全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(11): 16211631 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由高等学校全国优博博士学位论文作者专项(6J1153)和中央高校基本科研业务费专项(KYY201301)资助。
 通讯作者(Corresponding author): 陈赛华, E-mail: saihuachen@njau.edu.cn, Tel: 025-84396628
第一作者联系方式: E-mail: hongxiaoxd@163.com
Received(收稿日期): 2015-04-25; Accepted(接受日期): 2015-07-20; Published online(网络出版日期): 2015-08-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150805.0926.016.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01621
水稻株型突变体 rad-1和 rad-2的鉴定与功能基因克隆
牛 静 陈赛华* 赵婕妤 曾召琼 蔡茂红 周 亮 刘 喜
江 玲 万建民
南京农业大学作物遗传育种与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 株型是决定水稻等作物产量的核心因素之一, 是品种选育的重要指标。本研究从粳稻品种 Asominori的辐射
诱变中分离出 2个稳定的株型突变体, rad-1和 rad-2, 它们均表现出苗期弯曲生长、成熟期株高矮化、粒长变短、千
粒重降低和产量下降等特征。等位性测验结合连锁分析证实 rad-1和 rad-2等位, 且位于水稻第 7染色体上约 230 kb
的范围内。对定位区段的序列分析后确定 OsFH5为候选基因, 该基因呈现组成型表达, 编码水稻 II型成蛋白。突变
体 rad-1在 OsFH5基因第 2个外显子上缺失 8个碱基, 导致移码; 而 rad-2则在第 14内含子上发生单碱基的变异, 发
生异常剪切。两类突变最终均导致 OsFH5基因翻译提前终止, 产生截短的蛋白。相比野生型, rad-1和 rad-2在幼苗
中 OsFH5基因的表达下调。细胞学研究表明, OsFH5基因的功能缺失会导致幼苗叶鞘细胞大小不均, 呈现不规则生
长, 在成熟的颖壳中细胞显著变短。对生长素响应的 ARF 因子进行表达量检测发现, rad-2 中一系列 ARF 成员表达
均显著下调, 推测 OsFH5极有可能影响了植株对生长素的响应。
关键词: 水稻; 株型; 突变体; 图位克隆; 生长素响应因子
Identification and Map-based Cloning of rad-1 and rad-2, Two Rice Architec-
ture Determinant Mutants
NIU Jing, CHEN Sai-Hua*, ZHAO Jie-Yu, ZENG Zhao-Qiong, CAI Mao-Hong, ZHOU Liang, LIU Xi,
JIANG Ling, and WAN Jian-Min
Nanjing Agricultural University, State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing 210095, China
Abstract: Plant architecture is a key element of crop yield and also taken as a criterion in breeding. In this study, two rice archi-
tecture determinant mutants, rad-1 and rad-2 were selected from Gamma-radiation induced mutants of rice cultivar Asominori.
Each of them shows winding seedlings, dwarf plants and thereby decreased yield. It has been estimated that rad-1 and rad-2 are
allelic to each other by allelism test and linkage analysis. After map-based cloning, the responsible gene for the mutations was
restricted within a 230 kb region in chromosome 7. Sequence analysis revealed that OsFH5 gene, encoding a forming-like protein
altered both in rad-1 and rad-2. An 8-bp deletion in exon 2 in rad-1 and a single nucleotide change in intron 14 in rad-2 made
frame-shift reading and produced truncated proteins. OsFH5 gene exhibited constitutive expression in tested tissues. Compared
with the wild type, prominent decline of OsFH5 gene was observed in each mutant. In seedlings, loss-function of OsFH5 gene
resulted in irregular cell growth in leaf sheath and shorter cells in inner husk, which therefore caused short grain and lower grain
weight. By quantitative RT-PCR analysis, several auxin response factors were dramatically down-regulated in rad-2, which sug-
gested that OsFH5 may affect the response to auxin in rice.
Keywords: Rice; Architecture; Mutant; Map-based cloning; Auxin response factor
水稻是重要的粮食作物, 也是研究单子叶植物
遗传和发育的模式植物。株型是影响水稻产量的一
个重要指标, 对于生产具有重要的意义。20世纪 60
年代, 绿色革命的兴起实现了水稻产量的成倍增长,
这主要是通过培育半矮秆水稻品种以提高水稻抗倒
伏性来实现的。水稻株型对于产量的影响还不仅仅
1622 作 物 学 报 第 41卷


