全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(5): 769−778 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30700498和 31271691)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 潘刚, E-mail: pangang12@126.com; 程方民, E-mail: chengfm@zju.edu.cn
Received(收稿日期): 2013-10-14; Accepted(接受日期): 2014-01-12; Published online(网络出版日期): 2014-03-24.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1335.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00769
水稻叶片早衰及盐敏感突变体 osles的生理分析和基因精细定位
毛节景 1 赵晨晨 1 黄福灯 2 潘 刚 1,* 程方民 1,*
1浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058; 2 浙江省农业科学院, 浙江杭州 310021
摘 要: 突变体 osles (Oryza sativa leaf early-senescence and salt-sensitive)是利用 60Co辐射诱变籼稻品种自选 1号后
筛选获得的, 该突变体从分蘖期开始叶片就出现早衰, 主要表现为叶尖和叶边缘变黄, 伴有红褐色斑点。此外, 盐胁
迫下, 不仅突变体叶片卷曲枯萎, 而且植株高度和生物量显著降低。与野生型相比, 突变体除倒一叶外, 倒二和倒三
叶在分蘖期的叶绿素含量均显著降低, 而 POD 活性则在倒一、倒二和倒三叶中依次显著升高; 突变体 3片叶片的
MDA 含量均高于野生型 15%左右。除倒一叶外, 突变体的 SOD 活性均显著高于野生型。此外, 突变体和野生型 3
片叶中的可溶性蛋白含量依次下降, 但突变体的倒一和倒二叶中的可溶性蛋白含量显著高于野生型, 而倒三叶则相
反; 遗传分析表明, osles突变性状受一隐性基因控制, 借助图位克隆技术将控制该性状的基因精细定位于第 6染色体
长臂的 IN6-005769-11/12和 RM20547两个标记之间, 物理距离为 210 kb, 为进一步克隆该基因并揭示叶片的早衰分
子生理机制奠定基础。
关键词: 水稻; osles; 基因定位; 生理分析
Physiological Characterization and Gene Fine Mapping of a Leaf Early Senes-
cence and Salt-sensitive Mutant osles in Rice
MAO Jie-Jing1, ZHAO Chen-Chen1, HUANG Fu-Deng2, PAN Gang1,*, and CHENG Fang-Min1,*
1 College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou
310021, China
Abstract: A osles (Oryza sativa leaf early-senescence and salt-sensitive) mutant, produced by 60Co γ-radiation treatment of indica
cultivar Zixuan 1, was identified. The osles showed yellow at tip and margin of leaf blade with red brown spots during growth at
tillering stage. In addition, under salt stress, the leaves were rolled and wilted, and plant height and plant dry weight were signifi-
cantly decreased. Compared with the control plant, in the mutant plant, the contents of chlorophyll and soluble protein decreased
significantly, while the activities of SOD and POD increased significantly; higher soluble protein content appeared in the 1st and
2nd leaves from top, and decreased in the 3rd leaf. Genetic analysis indicated that osles was controlled by a recessive nuclear
gene, which was finely mapped in a 210 kb interval between two markers IN6-005769-11/12 and RM20547 on long arm of
chromosome 6. These results will facilitate the positional cloning and functional studies of the gene.
Keywords: Rice; osles; Gene mapping; Physiological analysis
叶片衰老是植物叶片发育的最后阶段, 是一种
细胞死亡的过程, 也是营养物质从衰老部位被重新
调运到种子和成熟组织等贮藏器官的过程, 所以叶
片衰老是植物正常生长发育的必然结果[1]。然而, 叶
片是水稻最重要的光合器官, 据理论推算, 水稻籽粒
灌浆的60%~80%营养物质来自叶片的光合作用[2]。因
此水稻抽穗到灌浆期间功能叶的过早衰老, 将影响
水稻灌浆速度, 进而导致产量和品质下降[3]。研究表
明 , 若在水稻籽粒灌浆后期设法延长功能叶片1 d
的寿命, 稻谷产量可以增加1%~2%左右[4]。
水稻叶片衰老是一个复杂的过程, 最主要的表
现为叶片由绿变黄, 而内部的生理生化变化主要表
770 作 物 学 报 第 40卷


