购自天根生化科技(北京)有限公司。荧光定量
PCR染料SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)购
自TaKaRa。大肠杆菌感受态T1、克隆载体pEASY-
Blunt等购自TransGen公司。高保真DNA聚合酶Prime
STAR、Taq DNA聚合酶、反转录试剂盒Primescript
RT Reagent Kit RR047A购自TaKaRa宝生物工程有限
公司(中国大连)。胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购
自Bio-Flux公司。引物合成和测序由华大基因完成。
1.2 用于转录组分析的叶片卷曲指数测定
将莲座期和结球期的1 cm叶片随机分成3组, 每
组3个叶片 , 按照以下方法测量长度 , 并求平均值 ,
计算卷曲指数。叶片下卷时, 侧卷指数TC = 1 – lm/pw,
lm为叶片自然状态下的叶宽, pw为叶片压平后的叶宽;
纵卷指数LC = 1 – tb/pl, tb为叶片自然状态下的叶长,
pl为叶片压平后的叶长; 叶片上卷时, 侧卷指数TC =
lm/pw–1, lm为叶片自然状态下的叶宽, pw为叶片压平
后的叶宽; 纵卷指数LC= tb/pl – 1, tb为叶片自然状态
下的叶长, pl为叶片压平后的叶长。
1.3 总 RNA的提取
参照RNAPrep Pure植物总RNA试剂盒DP432
(TIANGEN, 北京)提取总RNA, 将RNA溶液稀释至
第 8期 张林成等: 结球甘蓝 BoLH01和 BoLH02基因的克隆与表达 1373


相 同 浓 度 后 , 参 照 Primescript RT reagent Kit
RR047A (TaKaRa,大连)操作说明反转录合成cDNA,
经NanoVue plus超微量分光光度计(GE, 美国)测定
后将反转录产物稀释至同一浓度, –20℃保存备用。
1.4 转录组数据分析及 BoLH01、BoLH02 基因
筛选
分别将21片叶莲座期和50片叶结球期茎尖和
叶片混合提取总RNA后 , 送北京百迈克公司用
HiSeq 2000进行转录组测序, 利用Trinity软件对各
样品数据进行Unigenes组装 , 通过RPKM值来反映
Uigenes表达丰度 , 使用 IDEG6软件进行差异表达
基因的检测 , 以 log2(不同时期RPKM比值 )绝对值
大于等于1为标准统计差异表达基因 , 通过Blast软
件将差异表达Unigenes序列与NR、NT、SwissProt、
TrEMBL、GO、COG和KEGG数据库比对 , 获得
Unigenes注释信息 , 筛选差异表达的含有bHLH结
构域的基因。
1.5 BoLH01、BoLH02基因克隆验证
根据转录组分析获得的cDNA序列结合芸薹属
数据库检索(http://brassicadb.org/brad/index.php), 运
用Primer primer 6.0软件设计扩增基因引物, 序列见
表1, 以50片叶结球期的叶片cDNA为模板, 基因克隆
PCR 体 系 为 25 μL, 按 照 高 保 真 DNA 聚 合 酶
PrimeSTAR说明书操作。扩增参数为98℃预变性2 min;
98℃ 10 s; Tm: 15 s (表1); 72 30 s; 35℃ 个循环; 72 ℃
延伸10 min。PCR扩增产物经1.2% 琼脂糖凝胶电泳
检测 , 回收纯化目的条带 , 连接克隆载体pEASY-
Blunt, 转化Trans1–T1大肠杆菌感受态细胞, 通过蓝
白斑筛选挑取白色阳性菌落, 经PCR验证阳性克隆
子后送华大基因公司测序。