取决于株高。20世纪 80年代起, 育种家们相继提出
了理想新株型的概念, 他们认为理想株型应满足耐
肥、抗倒伏、生物量大且经济系数适宜的要求, 具
体表现为根系发达、茎秆粗壮、穗粒数多且没有无
效分蘖等。理想株型的提出为高产育种指明了方向,
引起了各国育种工作者的广泛重视, 相应的新株型
育种计划得以开展。然而, 水稻理想株型的育种工
作仍未达到预期目的, 这归根结底还是因为株型特
征决定于遗传基础, 一个看似简单的表型往往由多
种复杂的遗传机制共同调控, 因此, 只有深入了解
株型形成的分子机制, 才能加快株型的改良。到目
前为止, 关于株型相关基因的报道正逐步揭示株型
形成的内在机制。
已克隆的株型相关基因主要集中在株高、分蘖、
穗形等方面。Sd1是株高相关的基因, 它编码赤霉素
(gibberellin, GA)合成途径中的关键酶 GA20 氧化酶
(GA20ox)[1-2]。该基因位点的不同突变均导致植株体
内赤霉素含量降低, 引起植株半矮化。除 Sd1外, 通
过对一系列矮化及矮化多分蘖的突变体进行图位克
隆, 发现了同样参与赤霉素途径的其他基因, 其中
d35 参与赤霉素的合成[3], 而 d1、euil、gid1、gid2
参与赤霉素的信号传导[4-7]。关于赤霉素如何影响株
高至今仍有许多没有解开的谜团, 而其他激素的加
盟则让株高的调控机制变得更加错综复杂。d2、d11、
brd1、 brd2 等基因被报道通过影响油菜素内酯
(brassinosteroid, BR)的生物合成而导致矮化, 而 d61
则影响植株对 BR的响应[8-13]。另一类新型的激素独
脚金内酯(Strigolactone, SL)也被报道作用于生长素
的下游 , 抑制腋芽的生长 , 并调控株高的变化 [14],
其中已克隆的 d10、d17/htd1和 d27参与 SL的生物合
成, 而 d14 和最新报道的 d53 参与了 SL 的信号转导,
这些基因的突变都会引起矮化多分蘖的表型[15-19]。
理想株型的另一方面重要研究就是分蘖, 同样
通过突变体的遗传研究来了解分蘖调控的基因网
络。如编码 GRAS 类型转录因子的 MOC1 基因, 过
量表达 MOC1能够引起分蘖能力的增加[20]。DLT同
样编码 GRAS 类转录因子, 它通过 BR 的信号转导
来影响分蘖, dlt 突变体呈现出半矮秆、分蘖减少等
表型[21]。Takeda等[22]对水稻中的 OsTB1进行了研究,
该基因编码一个 bHLH 转录因子, 过表达后能极大
地减少侧枝而不影响分蘖芽的数目, 说明该基因负
调控侧枝的生长。在 moc1突变体中, OsTB1表达量
显著减弱, 说明 OsTB1可能作用于 MOC1的下游。
2010 年, Jiao 等[23]利用一个少分蘖的突变体克隆了
理想株型基因 IPA1, 该基因不仅影响水稻的抗倒伏
性和产量, 同时也抑制水稻的分蘖。除分蘖的数目外,
分蘖的角度也被认为影响着产量, TAC1和 OsLIC1被
报道影响着分蘖的角度, 其中 TAC1 的上调表达能
够导致分蘖角度的增大[24], 而 OsLIC1 的表达则认
为是受 BR调控[25]。
相比于株高和分蘖, 穗粒数的多少更能直观地反
映产量的高低。LAX1与 SPA被报道共同调控腋芽的起
始, 两者突变后植株既不能形成小穗枝梗, 也没有分
蘖芽的形成[26]。LAX2与 LAX1突变体的表型相似, 且
LAX1与 LAX2编码的蛋白能够形成二聚体。在穗畸形
的突变体 apo1 中, 一次枝梗明显减少, 穗子缩短, 且
穗粒数也明显减少。过表达 APO1 可同时增加一次枝
梗数、二次枝梗数和穗粒数[27]。另一个重要的调控穗
粒数的 QTL Gn1a被克隆, Gn1a编码细胞分裂素氧化/
脱氢酶 OsCKX2, 能够降低植株体内细胞分裂素的含
量。当 Gn1a基因表达降低时, 细胞分裂素积累, 并促
进花序分生组织的分化能力, 从而增加穗粒数[28]。
株型基因还包括了一些基本形态决定因子, 例
如影响微丝聚合的成蛋白对株型起重要的决定作用,
而最新的研究报道认为基本形态决定因子通过影响
生长素的极性运输来调控株型[29-30]。总之, 植物株
型建成是一个相当复杂的过程, 而目前已知的调控
网络仍不够清晰, 进一步克隆基因并展开功能研究
是促进机制研究的主要方法之一。本研究筛选到 2
个稳定的株型突变体(rice architecture determinant,
rad-1 和 rad-2), 并对其进行图位克隆 , 最终验证
OsFH5 基因是影响株型的关键因子。不同株型突变
体的鉴定对于后续基因功能的研究具有重要的意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
突变体 rad-1和 rad-2是粳稻品种 Asominori 经
钴60辐射诱变后分离出来的, 经过多代自交后性状稳
定遗传。将 rad-1和 rad-2与籼稻品种南京11杂交获得
F1代, F1自交获得 F2代分离群体用于定位研究。所有材
料均于正季种植于江苏省南京市江宁区土桥镇南京农
业大学试验基地, 种植和管理方法同常规大田。
1.2 表型鉴定
将亲本及 F2 群体浸种催芽后均匀撒播于秧田,
8~10 d左右观察自然条件下野生型与突变体的表型
差异, 并从 F2 群体中筛选极端突变表型个体, 用于
第 11期 牛 静等: 水稻株型突变体 rad-1和 rad-2的鉴定与功能基因克隆 1623


