全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(10): 15191528 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2014AAl0A603和 2012AA101102)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 赵宝华, E-mail: zhaobaohua86178@sohu.com; 吴建利, E-mail: beishangd@163.com
第一作者联系方式: E-mail: songlixin321@foxmail.com
Received(收稿日期): 2015-03-12; Accepted(接受日期): 2015-06-01; Published online(网络出版日期): 2015-6-3
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150603.1610.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01519
水稻斑点叶突变体 spl21的鉴定与基因定位
宋莉欣 1,2 黄奇娜 1 奉保华 1 施勇烽 1 张晓波 1 徐 霞 1 王惠梅 1
李小红 1 赵宝华 2,* 吴建利 1,*
1中国水稻研究所/水稻生物学国家重点实验室 / 国家水稻改良中心, 浙江杭州 310006; 2河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄
050024
摘 要: 通过双环氧丁烷(diepoxybutane)诱变籼稻品种 IR64 获得一个稳定遗传的红褐色斑点叶突变体 spl21 (spot-
ted-leaf 21)。大田条件下, 突变体播种后约 2周叶片上开始出现红褐色斑点, 随后部分斑点融合, 从叶尖开始发黄枯
萎, 并沿叶片两侧边缘向下扩散, 严重时叶片大部分或整体枯死。突变体 spl21与野生型 IR64相比, 其株高、穗长、
有效穗数、实粒数、结实率和千粒重等农艺性状均显著降低。组织化学分析表明, 叶片斑点处及周围有 H2O2沉积。
突变还导致叶绿素 a、叶绿素 b和类胡萝卜素含量极显著降低, 叶片光合能力明显下降; 此外, 突变体中 CAT、SOD、
APX和可溶性蛋白含量均极显著降低, POD活性则极显著升高。遗传分析表明, 突变体表型受 1对隐性核基因控制。
通过图位克隆法最终将该基因定位于第 12 染色体长臂下端介于 InDel-8 和 RM28746 之间约 87 kb 的区段内, 暂名
spl21(t), 本研究为该基因的克隆与功能研究奠定了基础。
关键词: 水稻; 斑点叶突变体; 过氧化氢; 光合色素; 基因定位
Characterization and Gene Mapping of a Spotted-leaf Mutant spl21 in Rice
(Oryza sativa L.)
SONG Li-Xin1,2, HUANG Qi-Na1, FENG Bao-Hua1, SHI Yong-Feng1, ZHANG Xiao-Bo1, XU Xia1, WANG
Hui-Mei1, LI Xiao-Hong1, ZHAO Bao-Hua2,*, and WU Jian-Li1,*
1 State Key Laboratory of Rice Biology / Chinese National Center for Rice Improvement / China National Rice Research Institute, Hangzhou 310006,
China; 2 College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, China
Abstract: The rice spotted-leaf 21 mutant (spl21) was isolated from a diepoxybutane-induced IR64 mutant bank. Under field
conditions, the red-brown spots appeared on the leaves of mutant seedlings in two weeks after sowing. Subsequently, a portion of
spots merged and the leaf tips became yellowish, wilted and spread downwards along both edges of the leaf blade leading to the
death of the whole leaf blade when the symptom was severe. Accumulation of H2O2 was detected in and around the spots. Major
agronomic traits including plant height, length of panicle, number of panicles, number of filled grains, seed setting-rate, and
1000-grain weight were markedly affected in the mutant. The contents of chlorophyll a, b, carotenoid and photosynthetic parame-
ters were significantly reduced in the mutant as compared with the wild type. Furthermore, the activities of CAT, SOD, APX, and
soluble protein contents were significantly lower than those of the wild type while the activity of POD was apparently higher than
that of the wild type. The mutant trait was controlled by a single recessive nuclear gene, tentatively termed spl21(t), located on the
long arm of chromosome 12. The population and data achieved in the present study would facilitate the isolation and functional
analysis of spl21(t).