表 1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
上游引物
Forward primer (5–3)
下游引物
Reverse primer (5–3)
退火温度
Tm ( )℃
用途
Use
BoLH01 ACAGTTAAGCAGCTAGCGAACATGG GCAATATGGAACCAATCACATCAAC 59.0 Gene cloning
BoLH02 CATGGATGCAGACTTCTTCTTAACC GCTTAAACCATTGCGAGTCTCAG 58.0
BoLH01 CCAGAGGGACAAAGAGGGCTCAACC TTATTGCATCTCCCAACACTGAAGC 58.5 Genes expression analysis
BoLH02 AGTTCTAATCCGAATCCACT CCATTGCGAGTCTCAGGTTCCTTAC 56.8
BoHB7 GAGCCGAGGAAGAAGGTTCAGTTAG AGCCAAGTCGTTGTAGTTTTGTCTG 56.6
BoHB12 CAGAACAAGAGGGCTCGTTGGAAG CACCACAACACTCATCATTCCTTTC 60.3
BoILL6 AGTCCTCTTGATGCTCAGGTTGTG CCTACCTGTTCCATTAGTACCTCTCG 60.0
TIPS TTTGTATGAAGATGAACTGGCTGAC CCTCATAAGTACACCATCAACTCTAAGC 55.5 Reference gene for qRT-PCR
Actin2 CAATCTACGAGGGTTACGCTCTTCG GTGGTGAACATGTAACCTCTCTCGG 60.9

1.6 BoLH01、BoLH02基因生物信息学分析
用 ClustalX l.8.0 软件比对分析获得的 BoLH01
和 BoLH02基因 CDS序列, 用 DNAStar软件推导基因
编码的氨基酸序列 , 通过 ExPASy (http://expasy.
org/tools/)在线分析氨基酸的理化性质, 用 Swiss-model
(http://swissmodel.expasy.org/)、PROSITE (http://www.
expasy.org/prosite)、InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/
interpro/scan.html)和 Predict Protein (http://www.predi-
ctprotein.org/)预测蛋白质的高级结构和功能位点 ,
利用 NCBI 中 BlastN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
在线分析甘蓝 BoLH01 和 BoLH02 基因和其他物种
的同源性, 将搜索的同源序列 bHLH 结构域及已知
卷叶有关的 AtTCP 转录因子的 bHLH 结构域用
ClustalX l.8.0 软件进行多序列联配比对分析, 通过
MEGA 5.1软件构建分子进化树分析其进化关系。
1.7 BoLH01、BoLH02基因表达分析
依据获取 BoLH01 和 BoLH02 基因的 cDNA 序
列以及芸薹属数据库 (http://brassicadb.org/brad/)比
对结果设计用于基因荧光定量 PCR 检测的引物(表
1)。分别以莲座期、中间期和结球期的茎尖、叶片
的 cDNA为模板, 参照 TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II
试剂盒说明书检测 BoLH01、BoLH02基因在各组织
中表达情况, 以 TIPS和 Actin2作为内参基因[15], 反
应在 C1000/CFX96仪器(Bio-Rad, 美国)上完成。荧
光定量 PCR体系 25 μL, 含 2× SYBR Premix Ex Taq
12.5 μL, 引物各 1 μL, cDNA 模板 2 μL, 超纯水 8.5
μL, 混合加样。反应程序为 95℃预变性 30 s; 95 ℃
5 s, Tm值 30 s (表 1), 40个循环。利用 Bio-Rad CFX96
荧光定量 PCR仪 CFX Manager Software软件(2–ΔΔCT
法)和 Microsoft Excel软件分析数据。
1374 作 物 学 报 第 40卷