基因的定位。成熟期, 各取 10株突变体和野生型考
察株高、分蘖数、千粒重等重要农艺性状, 其中株
高、剑叶长宽、各节间长度、每穗粒数等均以主茎
为考察对象。
1.3 引物设计与分子标记的开发
利用水稻数据库(http://www.gramene.org/)已公
布的 576对 SSR引物对 Asominori和南京 11进行筛
选, 获得 150 对在 2 个亲本之间存在多态的分子标
记, 分布于 12 条染色体上, 用于基因的初定位。根
据籼稻 9311 与粳稻日本晴序列之间的差异, 利用
Primer5.0 软件设计引物, 开发 SSR、Indel 等标记,
用于基因的精细定位。引物设计的要求为 18~25 个
碱基、GC 含量 50%~60%、避免特殊结构、扩增特
异性强, 具体引物信息如表 1。

表 1 本实验所用引物列表
Table 1 List of primers used in experiment
类型
Type
引物名称
Name of primer
前引物
Forward primer (5–3)
后引物
Reverse primer (5–3)
RM455 AACAACCCACCACCTGTCTC AGAAGGAAAAGGGCTCGATC
I7-10 TCCGGCGAGAAAATAAGTGT TTCGTTAATCCTCACGCAGA
RM351 CCATCCTCCACCGCCTCTCG TGGAGGAAGGAAAGGGGACG
NJ7-11 AATCTCAAAAAGAAACCCTCGG TGATGCTCATTTTGATGTGGTG
NJ7-29 CCAGTCAAAATAAAACAGTAAA ATCTTTCAATCAGGCACAC
NJ7-23 AACCAGCAATAATTTATCATCT GTTATCAAGAACCGCCCCT
NJ7-18 ATTTCCCGAACGCCAAACCCTC GCGGCGAGGCGGTTGGC
RM505 AGAGTTATGAGCCGGGTGTG GATTTGGCGATCTTAGCAGC
NJ7-7 TCCTTGGGTTCCTGGCTACA ATGGAGGTCAACGAACGAAGAAC
定位相关引物
Primers for mapping
RM234 ACAGTATCCAAGGCCCTGG CACGTGAGACAAAGACGGAG
RAD-1 GCAGGCAGCAGAAGCA TGGGTGGTTGACTGGTT
RAD-2 CGCTCGGGCAGACAGAC CACCGTGGGATTGGGAC
RAD-3 GGACACGCACGTACCGA GCAACAATGCCGCTCA
RAD-4 TTTACTGGGACTTCCGCCT TGCTTGCTGCGAATCTAATG
RAD-5 TAGTTCCTAAGCGGGTATCCT CTCCTATTAGCCGACCCCT
RAD-6 TTGACCTTAGAGGCGGGG TCAGTGCCAACCAGACGAA
RAD-7 CCCACGCCCTCTACCTATT TCCACCCTATGCTTCTTCAA
RAD-8 CCATTACCTGTTCGCATTT TAATAGGTAGAGGGCGTGGG
RAD-9 TCCATTCGTGGCACTTTCA AACTATGTTGGCTTACTGTCTCG
RAD-10 AACGAGAAAAGCCATCAGT GAGGGAGTACCAATCAACC
RAD-11 AACACCGATTAGAACAGCA AGTAATGCGACCGATGTTT
RAD-12 AGAGGGTGGAGATAACTGC TGCTGTTCTAATCGGTGTT
RAD-13 TGTTTTAGTATCTGGCGTTTG ATTCACTGACAATGCTGGAG
RAD-14 CGCCAGCAAGGGTGAAAT CAAGTGAAACAAACGCCAGA
基因序列测定所用引物
Primers for gene sequencing
RAD-15 ACCGCCCTTGTTACGAT GCCTCTTCTACACAGTATCCAC
cDNA克隆引物
Primers for cDNA cloning
CFH5-1 GCTTGTCAAGCATTCCTCC GATCATGGAAAAGCTGCTG
qFH5-1 ATTAGCCGACCCCTCATCTT TTACTGGGACTTCCGCCTG
ActinRP GTACAGTGTCTGGATTGGAGGAT GGGTCCGAAGAATTAGAAGCA
OsARF9 AGAGAGTGCAAGTCAGAGTG AACATGCATGCCATTCTCGC
OsARF10 CCACTGAGAGTTAAGCATCC GCATTAGGATCAGAGAAGCC
OsARF11 GAGGTGGATAAGGGATTGAC CTTCATTCCGTCAGATGCAG
OsARF12 AGCTACTGTTTCAGGTGTCG GGGCAAAGTCAATGGTTAGC
荧光定量引物
Primers for real-time RT-PCR
OsARF13 AATCATCATCAGCACCGACC CTAATCTCCCAGGTTGTCAC