现为叶绿素含量降低, 蛋白质降解, 游离氨基酸积
累, 各种水解酶含量和活性提高, 糖类物质、RNA
和 DNA 含量下降, 以及细胞分裂素含量减少, 而诱
导衰老和成熟的脱落酸含量增加。究其衰老的原因,
有持续黑暗、涝害、干旱、盐害、极端温度和紫外
线等 [1]外界环境的影响, 也受各种内源激素和大量
衰老相关基因(SAGs)[1,5]精细调控(http://www.eplan-
tsenescence.org/)等内部因素影响, 。随着现代生物技
术的迅速发展, 迄今已从水稻中克隆并经遗传转化
验证或 T-DNA 插入验证的叶片衰老相关基因有 27
个 , 包括 Osl2[6]、Osh69[7]、SGR[8-9]、NOL1[10]、
NYC1[11]、OsDOS[12]、YGL1[13]、A12[14]、SPL28[15]、
NYC3[16] 、 OsRCCR1[17] 、 OsPAO[17] 、 RLS1[18] 、
OsRab7B3[19]、OsABC1-2[20]、OsLMS[21]、SUB1A[22]、
OsTZF1[23]、GDCH[24]、NYC4[25]、SGRL[26]、OsSIK2[27]、
OsNAP[28]、Cga1[29]、OsFBK12[30]、OsSAMS1[30]和
OsSAG12-1[31]等。
本课题组利用60Co 辐射诱变中籼品种自选1号,
获得了1个隐性突变的叶片早衰突变体 , 其叶片早
衰表型在水稻分蘖期(约4~5片叶龄时)就开始显现,
之后随着水稻的生长发育及其叶龄数的增加, 各叶
位的新叶在其完全展开后的10~15 d 也相继出现早
衰症状, 至抽穗开花时, 所有叶片(未枯死的功能叶)
均出现不同程度的早衰表型。此外, 经本课题组初
步鉴定, 在盐胁迫下, 该突变体的叶片和野生型相
比明显卷曲 , 同时株高明显变矮 , 表现为盐敏感 ,
但是根系和生物学产量没有明显的变化。因此将该
突变体命名为 osles (Oryza sativa leaf early-senescence
and salt-sensitive)。本文对该突变体叶片早衰的基本
表型、生理变化及基因定位进行研究, 以期为进一
步揭示其早衰的分子和生理机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料与田间种植
从 60Co辐射诱变持久高抗稻瘟病材料自选 1号
(来源于恩施农业科学院水稻研究所)后代中获得叶
片早衰及盐敏感突变体 osles, 经杭州和海南连续 5
代回交和自交, 获得突变性状稳定的株系。之后, 以
osles 作母本, 分别与自选 1 号和粳稻材料 02428 杂
交, 获得 F1并自交获得 F2, 对 2个 F2群体进行遗传
分析, 并利用 osles/02428的 F2群体进行基因定位。
其中, 02428 是一个带有广亲和基因的常规粳稻品系,
叶色正常浓绿。
2011年将 osles突变体及其野生对照自选 1号、
2012年将上述 2个 F2群体及其亲本分小区种植于浙
江省农业科学院实验农场(浙江杭州)。每材料各 2
次重复, 每小区 4 行, 每行 8 株, 田间随机排列; 2
个 F2群体的田间种植不设重复, 单本插植。2 年试
验的播期、栽培管理方式相同, 6 月 1 日播种, 6 月
27日移栽, 栽插密度为 17 cm × 22 cm, 大田常规水
作管理, 及时防治病虫和杂草。试验地前茬为大麦,
地力中等偏上。在水稻播种后 60 d至分蘖期(主茎处
于约 7~8片叶龄时), 对 osles突变体与其野生对照材
料分不同叶片取样, 冷冻保存, 测定有关生理指标;
与此同时, 对 2 个 F2群体材料分单株观察其早衰表
型并取样, 提取 DNA, 用于后续遗传和基因定位分
析。在水稻成熟时, 取每个材料 20 株, 调查株高、
单株有效穗数、穗长、穗粒数、千粒重、结实率、
粒长和粒宽等主要农艺性状。
1.2 盐敏感性鉴定
选取成熟种子发芽后 7 d 且株高和根长基本一
致的幼苗在内含 100 mmol L–1 NaCl的 Yoshida营养
液中培养 1周[32], 而后在Yoshida营养液中恢复生长
5 d。培养条件为白天 28℃、光照 16 h; 夜晚 25℃、
黑暗 8 h。分别在处理 7 d后和恢复生长 5 d后调查
株高、根长、整株干重并观察照相。
1.3 生理指标测定
分别选取 12 株播种 60 d 后的野生型和突变体
主茎倒一、倒二、倒三全展叶测定叶绿素含量、可
溶性蛋白含量、MDA含量、SOD含量和 POD含量。
用 80%丙酮提取叶绿素, 测定波长 663 nm和 646 nm
下的吸光值; 用考马斯亮蓝 G-250 染色法测定可溶
性蛋白含量; 参考《植物生理学实验技术》[33]测定
各生理指标。采用日本岛津公司 UV-2450 紫外分光
光度计, 每个指标测定 3个重复。
1.4 DNA提取和 SSR分析
在大田分单株剪取 F2定位群体中具有突变体性
状的早衰单株、双亲以及 F2群体中10株正常植株的
叶片, 采用 CTAB 法提取基因组总 DNA[34]。同时,
分别选取10株正常植株和10株具有突变体性状的单
株的等量DNA混合, 构建正常基因池和突变基因池,
用于 OsLES基因连锁标记筛选。
利用本实验室保存的均匀分布于水稻12条染色体
的500对SSR标记 , 其引物序列来自Gramene数据库
第 5期 毛节景等: 水稻叶片早衰及盐敏感突变体 osles的生理分析和基因精细定位 771