1.8 含 BoLH01、BoLH02 识别 E-box 序列基因
的筛选与表达分析
依据文献检索、序列比对和氨基酸功能域分析
从转录组差异表达基因中筛选拟南芥叶片卷曲相关
基因的同源基因。利用转录组获取的ATG上游序列
结合芸薹属数据库 (http://brassicadb.org/brad/index.
php)比对, 鉴定出拟南芥AtHB7、AtHB12和AtILL6的
甘蓝同源基因BoHB7、BoHB12、BoILL6, 3个甘蓝基
因ATG上游存在能被bLHLH结构域识别的E-box序
列。BoHB7、BoHB12和BoILL6基因在莲座期、中间
期和结球期茎尖、叶片中表达的荧光定量PCR检测
见1.2.6, 荧光定量产物经测序鉴定。
2 结果与分析
2.1 转录组数据分析与 BoLH01和 BoLH02基因
筛选
为分离甘蓝叶片卷曲相关的调控基因, 我们以
结球甘蓝519莲座期和结球期茎尖与叶片为材料 ,
进行转录组分析, 经Trinity软件对各样品转录组测
序数据进行组装 , 共得到54 209条Unigenes, 利用
RPKM值来反映Uigenes表达丰度, 以log2(不同时期
RPKM比值)绝对值大于等于1为标准统计差异表达
基因, 其中莲座期茎尖与叶片间差异表达的基因达
2923条; 结球期茎尖与叶片间差异表达基因达2307
条 ; 莲座期与结球期茎尖间差异表达的基因达652
条 ; 莲座期与结球期的叶片间差异表达的基因为
1786条。
莲座期和结球期茎尖间差异表达基因与叶片间
差异表达基因之间的重叠基因为488条 , 通过Blast
软件将上述Unigenes序列与NR、NT、SwissProt、
TrEMBL、GO、COG和KEGG数据库比对 , 获得
Unigenes注释信息, 发现其中差异表达的bHLH类转
录因子分别为 BoLH01、 BoLH02和 BoAIB, 其中
BoLH01基因 log2(结球期茎尖RPKM/莲座期茎尖
RPKM)为2.58, log2(结球期叶片RPKM/莲座期叶片
RPKM)为 15.60; BoLH02基因 log2(结球期茎尖
RPKM/莲座期茎尖RPKM)为4.39, log2(结球期叶片
RPKM/莲座期叶片 RPKM)为 13.87; BoAIB基因
log2(结球期茎尖RPKM /莲座期茎尖RPKM)为2.16,
log2(结球期叶片RPKM/莲座期叶片RPKM)为3.76。
依据在2个时期的茎尖间和叶片间均差异表达 , 且
差异显著性由高到低的原则 , 我们从中选取了
BoLH01和BoLH02进行后续分析。叶片卷曲指数分
析表明莲座期叶片纵卷指数为–0.06, 侧卷指数为
–0.19; 结球期叶片的纵卷指数为–0.28, 侧卷指数为
–0.29。BoLH01和BoLH02基因在卷曲程度更高的结
球期叶片中表达量比莲座期叶片中高, PCR扩增测
序结果表明获取的基因编码序列与转录组测序结果
完全一致。
2.2 BoLH01和 BoLH02基因生物信息学分析
经序列分析表明BoLH01基因CDS全长为966 bp、
分子量为35964 Da、编码321个氨基酸残基, GC含量
40.58%, 通过Predict在线分析表明BoLH01是一种跨
膜蛋白, 包括跨膜域(281~298)、膜内域(1~280)和膜
外域 (299~321); 该蛋白包含 1个 N糖基化位点
(283~286)、7个蛋白激酶C磷酸化位点(9~11、92~94、
116~118、131~133、159~161、194~196、250~252)、
7个酪蛋白II磷酸化位点(14~17、41~44、54~57、194~
197、229~232、250~253、303~306)、3个N–豆蔻酰
化位点(130~135、233~238、278~283)和1个异戊二
烯基结合位点(318~321), 核定位信号为ERKRRE、
RKRREK (151、152); 经PROSITE在线分析该蛋白
具有典型的bHLH功能域(142~191)(图1)。
序列分析表明BoLH02基因CDS全长870 bp, 分
子量为32 963 Da, 编码289个氨基酸残基, GC含量
39.66%; 通过Predict在线分析表明BoLH02是一种跨
膜蛋白, 包括跨膜域(249~266)、膜内域(1~248)和膜
外域 (267~289); 该蛋白包含1个N糖基化位点 (75~
78)、1个cAMP和cGMP依赖性磷酸化位点(分别为
92~95、96~99), 4个蛋白激酶C磷酸化位点(36~38、
95~97、102~104、125~127)、7个酪蛋白II磷酸化位点
(11~14、28~31、145~148、197~200、216~219、258~
261、275~278)和2个N-豆蔻酰化位点(137~142、190~
195), 核定位信号为RRGSKRK, ERKRRE, RKRREK
(92、117、118); 经PROSITE在线分析该蛋白也具有
典型的bHLH功能域(108~157)(图1)。
通过NCBI数据库在线Blast比对表明BoLH01与
AtbHLH18的核苷酸序列和推导氨基酸的一致性都
最高, 分别为86%和81%, 与拟南芥AtbHLH25次之;
BoLH02与AtbHLH19的核苷酸序列和推导氨基酸的
一致性都最高, 分别为83%和74%。说明BoLH01和
BoLH02可能是甘蓝2个bHLH类转录因子基因, 通
过NCBI数据库在线收集13条与叶片发育和卷曲相
关的bHLH类转录因子, 以及2条与叶片发育和卷曲
相关的非特异性bHLH类转录因子, 利用MEGA5.1
软件构建氨基酸序列NJ系统进化树(图2), 从图2可
第 8期 张林成等: 结球甘蓝 BoLH01和 BoLH02基因的克隆与表达 1375