1624 作 物 学 报 第 41卷


1.4 DNA的提取、PCR扩增和 PAGE凝胶电泳
采集新鲜的叶片, 于液氮中碾磨至粉末状, 用
SDS法提取基因组 DNA, 溶解在适量 ddH2O中, 用
作 PCR反应的模板。10 μL反应体系含: 10×PCR缓
冲液 1 μL, dNTPs (2 mmol L–1) 1 μL, 正、反引物(2
μmol L–1)各 1 μL, DNA 2 μL (20~50 ng), Taq DNA聚
合酶(2 U μL–1) 0.2 μL, ddH2O 3.8 μL。PCR程序为:
95℃预变性 5 min; 94℃变性 30 s, 55~60℃退火 30 s,
72℃延伸 40 s, 34个循环; 72℃再延伸 5 min。PCR
产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及 0.1% AgNO3
溶液银染显色。
1.5 基因的初定位及精细定位
选取平均覆盖每条染色体的多态性分子标记 ,
对 F2分离群体中具有极端表型的单株进行基因型鉴
定, 寻找与突变表型相连锁的分子标记。同时, 根据
极端个体中交换重组发生的位置, 确定基因的候选
区段。在此基础上, 扩大 F2 分离群体, 进一步筛选
表型明确的极端个体, 利用候选区段内加密的分子
标记进行基因型鉴定。综合基因型与表型结果逐步
缩小基因的范围。
1.6 候选基因的克隆与测序
根据精细定位的结果 , 利用 Gramene 数据库
(http://www.gramene.org/)对定位区间进行基因分
析。选取与水稻生长发育相关的基因作为候选基因。
设计基因特异性引物, 用高保真酶 KOD (东洋纺)扩
增候选基因的基因组及 cDNA序列, 将 PCR产物回
收纯化后克隆到 pEasy-Blunt (TransGen)载体, 挑选
阳性克隆送至南京金斯瑞公司测序, 比较野生型与
突变体中候选基因的序列差异。采用 DNAMAN 软
件预测编码氨基酸的序列并比对。
1.7 细胞学观察
选取苗期的叶鞘及成熟期的外颖组织, 在叶鞘
外层及外颖内层轻轻涂上透明的指甲油, 待自然晾
干后, 将印有细胞形状的薄膜揭下并粘于载玻片上,
光学显微镜下观察比较细胞的形状和大小。
1.8 RNA的提取与实时荧光定量 PCR分析
采用植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取所
有组织样品的RNA。以总RNA为模板, Oligo dT为引
物反转录成 cDNA。反转录所用试剂均购买至
TaKaRa公司。
分别采集 7 d和 10 d野生型幼苗、幼根和成熟
期的根、茎、叶、幼穗等部位, 提取 RNA, 采用荧
光定量的方法检测基因的表达模式。实时荧光定量
PCR体系含: cDNA (10 μg mL–1) 2 μL、RNA free H2O
9.3 μL、primer (5 μmol mL–1) 1.2 μL、Mix (Bio-Rad)
12.5 μL, 共 25 μL。扩增程序为 50℃ 2 min, 95℃ 10
min, (95℃ 15 s, 60℃ 1 min) 40个循环, 95℃ 15 s,
60℃ 1 min, 95℃ 15 s, 60℃ 15 s。以 Actin作为内
参基因, 按照 2–ΔΔCT 计算基因在各组织样品中的相
对表达量。
此外, 选取 7 d野生型和突变体幼苗的 cDNA样
本, 对水稻中目前预测的 25个ARF生长素响应基因
进行定量 , 分析基因突变对生长素响应的影响。
ARF1~25 对应的基因编号分别为 Os01g0236300、
Os01g0670800、 Os01g0753500、 Os01g0927600、
Os02g0141100、 Os02g0164900、 Os02g0557200、
Os02g0628600、 Os04g0442000、 Os04g0519700、
Os04g0664400、 Os04g0671900、 Os04g0690600、
Os05g0515400、 Os05g0563400、 Os06g0196700、
Os06g0677800、 Os06g0685700、 Os06g0702600、
Os07g0183100、 Os08g0520500、 Os10g0479900、
Os11g0523800、 Os12g0479400、 Os12g0613700。
参考前人报道[31]的基因定量的引物, 其中对 ARF9、
10、11、12、13的引物做了更正, 详见表 1。
2 结果与分析
2.1 突变体 rad-1和 rad-2的表型特征
突变体 rad-1和 rad-2在萌发后 10 d左右均表现
出明显的弯曲生长, 且幼苗较野生型生长减缓, 并
有明显的矮化现象(图 1-A)。不仅如此, 幼苗的根部
同样出现轻微波浪状弯曲(图 1-A), 这说明突变对整
个植株的形态都产生了明显的影响。随着幼苗的持
续生长, 突变体的弯曲表型逐步减弱, 至分蘖期基
本直立, 但株高矮化现象仍然明显, 且叶片呈现不
同程度的褶皱(图 1-B, G, J)。
对成熟期株高测量发现 , 野生型达(103.1±3.2)
cm, 而突变体 rad-1和 rad-2则分别为(68.0±3.3) cm
和(67.7±2.1) cm, 呈现明显的半矮化(图 1-I, L, 表
2)。取植株的不同节间观察比较, 其中第一、二、三、
五节间显著缩短, 而第四节间则没有差异(图 1-C, H,
K)。比较剑叶形态后发现, 剑叶宽无变化, 但长度显
著下降(表 2)。此外, 突变体 rad-1和 rad-2比野生型
穗子短小, 其一次枝梗数、二次枝梗数和每穗粒数
均显著下降(图 2-D, 表 2)。
尽管2个突变体植株形态较相近 , 但在粒型上
却存在明显差异。野生型粒长为(7.593±0.024) mm,
第 11期 牛 静等: 水稻株型突变体 rad-1和 rad-2的鉴定与功能基因克隆 1625