Keywords: Rice; Spotted-leaf mutant; Hydrogen peroxide; Photosynthetic pigment; Gene mapping
植物斑点叶(spotted leaf)突变体是在没有明显
逆境、机械和农药损伤或者病原菌侵染的条件下, 由
植物体在叶片或叶鞘上自发形成斑点的突变体[1]。斑
点叶突变体分为两类, 一类是斑点处没有发生细胞
1520 作 物 学 报 第 41卷
死亡 , 色斑仅仅是由于色素的沉积形成 , 例如
spl30[2]; 另一类是斑点处发生细胞死亡 , 类似于无
毒病原菌侵染造成的损伤, 因此通常又称为类病斑
突变体(lesion mimic mutant), 在多种植物中已有广
泛的报道[2-8]。
在水稻中, 斑点叶性状虽然复杂多样, 包括不
同色泽、形状和大小的斑点(红色、褐色、橙黄色和
白色), 不同的分布位置(叶片、叶鞘、枝梗和谷壳),
但其遗传控制相对简单, 绝大多数受单隐性基因控
制, 少数受单显性基因控制, 双基因控制和母本遗
传的情况较为少见[1]。迄今为止, 已经报道了约 80
个水稻斑点叶基因, 分布于除第 9 染色体外的其他
11 条染色体上, 但不少斑点叶基因的等位性还有待
测定[8-13]。
目前, 已经克隆了 18 个水稻斑点叶基因, 包括
spl7[14]、spl11[15]、spl18[16]、spl28[17]、OsLSD1[18]、
OsACDR1[19]、OsNPR1[20]、OsPtila[21]、RLIN1[22]、
nls1-1D[23]、cea62[24]、spl5[25]、OsLMS[26]、noe1[27]、
fgl[28]、sl[29]、RLS1[30]和 LMR[31]。研究发现, 包括水
稻等植物中已克隆的基因, 编码许多不同类型的蛋
白, 例如锌指蛋白[5,18]、热激转录蛋白[14]、膜相关蛋
白[17]、离子通道调节蛋白等[32]; 涉及多种生理生化
代谢途径, 比如卟啉代谢[33]、脂肪酸/脂质代谢[34]、
酚类物质代谢[5]以及泛素化作用等[15]。由此可见, 水
稻斑点叶基因具有广泛的生物学功能, 其机制也十
分复杂。充分挖掘、鉴定更多的突变体, 分离相关
基因并阐明各个基因的功能, 才能更加全面了解斑
点叶或类病斑发生的机理, 同时也为研究水稻等植
物的程序性细胞死亡和抗病机制、探讨类病斑抗性
的育种价值提供参考。
本 研 究 利 用 籼 稻 IR64 经 过 双 环 氧 丁 烷
(Diepoxybutane)诱变获得一个稳定遗传的斑点叶突
变体spl21[35], 其农艺性状和生理生化特征均发生
了显著变化。突变体褐色斑点叶性状受1对隐性核
基因控制, 该基因暂被命名为spl21(t), 定位于第12
染色体长臂上, 是一个不同于已克隆的新斑点叶基
因。研究结果为该斑点叶基因的克隆和功能分析奠
定了基础。
1 材料与方法
1.1 突变体农艺性状观察
突变体 spl21经过多代自交, 其褐色斑点表型在
浙江和海南均能稳定遗传。2014 年将该 spl21 和野
生型 IR64种植于杭州富阳实验基地, 每个材料 4行
共 24株, 株行距 17 cm × 20 cm, 成熟期分别调查株
高、穗长、单株有效分蘖数、结实率、千粒重等农
艺性状, 3次重复, 取其平均值。
1.2 褐斑对光合色素含量的影响
采用Arnon和Wellburn等[36-37]的方法, 在大田条
件下 , 分别测定苗期、分蘖期和抽穗期的野生型
IR64、突变体spl21带斑点和不带斑点叶片中叶绿素
a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量。处理过的样品分
别测定在470 nm、645 nm和663 nm三个波长下的吸
光值 , 然后根据公式分别计算spl21和 IR64的色素
含量。
1.3 组织化学分析
从田间取同时期的spl21红褐斑叶片、无斑叶片