(http://www.gramene.org/), 以及Shen等[35]开发的50对
InDel标记对突变体和粳稻品种02428进行多态性筛选,
用所筛选到的多态性标记分别对正常池和突变池进行
连锁性分析, 获得连锁性标记并进一步分析所有F2群
体中突变极端单株。PCR体系20 μL, 含0.8 U Taq,
1×PCR buffer (Mg2+Plus), 1 mmol L–1 dNTP Mixture,
50 ng DNA, 上下游引物各0.25 μmol L–1。PCR程序为
95℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共
33个循环; 72℃ 10 min。PCR产物经8%非变性聚丙烯
酰胺凝胶电泳, 快速银染后观察[36]。
1.5 遗传图谱构建
从 1276 株的 osles/02428 F2群体中获得 315 个
具有早衰性状的单株组成基因定位群体, 利用上述
筛选到的基因连锁分子标记进行定位群体的遗传分
析 , 获得每个标记的重组交换单株数。同时在
Gramene 数据库查找基因连锁分子标记在染色体上
的物理位置以确定其排列顺序, 结合每个标记的重
组交换单株数确定 OsLES 基因与连锁标记的顺序,
构建基因定位图谱。
2 结果与分析
2.1 osles突变体的表型及其主要农艺性状
早衰性状始于os les突变体植株的分蘖期 (图
1-A), 主要表现为叶片的叶尖和叶边缘变黄, 叶尖
略卷曲, 随后叶缘出现线状黄化条纹和斑点, 并逐
步扩展到叶片内侧, 最后发展为枯斑和条状枯纹(图
1-B), 直到整个叶片枯死。在整个分蘖期, 仅有一叶
一心为正常叶, 其他叶片均表现一定程度衰老症状
(图1-A和B)。而到抽穗开花期时, 所有叶片均出现不
同程度的早衰症状(图1-C)。由于叶片的过早衰老 ,
导致osles突变体的主要农艺性状, 如株高、有效穗、
每穗粒数、千粒重、结实率、籽粒的宽度均显著低
于对照(表1), 其中株高、每穗粒数和结实率下降最
多, 分别为对照的70.8%、56.5%和45.0%。

图 1 osles突变体与野生型(WT)的表型
Fig. 1 Phenotype of osles mutant and the wild type (WT)
plants
A: 分蘖期; B: 分蘖期叶片(1~4代表倒一至倒四叶);
C: 抽穗开花期; Bar=5 cm。
A: tillering stage; B: leaves at tillering stage (1–4 means the first
leaf to fourth leaf from top); C: flowering stage; Bar=5 cm.