图 1 野生型与突变体不同时期的株型比较及苗期细胞学观察
Fig. 1 Phenotypic comparison of wild type and mutants in different stages and cytological observation in seedlings
A: 野生型、突变体和 rad-1/rad-2 F1萌发后 10 d的幼苗; B: 分蘖期植株; C: 成熟期主茎各节间及主穗长度; D~F: 10 d幼苗叶鞘表皮
印记装片, 放大倍数 20, 比例尺长 100 μm; G、J: 成熟期叶片形态; H、K: 第一至五节间; 图 H左侧野生型, 右侧 rad-1, 图 K左侧野
生型, 右侧 rad-2; I、L: 成熟期株型。
A: 10-day-old seedlings of wild type, mutants, and F1 hybrids; B: plant of tillering stage; C: internode length in the main stem; D–F: epider-
mis imprint section of leaf sheath in 10-d seedlings, 20×magnification, bar=100 μm; G, J: leaf blade in mature plants; H, K: length of the first
to fifth internodes; H: left is the wild type and right is rad-1; K: left is the wild type and right is rad-2; I, L: plant of mature period.
1626 作 物 学 报 第 41卷



图 2 野生型与突变体穗型、粒型的比较及细胞学观察
Fig. 2 Morphological comparison and cytological observation of panicles and grains in wild type and mutants
A: 籽粒宽度比较; B: 籽粒长度比较; C: 糙米外观比较; A~C: 比例尺为 5 mm; D: 野生型与突变体穗型比较; E~G: 外颖内层细胞印
记玻片, 放大倍数 10, 比例尺为 200 μm; H: 粒长和粒宽的统计直方图, **表示根据 t测验检测差异极显著, P<0.01。
A: comparison of grain width; B: comparison of grain length; C: appearance of brown rice; A–C: bar=5 mm; D: panicle pattern of wild type
and mutants; E–G: the inner cells imprint section of outer glumes, 10×magnification, bar=200 μm; H: statistical histogram of grain length and
grain width. ** shows extremely significant difference based on t-test, P<0.01.