和对照 IR64, 采用Thordal-Christensen等 [38]的方法 ,
利用二氨基联苯胺(diamino benzidine, DAB)染色检
测突变体类病斑部位过氧化氢发生情况。
1.4 突变体光合指标测定
用便携式光合仪 Li-6400 进行叶片光合作用指
标的测定。在大田条件下, 天气晴朗的上午 8:00—
10:00分别测定分蘖盛期突变体 spl21和野生型 IR64
的叶片净光合速率(photosynthetic rate, Pn)、气孔导
度 (stomatal conductance, Gs)、 胞 间 CO2 浓 度
(intercellular CO2 concentration, Ci)、蒸腾 速 率
(transpiration rate, Tr)。使用光合仪 Li-6400的红蓝光
源, 光量子密度为 1200 μmol m–2 s–1, 流速为 500
μmol s–1。每个部位测定 3片叶, 取平均值。
1.5 衰老相关指标测定
参照赵世杰等[39]方法, 从田间分别选取分蘖盛
期 spl21和 IR64的主茎倒二叶和倒三叶, 抽提后, 对
其 过 氧 化 氢 酶 (catalase, CAT) 、 过 氧 化 物 酶
(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶 (superoxide
dismutase, SOD)、抗坏血酸过氧化物酶 (ascorbate
peroxidase, APX)、可溶性蛋白含量(soluble protein
contents)和丙二醛 (malonaldehyde, MDA)含量等与
衰老生理生化相关指标进行测定。
1.6 遗传分析
以spl21为母本, 分别以Moroberekan、LH422和
Jefferson为父本进行杂交, 观察F1的表型; 调查来源
于spl21/Moroberekan、spl21/LH422和spl21/Jefferson
三个组合的F1自交获得的F2群体性状的分离情况 ;
同时调查来源于spl21/Moroberekan的3个F3分离株
系, 用于遗传验证。
第 10期 宋莉欣等: 水稻斑点叶突变体 spl21的鉴定与基因定位 1521
1.7 DNA提取和 PCR检测
采用简易法 [39]从水稻叶片中提取基因组DNA,
用于PCR。PCR体系包括1 µg的模板DNA、1 µL (10
µmol L–1)引物、0.2 µL (10 mmol L–1) dNTPs、1 µL
10×PCR缓冲液、0.25 µL Taq DNA聚合酶(2 U μL–1),
加ddH2O补足10 µL。在Biometra PCR仪上进行扩增
反应, 反应条件为94℃预变性2 min; 94℃ 30 s, 55
℃ 30 s, 72℃ 40 s, 共35个循环; 72℃延伸5 min。反
应产物经6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色,
分析检测样品间的多态性。
1.8 基因定位
采用DNA分池法(bulk segregation analysis)根据
F2表型随机选取红褐斑点叶与正常叶单株各10株 ,
每单株以等量叶片混合, 各自提取构成斑点叶DNA
池与正常叶DNA池。
初定位采取两个DNA池和随机选取的36株红褐
色斑点叶单株。选取均匀分布于12条染色体上的微
卫星(SSR)标记筛选亲本spl21与Moroberekan之间的
多态性, 亲本间有多态的标记进一步用于两池的筛
选, 然后两池间有多态的标记用随机选取的36株红
褐色斑点叶单株进一步验证。所用SSR标记的引物
序列下载自 Gramene数据库 (http://www.gramene.
org/), 引物由上海生工生物工程有限公司合成。
根据初步定位结果, 采用 841 个 F2褐色斑点叶
单株进行精细定位。在目标区间进行 SSR标记加密,
并利用国际公共数据库 RGP (http://rgp.dna.affrc.go.