图 1 甘蓝 BoLH01、BoLH02 cDNA及其推导的氨基酸序列
Fig. 1 cDNA sequence of Brassica oleracea BoLH01, BoLH02 and its deduced amino acid sequence
黑色阴影部分为 bHLH结构域, 双下画线为跨膜域结构, 单下画线为酪蛋白 II磷酸化位点, 波浪线为异戊二烯基结合位点,
实线框为核定位信号, 虚线框为豆蔻酰化位点, 椭圆为糖基化位点, 虚线为 cAMP和 cGMP依赖性磷酸化位点。
The black shadow are bHLH domain, the double-underlined for transmembrane domain, the single-underlined for casein kinase II phos-
phorylation site, the wavy-lined for prenyl group binding site, the boxed for nuclear localization signal, the dashed box for N-myristoylation
site. The ovaled for N-glycosylation site, the dashed sequence for cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site.
1376 作 物 学 报 第 40卷



图 2 甘蓝 BoLH01、BoLH02及其同源氨基酸序列关系分析
Fig. 2 Phylogenetic relationship of amino acid sequences among Brassica oleracea BoLH01, BoLH02, and its homologous proteins
At: 拟南芥; Bo: 甘蓝; Os: 水稻。星号为 BoLH01、BoLH02。
At: Arabidopsis thaliana; Bo: Brassica oleracea; Os: Oryza sativa. The asterisks indicate BoLH01 and BoLH02.