表 2 野生型与突变体 rad-1和 rad-2农艺性状统计表
Table 2 Statistics data of agronomic traits in wild type and rad-1 and rad-2
材料 Material Asominori rad-1 rad-2
株高 Plant height (cm) 103.1±3.2 68.0±3.3** 67.7±2.1**
分蘖数 Tillering number 15.2±2.3 16.5±6.1 15.0±2.4
有效穗数 Panicles per plant 15.1±3.9 17.1±4.1 14.5±3.8
穗颈长 Length of panicle (cm) 6.6±1.1 3.9±2.0** 4.5±1.1**
剑叶长 Flag leaf length (cm) 28.7±3.7 16.6±1.5** 14.0±1.1**
剑叶宽 Flag leaf width (cm) 1.25±0.07 1.26±0.07 1.24±0.07
一次枝梗数 Primary branch number 9.9±1.0 7.1±0.6** 7.3±0.8**
二次枝梗数 Second branch number 16.4±2.7 6.2±2.5** 9.5±3.2**
结实率 Seed-setting rate (%) 95.15±0.02 89.34±0.06** 71.50±0.11**
每穗粒数 Spikelets per panicle 95.5±10.4 47.8±6.3** 46.3±11.6**
着粒密度 Seed-setting density 4.48±0.40 3.32±0.30** 4.21±0.79
粒长 Grain length (mm) 7.593±0.024 6.879±0.027** 6.081±0.019**
粒宽 Grain width (mm) 3.212±0.011 3.217±0.012 3.609±0.008**
千粒重 1000-grain weight (g) 26.433±0.142 23.923±0.216** 23.455±0.109**
抽穗期 heading date (d) 91.0±1.7 94.0±2.9** 90.7±1.5
根据调查数据计算平均值、标准差; t测验分别检测突变体与野生型间的差异。*表示差异显著 P<0.05, **表示差异极显著 P<0.01。
The values of each trait are represented by mean and standard deviation respectively; the differences between the mutants and wild type
are calculated by t-test. * Shows significant difference, P<0.05, and ** shows very significant difference, P<0.01.

第 11期 牛 静等: 水稻株型突变体 rad-1和 rad-2的鉴定与功能基因克隆 1627


rad-1的粒长为(6.879±0.027) mm, 而 rad-2的粒长则
更短, 为(6.081±0.019) mm; rad-1与野生型的粒宽并
无差异, 而 rad-2较两者粒宽明显增加, 且糙米表面
有褶皱, 并伴腹白表型(图 2-A, B, C, H; 表 2)。粒长
的显著下降使得两个突变体的千粒重显著下降, 这
足以说明株型的改变严重影响产量。
对幼苗期叶鞘的细胞学观测发现, 野生型幼苗
的叶鞘细胞排列较规则, 大小相近, 而突变体中, 幼
苗叶鞘表皮的细胞大小差异明显, 排列不规则, 说明
苗期茎秆的扭曲可能是由于细胞形态变化造成的(图
1-D, E, F)。此外, 对成熟期颖壳的内层细胞观察发现,
突变体颖壳细胞的长度明显小于野生型, 说明细胞
长度缩短是突变体粒长减小的原因(图 2-E, F, G)。
2.2 rad-1和 rad-2的等位性测定及精细定位
由于 rad-1和 rad-2在表型上相似, 将两者杂交,
并鉴定杂种 F1的表型。rad-1/rad-2在苗期仍然表现
出明显的茎秆弯曲表型(图 1-A), 说明 rad-1和 rad-2
互为等位突变。
为了对突变的基因位点进行定位 , 首先从
rad-1/NJ11和 rad-2/NJ11的 F2群体中筛选出20个具
有极端突变表型的单株, 利用覆盖12条染色体的多
态性标记进行基因型鉴定。在第7染色体的分子标记
RM351和 RM505处观察到明显的连锁趋势。其中9
个单株在分子标记 RM455和 RM351之间发生了交
换, 将基因限定在 RM455下游; 而其中4个单株在
分子标记 RM505和 RM234之间发生交换, 将基因限
定在 RM234的上游。RM455和 RM234标记之间的遗
传距离为12.49 cM。为进一步精细定位基因, 对 F2
群体中218个极端个体进行基因型鉴定 , 又获得24
个在候选区段内存在交换的单株。利用加密的分子
标记 , 对37个交换单株进行鉴定 , 发现2个单株在
NJ7-29和 NJ7-23之间发生交换 , 将基因限定在
NJ7-29下游, 而另一个单株则在 NJ7-23和 NJ7-18之
间发生交换 , 将基因限定在 NJ7-18标记的上游。
NJ7-29和 NJ7-18之间的物理距离为229.18 kb (图3-A,
B)。所有极端表型的交换单株在成熟期均表现出株高
的矮化, 并且对其 F2:3种子进行苗期鉴定, 均呈现稳定
的茎秆弯曲, 这更明确了基因定位结果。

图 3 突变体 rad-1和 rad-2的基因定位示意图
Fig. 3 Illustration of gene mapping for mutant rad-1 and rad-2
A: 基因初定位结果, 用于定位的极端个体数目 n=20; B: 基因精细定位结果, 用于鉴定的极端个体数目 n=238; C: 定位区间内的BAC;
D: OsFH5基因的结构, 白色框代表 5′和 3′非翻译区, 黑色框代表外显子区, 横线代表内含子区。箭头所指位置代表在突变体中发生序
列变异的位置。其中 rad-1突变发生在第 2外显子, 而 rad-2突变发生在第 14内含子。
A: preliminary mapping, n=20; B: fine mapping, n=238; C: BACs located in the target region; D: the structure of OsFH5, the white box
represents 5′ and 3′-end untranslated region, the black box represents exons, the horizontal line represents introns. Arrows indicate the
position where variations occurred in the mutants, rad-1 occurred in the second exon and rad-2 occurred in the 14th intron.