jp/E/toppage.html), Gramene (http://gramene.org/genome_
browser/index.html)和中国科学院华大基因研究中心
(http://rice.genomics.org.cn/rice/index2.jsp)已公布的
粳稻日本晴和籼稻 93-11 全基因组序列, 比对分析
日本晴和 93-11 间序列的差别 , 借助生物学软件
Primer Premier5.0 和 DNAStar5.0 设计插入 /缺失
(InDel)引物, 筛选多态性标记用于精细定位斑点叶
基因。引物合成、PCR条件和电泳分析条件同上。
2 结果与分析
2.1 突变体表型
在杭州富阳大田自然条件下, 突变体 spl21播种
约 2 周后, 从第一叶叶尖开始出现大小不同、形状
不规则的红褐色斑点, 然后逐渐扩散至全叶, 到后
期部分斑点融合, 从叶尖开始枯萎, 并沿叶片两侧
边缘向下扩散 , 严重时叶片大部分或整体枯死(图
1)。突变体 spl21的抽穗期比野生型晚约 10 d, 突变
体的穗长与野生型相比存在显著差异; 而株高、有
效穗数、实粒数、结实率和千粒重与野生型存在极
显著差异(表 1)。突变体较矮的原因是第 1、第 2、
第 3、第 4和第 5节间比野生型极显著缩短(图 2)。
图 1 突变体表型
Fig. 1 Phenotype of the mutant
A: 野生型 IR64幼苗; B: 突变体 spl21幼苗; C: 苗期叶片
(左: IR64; 右: spl21); D: 分蘖期 IR64和 spl21。
A: seedling of IR64; B: seedling of the mutant; C: leaves at the
seedling stage (Left: IR64; Right: spl21); D: plants of the wild type
and the mutant at the tillering stage.
图 2 野生型 IR64与突变体 spl21的节间长度
Fig. 2 Internode length of the wild type IR64 and mutant spl21
2.2 突变体光合色素含量
光合色素含量测定结果表明, 苗期突变体 spl21
不带斑点叶片与野生型 IR64叶片间叶绿素 a、叶绿
素 b、类胡萝卜素含量均无显著差异; 而 spl21带斑
点叶片与 IR64 相比, 叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝
卜素的含量均极显著下降, 但与 IR64 相比, 叶绿素
a/b 比值没有差异(表 2)。分蘖期和抽穗期的结果和
苗期一致(见附表 1、附表 2和附表 3)。由于不同时
期突变体叶绿素 a/b比值与野生型 IR64均没有差异,
说明突变体光合色素含量下降可能与总活性细胞有
关, 而与叶绿素代谢缺陷无关。
1522 作 物 学 报 第 41卷
表 1 突变体和野生型的农艺性状
Table 1 Performance of agronomic traits in the mutant and wild type
材料
Material
株高
Plant height (cm)
有效穗数
No. of panicles
穗长
Panicle length (cm)
实粒数
Filled grain/panicle
结实率
Seed-setting rate (%)
千粒重
1000-grain weight (g)
IR64 118.9±1.5 19.3±1.2 26.6±0.5 1471.3±281.5 72.5±5.8 27.2±0.4
spl21 89.1±6.5** 13.7±2.8** 24.1±1.0* 370.3±42.6** 37.3±2.8** 20.2±1.2**
*和**表示在 0.05和 0.01水平上差异显著。* and ** denote significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.
表 2 苗期叶片光合色素含量
Table 2 Pigment contents at the seedling stage
材料
Material
叶绿素 a
Chlorophyll a (mg g–1)
叶绿素 b
Chlorophyll b (mg g–1)
叶绿素 a/b
Chlorophyll a/b
类胡萝卜素
Carotenoid (mg g–1)
IR64 1.994±0.105 a 0.580±0.032 a 3.438±0.046 a 0.373±0.016 a
spl21-NO 2.154±0.423 a 0.629±0.107 a 3.420±0.183 a 0.412±0.089 a
spl21-SPL 1.107±0.197 b 0.352±0.065 b 3.143±0.086 a 0.217±0.030 b
spl21-NO: 无斑点的突变体叶片; spl21-SPL: 有红褐斑的突变体叶片。a、b表示 Duncan’s测验显著(P≤0.05)。
spl21-NO: mutant leaves without lesions; spl21-SPL: mutant leaves with lesions. Values followed by different letters are significantly
difference at P≤0.05 on the basis of Duncan’s test.