以看出 BoLH01和 BoLH02与拟南芥AtbHLH18、
AtbHLH19、AtbHLH20、AtbHLH25、AtPRE1和水
稻OsILI1转录因子处于同一个大的分支 , 其中
BoLH01与AtbHLH18、BoLH02与AtbHLH19亲缘关
系最近, 与拟南芥AtPRE1和水稻OsILI1亲缘关系次
之 ; 拟南芥AtTCP2、AtTCP3、AtTCP4、AtTCP10
和 AtTCP24处于同一个分支 , 该分支内 TCP与
BoLH01和BoLH02所在分支的成员亲缘关系较近 ,
AtTCP9、AtTCP11、AtTCP14和AtTCP15与BoLH01
和BoLH02所在分支的成员亲缘关系最远。
利用ClustalX 1.8.0软件对BoLH01和BoLH02在
内的12条蛋白bHLH结构域进行多序列联配比对 ,
结果(图3)显示甘蓝BoLH01和BoLH02均具有典型
bHLH功能域, 包含DNA结合域(basic)和负责形成异
源或同源二聚体的螺旋–环–螺旋结构域 ( h e l i x -
loop-helix)[16-17]。Atchly等[17]和Toledo-Ortiz等[18]指出
DNA结合域内保守的13E-16R是bHLH功能域特异
识别结合下游基因启动子序列中 E - b o x ( 5  -
CANNTG-3, 其中N代表任意核苷酸)的2个关键位
点, 9H-13E-17R是bHLH功能域特异结合下游基因启
动子序列中G-box (5-CACGTG-3)的3个关键位点,
甘蓝BoLH01中151E-154R和BoLH02中117E-120R位
点与13E-16R对应, 甘蓝BoLH01中147H-151E-155R
和BoLH02中113H-117E-121R位点与9H-13E-17R对
应。Heim等 [19]指出HLH结构域中保守的Leu23是
bHLH形成二聚体的关键位点, BoLH01中Leu165和
BoLH02中的Leu131与Heim提及的Leu23相对应。由
图3可以看出不同的bHLH功能域存在氨基酸的缺失
和插入现象 , 上述的关键氨基酸位点在BolH01、
BoLH02、AtSPT、AtbHLH18、AtbHLH20、AtbHLH25
以及AtTCP15中均高度保守。在具有非典型性bHLH
结构域AtPRE1和OsILI1中仅具有保守的与Heim[19]
提及的Leu23相对应位点 , 在DNA结合域均没有
13E-16R和9H-13E-17R对应的保守位点。利用
Swiss-model在线服务器构建BoLH01的bHLH功能域
空间结构, 结果显示生成的三维结构包含150~193
氨基酸 , 由两个螺旋和一个折叠组成 , 其与DNA
序列识别关键氨基酸Glu151和Arg154以及bHLH
二聚体形成的关键氨基酸位点Leu165处于第一个
螺旋。
2.3 BoLH01和 BoLH02基因表达分析
利用实时荧光定量PCR技术, 以TIPS和Actin2
基因为内参 , 分别检测甘蓝3个时期的茎尖和叶片
中BoLH01、BoLH02基因表达情况。从图4可以看出,
BoLH01基因在各时期茎尖和叶片中均有表达, 表达
量在莲座期、中间期和结球期3个时期茎尖和叶片中
均呈逐渐上升的趋势, 其中结球期叶片表达量是中
间期叶片的1.27倍, 是莲座期叶片9.81倍; 结球期茎
尖表达量是中间期茎尖的1.38倍, 是莲座期茎尖的
2.47倍, 莲座期的茎尖BoLH01基因的表达量高于莲
座期叶片表达量, 而中间期和结球期均以叶片的表
达量高于茎尖表达量。从图4可以看出, BoLH02基因
在各时期茎尖和叶片中也都有表达, 3个时期的叶片
中BoLH02的表达量呈逐渐上升的趋势, 结球期叶片
第 8期 张林成等: 结球甘蓝 BoLH01和 BoLH02基因的克隆与表达 1377



图 3 BoLH01、BoLH02及其同源序列 bHLH结构域比对分析
Fig. 3 bHLH domain alignment among BoLH01, BoLH02, and other homologous proteins
三角表示 bHLH结构域保守的氨基酸位点, 箭头表示参与二聚体形成的位点。
Triangles indicate the conserved amino acids of bHLH domian, arrows indicate amino acid involved in dimer formation.


图 4 甘蓝 BoLH01、BoLH02 表达分析
Fig. 4 Expression analysis of BoLH01, BoLH02 in Brassica oleracea
1: 莲座期茎尖; 2: 莲座期叶片; 3: 中间期茎尖;
4: 中间期叶片; 5: 结球期茎尖; 6: 结球期叶片。
1: shoot tips at rosette stage; 2: leaves at rosette stage;
3: shoot tips at middle-stage; 4: leaves at middle-stage;
5: shoot tips at folding stage ; 6: leaves at folding stage