2.3 候选基因的克隆与鉴定
登陆 Gramene数据库, 对定位区间内已预测的
基因进行分析, 发现这一区域内存在一个编码植物
II型成蛋白的基因 OsFH5, 曾被报道参与微丝的聚
合, 突变后引起苗期茎秆弯曲等相似表型[29], 因此
我们将 OsFH5作为候选基因。OsFH5基因含有 19
个外显子和 18个内含子, cDNA全长 5568 bp, 其编
码的 OsFH5 蛋白含 1627 个氨基酸, 包括 3 个结构
域, PTEN-like、FH1和 FH2 (图 4)。我们设计 15对
引物覆盖 OsFH5 的基因区域, 包括 3 kb 启动子区
1628 作 物 学 报 第 41卷


和 10.48 kb编码区。对野生型 Asominori和突变体
rad-1和 rad-2分别进行扩增、测序并拼接完整。对
拼接序列分析显示, 与野生型相比, rad-1 和 rad-2
在启动子区均无序列变异。而 rad-1在 ATG下游第
1009个碱基处有 8 bp的缺失, 该缺失位于第 2外显
子上, 直接导致突变基因移码, 编码的蛋白质在第
124个氨基酸处提前终止, 3个结构域均缺失(图 4)。
在 rad-2中, OsFH5基因在第 14个内含子的最后一
个碱基发生了 G 到 A 的替换。对 rad-2 中 OsFH5
基因所编码的 cDNA 克隆测序后发现 , 内含子上
G→A 的变化导致剪切方式的改变, 编码的氨基酸
发生移码, 并在第 1534个氨基酸处提前终止(图 4),
该突变会造成 FH2 结构域缺失, 而 PTEN-like 和
FH1 结构域仍保持完整。根据以上结果推测 ,
OsFH5 基因的功能缺失是造成 rad-1 和 rad-2 突变
体表型的原因。

图 4 野生型与突变体中 OsFH5基因编码的氨基酸序列比对图
Fig. 4 Comparison of amino acids deduced by OsFH5 gene in wild type and mutants
图中红色下画线部分为 PTEN-like结构域, 绿色下画线部分为 FH1结构域, 蓝色下画线部分为 FH2结构域。
PTEN-like domain is underlined in red, FH1 domain is underlined in green, and FH2 domain is underlined in blue.

利用 Real-time RT-PCR检测野生型的根、茎、
叶、穗、幼苗和幼根中 OsFH5基因的表达量发现, 该
基因在各个组织中呈现组成型表达, 其中在幼苗中
表达量最高。比较野生型与突变体 rad-1和 rad-2中
OsFH5 基因在幼苗期的表达量, 发现突变体中该基
因的表达量都有下调, 这可能与该基因功能的缺失
有关(图 5-A, B)。
2.4 OsFH5基因对生长素和 IAA响应的影响
由于 OsFH5 基因功能的缺失, 观察到突变体在
细胞生长水平中呈现出缺陷 , 包括细胞长度减小 ,
细胞形态改变。在幼苗期, 突变体茎秆细胞出现不
规则生长, Zhang等[30]研究猜测可能与细胞水平上激
素的极性运输有关。为了证实这一想法, 我们比较
了野生型与突变体中生长素和 IAA响应基因的表达
水平。有意思的是, 我们发现在突变体 rad-2中, 生
长素影响因子 ARF2、ARF3、ARF10、ARF19 等一
系列基因均发生显著的下调, 而在 rad-1 中则无下
调表达的趋势。
3 讨论
3.1 OsFH5 基因对于株型的影响贯穿整个生育
期, 并最终决定产量
我们对株型突变体 rad-1和 rad-2与野生型的表
型详细调查比较发现, rad-1 和 rad-2 不仅能够在幼
第 11期 牛 静等: 水稻株型突变体 rad-1和 rad-2的鉴定与功能基因克隆 1629



图 5 OsFH5基因表达模式和 OsFH5基因在野生型与突变体幼苗中的表达量变化
Fig. 5 OsFH5 gene expression pattern in various organs and comparison of OsFH5 gene expression in wild type and mutant seedlings
A: 野生型中 OsFH5基因在成熟期的根、茎、叶、幼穗、幼苗和幼根中的表达量。纵坐标为相对于幼穗中表达量的倍数。
B: 野生型 Asominori与突变体 rad-1、rad-2幼苗中 OsFH5基因表达量。纵坐标为相对于野生型中表达量的倍数。
A: OsFH5 gene expression in root, stem, leaf, young panicle, seedling, and radicle. Y axis represents the relative expression fold contrast to
the young panicle. B: OsFH5 gene expression in seedlings of wild type and mutants, rad-1 and rad-2. Y axis represents the relative
expression fold contrast to the wild type.