2.3 突变体 spl21叶片 H2O2沉积
二氨基联苯胺(DAB)染色可以在细胞水平上检
测活性氧物质的产生与积累。如图 3显示, spl21不
带斑点叶片和野生型 IR64叶片没有被 DAB染色(图
3-A~D); spl21带斑点叶片斑点处及周围被染成红棕色
(图 3-E, F)。说明突变体中具有较多的过氧化氢产生。
2.4 突变体的光合指标变化
突变体 spl21分蘖盛期主茎倒二叶(无斑点)的净
光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间 CO2浓度(Ci)和
图 3 突变体 spl21和野生型 IR64叶片 DAB染色结果
Fig. 3 DAB staining of leaves in the mutant spl21 and wild
type IR64
A: IR64染色之前; B: IR64染色之后; C: spl21无斑叶片
(spl21-NO)DAB染色之前; D: spl21无斑叶片(spl21-NO)DAB染
色之后; E: spl21褐斑叶片(spl21-SPL)DAB染色之前; F: spl21褐
斑叶片(spl21-SPL)DAB染色之后。
A: IR64 before DAB staining; B: IR64 after DAB staining;
C: spl21-NO before DAB staining; D: spl21-NO after DAB staining;
E: spl21-SPL before DAB staining; F: spl21-SPL after DAB staining.
蒸腾速率(Tr)均与野生型无差异(图4); 而倒三叶(有
斑点)的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和蒸腾速率(Tr)