的表达量是中间期的 1.22 倍, 是莲座期的 24.54 倍,
3个时期茎尖内的表达量呈先升后降的趋势 , 中间
期茎尖的表达量是莲座期的 3.17 倍, 结球期茎尖表
达量是莲座期的 2.40 倍, 在莲座期和中间期叶片内
BoLH02 基因的表达量均低于茎尖的表达量, 而结
球期叶片的表达量高于茎尖的表达量。上述结果表
明 BoLH01 和 BoLH02 基因在结球期茎尖和叶片的
表达量均显著高于莲座期茎尖和叶片的表达量, 这
与前述转录组分析的 2 个基因表达量的变化趋势完
全一致。

2.4 BoHB7、BoHB12 和 BoILL6 基因的筛选与
表达分析
序列分析表明甘蓝 BoLH01和 BoLH02蛋白具
有典型的 bHLH 功能域 , 能特异性识别目的基因
ATG上游序列中 E-box序列。通过文献检索、序列
比对和氨基酸功能域分析, 首先从转录组差异表达
基因中筛选拟南芥卷叶相关基因同源基因, 再结合
转录组获取的甘蓝基因 ATG 上游序列在芸薹属数
据库比对 , 筛选出拟南芥卷叶相关基因 AtHB7、
AtHB12和 ILL6的甘蓝同源基因 BoHB7、BoHB12和
BoILL6, BoHB7基因 ATG 上游序列274 bp 处、
BoHB12基因 ATG上游序列431 bp处和 BoILL6基因
ATG上游序列137 bp处分别具有能被 bHLH功能域
识别的 E-box 序列(CAGATG)。利用荧光定量 PCR
分析上述3个基因在甘蓝3个时期6种材料的表达情
况, 结果见图5, 表明3个基因均在结球期叶片中高
量表达 , 其中结球期叶片 BoHB7表达量是中间期
的 1.12 倍 , 是莲座期的 6.25 倍 ; 结球期叶片
BoHB12表达量是中间期的 3.85倍 , 是莲座期的
38.14倍 ; 结球期叶片 BoILL6表达量是中间期的
2.53倍 , 是莲座期的78.14倍 , 上述3个基因在茎尖
的表达量变化不显著, 且远低于结球期叶片中的表
达量。
1378 作 物 学 报 第 40卷



图 5 BoHB7、BoHB12、BoILL6基因表达分析
Fig. 5 Expression analysis of BoHB7, BoHB12 and BoILL6 in Brassica oleracea
1: 莲座期茎尖; 2: 莲座期叶片; 3: 中间期茎尖; 4: 中间期叶片; 5: 结球期茎尖; 6: 结球期叶片。
1: shoot tips at rosette stage; 2: leaves at rosette stage; 3: shoot tips at middle-stage; 4: leaves at middle-stage; 5: shoot tips at folding stage;
6: leaves at folding stage.