表 1 osles突变体及其野生型(WT)的主要农艺性状
Table 1 Main agronomic traits of osles mutant and the wild type (WT) plants
2011 2012 性状
Trait 野生型
WT
突变体
osles
野生型
WT
突变体
osles
株高 Plant height (cm) 105.69±2.71 75.59±2.42** 106.82±2.31 75.01±3.00**
有效穗数 Effective panicle number 6.92±0.83 6.73±0.94 6.82±0.79 6.61±0.59
穗长 Panicle length (cm) 24.78±0.39 20.72±0.79** 25.00±0.30 21.09±1.21**
每穗粒数 Grain number per panicle 157.23±9.80 88.41±10.92** 154.01±9.32 87.04±11.02**
结实率 Seed setting rate (%) 85.24±4.53 41.29±5.61** 83.20±9.30 37.41±4.11**
千粒重 1000-grain weight (g) 22.57±0.89 18.23±0.84** 22.67±0.84 18.39±1.12**
粒长 Seed length (cm) 0.88±0.011 0.88±0.013 0.87±0.012 0.86±0.022
粒宽 Seed width (cm) 0.28±0.012 0.26±0.021* 0.28±0.020 0.26±0.023*
* 在 0.05水平上差异显著; ** 在 0.01水平上差异显著。
* Significantly different at P<0.05; ** significantly different at P<0.01.
772 作 物 学 报 第 40卷


2.2 盐胁迫下 osles突变体耐盐特性
在 100 mmol L–1 NaCl胁迫下处理 7 d后, osles
突变体叶片卷曲, 叶尖部分枯死(图 2-A)。同时株高
和生物学产量比对照分别下降 10.6%和 29.0% (图
2-A), 而 7 d植株净生长高度、根净生长长度与净生
物学产量则分别比对照下降 13.7%、9.9%和 37.5%
(表 2)。恢复生长 5 d 后, 有 12.4%的突变体萎焉枯
死, 而且处理后的突变体生长速度明显慢于处理后
的野生型对照(图 2-b), 突变体株高和生物学产量分
别比对照少 43.5%和 53.8%, 而 5 d 植株净生长高
度、根净生长长度与净生物学产量则分别比对照下
降 81.0%、11.2%和 61.6% (表 2)。

图 2 盐胁迫下 osles突变体与野生型的表型
Fig. 2 Phenotype of osles mutant and the wild type plants under salt stress
A: 100 mmol L–1 NaCl处理 7 d; B: 恢复生长 5 d; Bar=5 cm。
A: salt stress for seven days; B: recovery for five days; Bar=5 cm.

表 2 100 mmol L–1 NaCl盐胁迫下 osles突变体及其野生型(WT)的基本特性
Table 2 Basic characteristics of osles mutant and the wild type (WT) plants under 100 mmol L–1 NaCl stress
处理前
Before stess
处理 7 d后
Stress for seven days
恢复生长 5 d后
Recovery for five days 性状
Trait 野生型 WT 突变体 osles 野生型 WT 突变体 osles 野生型 WT 突变体 osles
株高 Plant height (cm) 5.01±0.29 4.80±0.10 15.32±0.34 13.69±0.28** 28.75±0.27 16.25±0.19**
根长 Root length (cm) 4.87±0.23 5.15±0.12 7.39±0.19 7.42±0.24 8.55±0.61 8.45±0.79**
植株干重 Plant dry weight (g) 4.30±0.59 5.30±0.61 3.10±0.79 2.20±0.71** 1.30±0.11 5.90±0.12**
** 在 0.01水平上差异显著; ** Significantly different at P<0.01.