图 6 野生型与突变体幼苗中生长素响应因子 ARF的表达量
Fig. 6 Expression of Auxin response factors in seedlings of wild type and mutants

苗期造成茎秆的扭曲生长, 同时在成熟期较野生型
株高明显降低, 一次枝梗数、二次枝梗数和每穗粒
数减少, 并出现粒长的缩短, 说明突变的基因对于
水稻株型的形成起决定性作用。通过突变体材料的
图位克隆发现, 在 rad-1和 rad-2中, 编码植物 II型
成蛋白的 OsFH5基因均发生了不同程度的突变, 造
成结构域的缺失, 进而直接影响基因的功能。等位
性测验也证实 rad-1和 rad-2为等位突变。据此, 我
们证实OsFH5基因的变异是引起表型变化的内在原
因。该基因呈现组成型表达, 而在突变体中表达量
下调。以上结果说明 OsFH5基因是株型的决定因子,
影响水稻生长的各个阶段, 并最终影响产量。
3.2 OsFH5 基因不同的等位突变呈现不同的效
应, 主要影响细胞的大小
比较 rad-1和 rad-2的表型发现, 2个突变体在成
熟期的表型并不完全一致, 主要表现在粒宽的差异,
rad-2较野生型和 rad-1籽粒更宽。OsFH5基因编码的
是植物 II 型成蛋白, 包括 PTEN-like 结构域, 一个
FH1结构域和 FH2结构域, 其中 PTEN-like 结构域
主要行使结合到叶绿体上的功能, 而后两者作用于
微丝的聚合。在 rad-1中, 突变导致翻译提前终止,
产生仅存124个氨基酸的截短蛋白 , 即3个结构域
1630 作 物 学 报 第 41卷


都缺失, 蛋白完全丧失功能; 然而, 在 rad-2 中, 突
变造成 FH2 结构域部分缺失, 由此产生的蛋白仍保
留了完整的 PTEN-like 和 FH1 结构域, 这样的蛋白
在体内或者仍能实现部分的功能, 或者以假基因的
形式造成 dominant-negative 的效应, 干扰其他同源
基因的功能。在已报道的等位突变体 rmd/bui1 中出
现了穗轴弯曲的表型, 这在 rad 突变体中并没有明
显的体现, 可能是遗传背景不同所致[29]。虽然以上
突变体中突变的基因都相同, 但不同等位变异最终
引起的表型却存在差异, 这其中的真正机制仍然未
知。对于不同等位基因效应的深入研究可有助于进
一步探讨各结构域的功能及基因与基因之间的相互
作用。
3.3 OsFH5蛋白与植株对生长素的响应相关
通过对野生型和突变体苗期叶鞘和成熟期颖壳
的细胞学观察发现, rad-1 和 rad-2 苗期株高的弯曲
和矮化主要是细胞呈现不规则而导致的。OsFH5 蛋
白具备在体外促使微丝、微管成束, 促进 G-肌动蛋
白成核和合成并对微丝进行封端等功能。拟南芥中
一些微管蛋白的突变体 , 包括 tortifolia2、wave-
dampened 2和 spiral1等, 都曾被报道导致植株的扭
曲, 其本质是微管、微丝走向的改变影响了细胞壁
微纤维丝的排列, 最终改变了细胞的形状[32-34]。对
rad 突变体的细胞学观察发现, 突变体的细胞并没
有发生扭曲, 说明茎秆弯曲并不是影响微管微丝的
走向而引起。
Zhang等[29]对于 rmd的研究指出, OsFH5突变后
会影响生长素运输蛋白 PIN 的定位, 进而影响生长
素的极性运输, 限制细胞的生长。我们的研究也发
现 rad-2中一系列 ARF基因表达下调, 包括 ARF2、
ARF3、ARF10和 ARF19等, 这一结果进一步证实了
前人的报道。但在 rad-1 中并没有观察到 ARF 基因
的表达量变化, 说明 OsFH5基因不同类型的突变造
成的影响是不同的。而 OsFH5究竟如何调控生长素
的极性运输还不得而知, 有待进一步研究。
4 结论
rad-1 和 rad-2 为 2 个等位的株型突变体, 候选
基因定位在第 7染色体上约 230 kb的范围内, 其中
OsFH5 基因被证实在 rad-1 和 rad-2 中均发生突变,
导致蛋白截短。OsFH5 基因呈组成型表达。OsFH5
基因突变会导致茎秆细胞生长不规则, 颖壳内层细
胞缩小 , 引起苗期茎秆扭曲 , 成熟期籽粒缩短 , 产
量下降。OsFH5基因可能影响植株对生长素的响应。
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