3 讨论
叶片卷曲对于结球甘蓝来说是一种非常有用的
农艺形状, 结球期叶片向上向内卷曲抱合形成的叶
球是可食用器官, 同时为研究叶片卷曲提供了理想
的材料。因此了解结球甘蓝叶片极性或叶片卷曲发生
的遗传规律, 揭示该过程中基因调控的分子机制, 将
为研究和利用基因工程调控叶片的形态, 发展叶球
发育的理论以及培育高产优质的结球甘蓝新品种提
供依据。本研究通过结球甘蓝莲座期和结球期茎尖、
叶片的转录组对比筛选出BoLH01和BoLH02两个差
异表达基因, 经PCR扩增和测序鉴定后对BoLH01和
BoLH2的核苷酸和氨基酸序列Blast比对表明它们分
别与拟南芥AtbHLH18和AtbHLH19同源相似性最高,
BoLH01和BoLH02均含有典型的bHLH结构域, 推测
两者可能是甘蓝bHLH转录因子家族成员。典型的
bHLH结构域是由N端约15个氨基酸组成能特异性结
合不同形式的E-box(CANNTG)序列的DNA结合区[16]
和C端由螺旋–环–螺旋组成的负责bHLH同源或异源
二聚体的形成的结构域两部分组成[17]。对BoLH01和
BoLH02的bHLH结构域分析表明两者均具保守的
13E-16R和9H-13E-17R以及Leu23对应的氨基酸位点,
两者具有典型的bHLH功能域活性, 既可以识别结合
E-box序列也可以特异性识别结合G-box序列, 同时
也可以与其他的bHLH转录因子形成异源或者同源二
聚体发挥下游基因表达的调控作用[20-21]。
研究表明TCP4[5]、TCP11[10]、TCP15[8]、TCP20[4]、
SPT[12]等bHLH类转录因子和非特异性bHLH结构域
转录因子PRE1/ILI1[13-14]在植物叶片形态建成和发
育过程中有着重要功能。通过bHLH结构域多序列联
配比对表明BoLH01、BoLH02、AtSPT以及AtTCP15
一致, 均具保守的13E-16R和9H-13E-17R以及Leu23
对应的氨基酸位点, 结合转录组和荧光定量PCR分
析结果均显示BoLH01和BoLH02两个基因在结球期
叶片中高量表达, 表达量的变化与甘蓝叶片卷曲趋
势一致, 由此推测BoLH01和BoLH02可能具有类似于
CIN-TCPs[22-23]转录因子功能, 在甘蓝叶片卷曲过程
中发挥重要的调控作用。已有研究表明TCP14和
TCP15在调节拟南芥节间延伸的功能上具有冗余性[8],
Danisman等研究证明TCP9和TCP20双突变体在调节
叶片发育过程中具有功能冗余性 [24]。BoLH01和
BoLH02序列分析表明两者均具典型的bHLH功能域,
且转录组和荧光定量 PCR分析表明 BoLH01和
BoLH02基因在莲座期、中间期、结球期叶片中均呈
高度相似的上升变化趋势 , 由此我们推测BoLH01
和BoLH02在功能上可能存在冗余性。
BoLH01和BoLH02具有典型的bHLH结构域和
保守的关键氨基酸位点, 能特异识别下游含E-box和
G-box序列的信号元件。Park等发现拟南芥ATHB7、
ATHB12在受病毒感染植株的不正常卷曲发育叶片
中高水平表达 [25], Widemann等研究表明拟南芥
AtILL6能促进IAA水平的升高 [26], 进而诱导叶片偏
上性生长[27]。拟南芥AtHB7、AtHB12、AtILL6的甘
蓝同源基因BoHB7、BoHB12和BoILL6的上游均含能
被 bHLH功能域识别的 E-box序列。对 BoHB7、
BoHB12、BoILL6在莲座期、中间期和结球期荧光定
量分析显示3个基因均在甘蓝卷曲的球叶中高量表
达。三者表达量的变化与BoLH01和BoLH02表达量
的变化趋势完全一致。基于上述结果 , 我们推测
BoLH01和 BoLH02可能通过正向调控 BoHB7、
BoHB12、BoILL6基因的表达来参与甘蓝叶片卷曲调
控。上述分析结果为进一步利用转基因等技术鉴定
BoLH01和BoLH02在甘蓝叶片卷曲过程中的生物学
功能提供了参考。
第 8期 张林成等: 结球甘蓝 BoLH01和 BoLH02基因的克隆与表达 1379


4 结论
从甘蓝转录组差异表达基因中筛选出 BoLH01
和 BoLH02基因。BoLH01和BoLH02具有典型 bHLH
结构域和完全保守的 13E-16R 和 9H-13E-17R 以及
Leu23 对应的关键氨基酸位点 , 甘蓝 BoLH01 和
BoLH02 基因表达量的变化与甘蓝叶片卷曲趋势一
致, 在莲座期平展的叶中均低水平表达, 结球期卷
曲的球叶中表达水平显著升高, 说明这 2 个基因可
能在甘蓝卷曲调控过程中发挥作用。
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