2.3 osles突变体的衰老相关生理生化特性
2.3.1 叶绿素含量分析 分蘖期 osles 倒一叶的
叶绿素 a 含量比对照低 13.4%, 而叶绿素 b 则高
24.4%, 但总的叶绿素含量差异不显著(图 3-a)。与野
生型相比, 倒二和倒三叶的叶绿素 a 含量分别下降
14.8%和 36.8%, 叶绿素 b 含量分别下降 41.1%和
72.6%, 叶绿素总量分别下降 24.4%和 51.7%。
2.3.2 抗氧化酶 SOD和 POD活性分析 由图 4-A
和 B可见, 相对 osles突变体倒一叶, 其倒二和倒三
叶的 SOD 活性分别上升 18.7%和 29.1% (图 4-A),
POD活性分别上升 173.6%和 240.3% (图 4-B)。而对

图 3 osles突变体与野生型(WT)叶片的叶绿素含量
Fig. 3 Chlorophyll content of leaves in osles mutant and the
wild type (WT) plants
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
*Significantly different at P<0.05; **significantly different at P<0.01.
第 5期 毛节景等: 水稻叶片早衰及盐敏感突变体 osles的生理分析和基因精细定位 773


照倒一、倒二和倒三叶之间的 SOD 和 POD 活性差
异不显著(图 4-A和 B)。相对于对照, osles突变体倒
一叶 SOD 含量下降 0.6%, 倒二和倒三叶的 SOD 含
量分别上升 14.9%和 21.4%, 而 POD 含量则分别上
升 34.7%、279.5%和 322.2% (图 4-A和 B)。
2.3.3 MDA 和可溶性蛋白含量分析 作为衡量
植物体内细胞膜、脂蛋白以及其他含脂质结构损害
程度的重要指标 MDA, osles突变体均比对照高, 且
倒二和倒三叶升高显著, 倒一、倒二和倒三叶分别
增加 10.6%、19.9%和 19.9% (图 4-C)。同时, 由于叶
片不同程度的衰老, 导致 osles突变体倒一至倒三叶
叶片中的可溶性蛋白含量依次降低, 而对照倒一和
倒二叶可溶性蛋白含量差异不显著(图 4-D)。当然,
相对于对照的可溶性蛋白含量, osles 突变体倒一和
倒二叶分别增加 24.8%和 17.7%, 而倒三叶则下降
12.9% (图 4-D)。

图 4 分蘖期 osles突变体和野生型(WT)的生理特性
Fig. 4 Physiological characters of osles mutant and the wild type (WT) plants at tillering stage
A: SOD含量; B: POD含量; C: MDA含量; D: 可溶性蛋白含量。1: 倒一叶; 2: 倒二叶; 3: 倒三叶。
*在 0.05水平上差异显著; **在 0.01水平上差异显著。
A: SOD content; B: POD content; C: MDA content; D: content of soluble protein. 1: 1st leaves from top; 2: 2nd leaves from top;
3: 3rd leaves from top. *Significantly different at P<0.05; **significantly different at P<0.01.

2.4 遗传分析
osles/自选1号和osles/02428两个杂交F1单株均
表现正常, 说明该突变性状是由隐性位点控制。在
osles/自选1号的698个F2单株中 , 有173株表现早衰
性状 , 525株表现正常性状 , 正常单株∶早衰单株
=3∶ 1 [χ2=0.0076<3.84(χ2(0.05,1))]; 在 osles/02428的
1276个F2单株中 , 正常单株为961株 , 早衰单株为
315株 , 正常单株∶早衰单株=3∶1 [χ2=0.051<3.84
(χ2(0.05, 1)]。这2个群体的结果均符合孟德尔单基因隐
性遗传的分离比例 , 说明osles突变体受1对单隐性
核基因控制。
2.5 基因定位
选择均匀分布于水稻12条染色体上的500对
SSR 标记和50对 InDel 标记, 逐条对 osles 突变体与
02428进行多态性筛选, 结果表明178对引物在两亲
本之间具有多态性, 多态性比例为32.4%。然后用这
178对标记分别对所构建的2个基因池进行 BSA 分析,
结果发现水稻第6染色体长臂上的3个 SSR 标记
RM20361、RM20491和 RM3430, 以及1个 InDel 标
记 R6M44在突变池和正常池间具有明显偏分离。随
后, 用以上4个标记分别对315个 F2突变表型单株进
行基因型分析 , 结果表明 RM20361、R6M44、
774 作 物 学 报 第 40卷


RM20491和 RM3430的交换单株分别为58、36、24
和4株(图5)。结合每个分子标记的基因型确定4个标
记与 OsLES 基因在第6染色体的物理排列位置为
RM20361-R6M44-RM20491-osles-RM3430(图5)。为
了进一步定位 OsLES 基因 , 于是在 RM20491和
RM3430之间设计20对 SSR标记或 InDel标记, 其中
6对标记在亲本间有多态性(表3), 利用这6对标记对
F2早衰群体进行基因连锁分析, 最终把 OsLES 基因
定位在 InDel 标记 IN6-005769-11/12和 SSR 标记
R M 2 0 5 4 7之间 , 物理距离为 2 1 0 k b , 横跨
OSJNBa0051O02和 OSJNBb0065C04两个 BAC, 并
且与 SSR 标记 RM005769-15/16和 InDel 标记
IN6-005769-3/4共分离(图5)。其间包含30个开放阅读
框(ORF), 它们分别编码2个反转座子、3个转座子、
8个花粉过敏源蛋白、1个 ATP 合成酶、1个泛
素结合酶、1个 DNA结合蛋白、1个 B-box锌指蛋
白、1个含 bZIP转录因子结构域的蛋白、1个 tRNA
假尿苷合成酶、1 个蛋白激酶 APK1B、1 个白喉酰
胺生物合成蛋白、1个网格蛋白装配蛋白、1个 DNA
光解酶结构域的 FAD 结合域蛋白、1 个含 rabGAP/
TBC结构域的蛋白、1个 STRUBBELIG受体蛋白前
体和 4个功能未知蛋白(表 4)。
3 讨论
叶片衰老是植物叶片发育的最后阶段, 受多种
因素影响。自然条件下, 叶片衰老的主要外部形态
和生理表现为由绿变黄直至枯死, 而在细胞结构上
最早且最明显的变化是含有叶片 70%蛋白质的叶绿
体解体, 因此叶绿素含量的降低是叶片衰老的最重
要标记之一[1]。当然, 伴随叶绿体的解体, 不仅蛋白

图 5 OsLES基因定位
Fig. 5 Molecular mapping of the OsLES gene

表 3 OsLES基因连锁的 SSR标记及其引物序列
Table 3 SSR markers and primer sequences linked to OsLES gene
标记
Marker
正向引物
Forward sequence (5′–3′)
反向引物
Reverse sequence (5′–3′)
RM20491 ATGGCGCACCTGAGGTAGAGG GAGATTGCGGTGGAGAAGAACG
RM005769-3/4 GCCTTTCCCTATCTCTCTCTC TATCCTACCACCTCCAATGTC
IN6-005769-15/16 GAGGCTTGAGGTTACTATGGA CGGAGAGGTTAGCAGTGTAGT
IN6-005769-11/12 GCTATGACAGATCGCTTATCC TCAGATCGTGAACTCAAGTGT
RM005769-15/16 ATCGATCAACACAACACACAT GAGATTCTCTGCCGTTGC
IN6-005769-3/4 TATGTGTTTTCTGGGTGAATG CATCTTACTGACGCAATGAAC
RM20547 CTCTTCTTCTTCTGTCCGTCTTGG CCATCTTCATTACCGACCTCTGC
RM3430 ACGACGACGATCAAGAAC CGAGAGCCACCTAATCTTG
第 5期 毛节景等: 水稻叶片早衰及盐敏感突变体 osles的生理分析和基因精细定位 775


表 4 定位区间内的基因及功能注释
Table 4 Gene names and their annotations in the target interval
基因号
Locus identifier
功能注释
Annotation
LOC_Os06g45150 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45160 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45180 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45230 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45210 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45290 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45190 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45200 group 3 pollen allergen, putative, expressed
LOC_Os06g45260 transposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os06g45270 transposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os06g45030 transposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os06g45170 retrotransposon protein, putative, unclassified, expressed
LOC_Os06g45184 retrotransposon protein, putative, Ty3-gypsy subclass, expressed
LOC_Os06g45000 ubiquitin-conjugating enzyme, putative, expressed
LOC_Os06g45020 STRUBBELIG-RECEPTOR FAMILY 3 precursor, putative, expressed
LOC_Os06g45040 B-box zinc finger family protein, putative, expressed
LOC_Os06g45050 clathrin assembly protein, putative, expressed
LOC_Os06g45070 diphthamide biosynthesis protein 3, putative, expressed
LOC_Os06g45080 rabGAP/TBC domain-containing protein, putative, expressed
LOC_Os06g45100 FAD binding domain of DNA photolyase domain containing protein, expressed
LOC_Os06g45110 DNA binding protein, putative, expressed
LOC_Os06g45120 ATP synthase, putative, expressed
LOC_Os06g45140 bZIP transcription factor domain containing protein, expressed
LOC_Os06g45240 inactive receptor kinase At2g26730 precursor, putative, expressed
LOC_Os06g45250 tRNA pseudouridine synthase family protein, putative, expressed
LOC_Os06g45280 protein kinase APK1B, chloroplast precursor, putative, expressed
LOC_Os06g45130 expressed protein
LOC_Os06g45090 expressed protein
LOC_Os06g45060 expressed protein
LOC_Os06g45220 expressed protein

合成减少, 而且蛋白水解酶活性还会增加, 致使叶
片中的Rubisco和叶绿素a/b结合蛋白等蛋白不断被
降解, 因此叶片中可溶性蛋白含量的降低也是衡量
叶片衰老程度的重要指标之一[1]。同时细胞膜系统
的膜质组分发生变化, 导致膜的透性增大, 膜的完
整性也不同程度受到破坏, 致使细胞内的物质渗出
而加速失水[1]。
本研究中的osles突变体从分蘖期开始, 叶尖和
叶边缘变黄并伴有红褐色斑点(图1), 叶绿素含量急
剧下降, 且相对于其倒一、倒二和倒三叶中的叶绿
素a含量分别下降19.2%和46.9%, 叶绿素b分别下降
30.8%和64.9% (图3), 说明在该突变体中, 叶绿素b
比叶绿素a下降更快, 这可能是由于叶绿素b在叶绿
素b还原酶作用下转换成叶绿素a, 而不是在脱镁螯
合酶(Mg-dechelatase)和叶绿素b还原酶等酶的作用
下降解成脱镁叶绿酸a [37]。至于倒一叶中, 突变体叶
绿素a含量比对照低, 而叶绿素b更高, 可能是基因
突变 , 或与诸如OsDET1存在一定关联所致 , 因为
OsDET1的突变将导致水稻中的叶绿素b含量增加1
倍[38]。
研究已证实, 伴随叶片衰老和叶绿素含量的急
速下降, 衰老叶片中的活性氧急剧增加且不能及时
被清除, 导致MDA含量快速增加[39], 而可溶性蛋白
含量则显著下降。本研究中, 相对于osles突变体倒
776 作 物 学 报 第 40卷


一叶 , 其倒二和倒三叶的MDA含量显著升高 (图
4-C), 而可溶性蛋白含量则显著下降(图4-D), 该结
果预示着倒二和倒三叶已经出现了不同程度的衰老,
这也与图1-b所示的倒二叶轻度衰老而倒三叶则已
明显衰老的表型一致。当然, 在图4-D中, 突变体倒
一和倒二叶中的可溶性蛋白含量显著高于对照, 究
其原因, 其一可能是基因的突变导致突变体自身可
溶性蛋白含量显著高于对照, 如同水稻抽穗后期早
衰突变体TM313的可溶性蛋白含量就显著高于对照
9311 [40]; 其二, 尽管在osles突变体和野生型水稻种
植过程中没有额外增加盐胁迫, 但田间条件是复杂
的, 因此适合于野生型水稻的条件也许足以成为盐
敏感突变体的胁迫条件, 而可溶性蛋白是植物体内
亲水性较强的有机物, 它能明显增加细胞的持水力,
束缚更多的水分, 因此胁迫条件下植物可溶性蛋白
的含量会先升高后降低[41-42]。此外, 作为可溶性蛋
白的抗氧化酶SOD, 在细胞内担负着清除活性氧或
其他过氧化物自由基 , 保护膜系统的重任 ; 虽然
POD在植物体内作用并非专一, 但它的部分同工酶
依然与膜脂过氧化息息相关, 是细胞防御活性氧毒
害酶系统的重要成员之一, 不仅参与了清除过氧化
物 , 还能使MDA转变为正常的脂肪酸而降低MDA
对植物细胞的损害。因此osles突变体叶片衰老中
SOD和POD活性显著上升(图4-A和B), 此研究结果
与杜青等[43]的研究结果一致。
研究表明, DNA结合蛋白可以与转录因子的启
动子部分区域结合, 影响转录因子的表达, 进而调
控细胞的程序化死亡而使组织器官表现早衰, 如在
黑暗诱导的衰老叶片中, 水稻的DNA结合蛋白基因
OsWRKY80上调表达[44]。而锌指蛋白是一类具有手
指状结构域的转录因子, 对基因调控起重要的作用,
利用RNAi干涉技术研究编码CCCH-型锌指蛋白基
因OsDos显示 , 转基因水稻生长到籽粒充实期时 ,
大部分叶片均已衰老 [12]; 而RNAi干扰水稻另一个
锌指蛋白基因OsTZF1后, 转基因水稻不仅表现叶片
早衰, 而且对250 mmol L–1盐敏感[23]。当然, 蛋白质
的降解也是叶片衰老过程中的内在表现形式, 蛋白
质的泛素化也会引起本身的特异性降解, 如水稻泛
素结合蛋白基因LTN1的功能缺失会导致叶片黄化[45]。
此外, 研究显示, 其他转录因子如NAC、WRKY和
MYB, 以及蛋白激酶/磷酸酶, 酶调节因子, 信号因
子 , 抗逆胁迫因子 , 代谢加工降解相关基因 , 生物
合成相关基因和转运相关基因均参与植物叶片衰老
进程[5], 其中, 拟南芥NAC转录因子AtMYBL和MYB
转录因子VIN2均涉及到延缓叶片衰老和植株的耐盐
特性[46-47]。在本研究的精细定位区间, 尚没有衰老
相关的基因被定位或克隆, 而与报道相关的导致水
稻叶片衰老的基因仅有一个DNA结合蛋白基因
(LOC_Os06g45110)、一个锌指蛋白 (LOC_Os06g
45040)和一个泛素结合蛋白基因 (LOC_Os06g
45000), 但对这3个基因测序后发现, 均没有序列差
异。因此 , OsLES基因很可能是其中的bZIP转录因
子、蛋白激酶基因、白喉酰胺生物合成蛋白基因或
rabGAP/TBC功能域的蛋白基因。总之, OsLES基因
是水稻中的一个全新的不仅与衰老相关, 还与盐胁
迫相关的基因, 最后的候选基因需要我们进一步分
析方能确定。
4 结论
osles是一个叶片早衰且对盐敏感的突变体。除
倒一叶外, 分蘖期突变体叶片中的叶绿素总量显著
下降。与野生型相比, 其倒二和倒三叶的 SOD活性、
POD 活性和 MDA 含量则显著上升。而突变体和野
生型 3片叶中的可溶性蛋白含量依次下降 , 但突变
体的倒一和倒二叶中的可溶性蛋白含量显著高于野
生型, 而倒三叶则相反。osles 突变性状受 1 对隐性
核基因控制。将该基因定位于第 6 染色体长臂的
IN6-005769-11/12和 RM20547两个标记的 210 kb区
间, 为进一步克隆该基因并揭示叶片的早衰分子生
理机理奠定了基础。
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