与野生型 IR64相比均极显著降低, 但胞间 CO2浓度
(Ci)则极显著升高(图4)。以上结果说明, 随着突变体
spl21在分蘖盛期叶片枯萎表型的加重, 叶片的水分
含量相应减少, 气孔导度降低, 蒸腾作用相应减弱,
而胞间 CO2浓度却开始积累增加, 最终导致叶片的
光合速率降低。
2.5 突变体衰老相关指标变化
突变体 spl21 与野生型 IR64 相比, 主茎倒二叶
(无褐斑)的 CAT、POD、SOD、APX 和可溶性蛋白
含量均无差异; 但倒三叶(有褐斑)的 CAT、SOD、
APX和可溶性蛋白含量均极显著降低(图 5-A, C, D,
E), POD 活性则极显著升高(图 5-B)。突变体 spl21
主茎倒二叶、倒三叶的 MDA 含量均略高于野生型
IR64, 但无显著差异(图 5-F), 说明突变体主要活性
氧清除酶活性的改变可能与细胞死亡有关 , 但
MDA含量未明显改变, 又不同于典型的叶片衰老。
因此 , spl21 是否是一个早衰的突变体还有待于进
一步研究。
2.6 突变体的遗传模式
以 spl21为母本, Moroberekan、LH422和 Jefferson
为父本分别构建了 spl21/Moroberekan、spl21/LH422
和 spl21/Jefferson 三个群体, 考察各自的 F1植株表
型, 发现所有的 F1 都表现为正常绿色叶, 说明褐色
斑点叶性状受隐性基因控制。观察 3个群体的 F2单
株, 发现其均出现明显的分离, 分别表现亲本的性
第 10期 宋莉欣等: 水稻斑点叶突变体 spl21的鉴定与基因定位 1523
状, 没有中间类型的植株。spl21/Moroberekan 的 F2
群体中共考察 824株, 其中野生型个体 624株, 突变
型个体 200株, 经卡平方检验, 野生型与突变型个体
的分离比符合 3∶1 (χ2=2.606<χ20.05=3.84); spl21/
LH422 的 F2群体中共考察 524 株, 其中野生型个体
377 株, 突变型个体 147 株, 经卡平方检验, 野生型
与突变型个体的分离比符合 3∶1 (χ2=0.233<χ20.05=
3.84); spl21/Jefferson的 F2群体中共考察 705株, 其
中野生型个体 549株, 突变型个体 156株, 经卡平方
检验 , 野生型与突变型个体的分离比也符合 3∶1
(χ2=3.102<χ20.05=3.84)。另外 , 来源于 spl21/Moro-
berekan的 3个 F3分离株系的正常株和突变株比例也
都符合 3∶1 (见附表 4), 以上结果说明该突变体性
状受 1对隐性核基因控制(表 3)。
图 4 野生型 IR64和突变体 spl21光合指标
Fig. 4 Photosynthetic parameters of the wild type IR64 and mutant type spl21
**极显著差异(P≤0.01)。** Significant at P≤0.01.
图 5 野生型 IR64和突变体 spl21生理生化指标
Fig. 5 Physiological and biochemical indexes of wild type IR64 and mutant type spl21
A: 过氧化氢酶(CAT)活性; B: 过氧化物酶(POD)活性; C: 超氧化物歧化酶(SOD)活性; D: 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性; E: 可溶性
蛋白含量; F: 丙二醛(MDA)含量。**极显著差异(P≤0.01)。
A: CAT activity; B: POD activity; C: SOD activity; D: APX activity; E: total soluble protein content; F: MDA content. ** Significant at
P≤0.01.
1524 作 物 学 报 第 41卷
表 3 褐色斑点叶突变体 spl21的遗传分析
Table 3 Genetic analysis of spl21 mutant
F2 组合
Cross
F1 无斑株数 No. of normal plants 斑点株数 No. of spotted plants 总数 Total
χ2 (3:1)
spl21/Moroberekan 无斑点 Normal 624 200 824 2.606
spl21/LH422 无斑点 Normal 377 147 524 0.233
spl21/Jefferson 无斑点 Normal 549 156 705 3.102
2.7 斑点叶基因定位
在第 12 染色体上有 7 个 SSR 标记(RM28438、
RM28466、RM28537、RM235、RM17、RM28828和
RM28621)在亲本间和DNA池之间均有多态性, 随后
用随机选取的 36个斑点叶单株验证发现, RM235有 2
个交换单株, RM17和RM28828均只有 1个交换单株,
表明该斑点叶基因与这 3个标记紧密连锁, 初步表明
该基因位于第 12染色体长臂上, 暂名 spl21(t)。
为精细定位该褐色斑点叶基因, 利用已有标记
和新发展的 SSR标记对 F2群体中的另外 841株突变
型植株进行基因型分析, 最终将该褐色斑点叶基因
定位于第12染色体长臂下端 RM28723和 RM28746
之间约200 kb 的区段内。根据籼粳稻序列差异, 借
助生物学软件 Primer Premier5.0和 DNAStar5.0在
RM28723和 RM28746中间新发展了39个 InDel 标记
(见附表5), 最终将 spl21定位于 InDel-8和 RM28746
之间约87 kb 区间内(图6)。根据 Gramene 网站的注
释, 该区间共有13个开放阅读框, 尚无斑点叶基因
的报道, 因此, 本研究定位的斑点叶基因 spl21(t)可
能是一个新基因。
图 6 spl21(t)在第 12染色体上的物理定位
Fig. 6 Physical location of spl21(t) on chromosome 12
3 讨论
目前, 国内外已经报道了大量水稻斑点叶突变
体的研究, 表明水稻斑点叶突变体除产生色泽、形
状和大小不同斑点外 , 还通常伴随着重要农艺性
状、光合色素代谢以及抗病性等的改变[1,4,13]。
本研究通过双环氧丁烷(diepoxybutane)诱变获
得一个褐色斑点叶突变体, 该突变体在播种约 2 周
后开始出现红褐色斑点, 之后部分斑点融合并从叶
尖开始枯萎, 严重时叶片大部分或整体枯死, 抽穗
后突变体植株衰老明显。突变体 spl21在苗期、分蘖
期和抽穗期与野生型 IR64 相比, 叶绿素 a、叶绿素
b、类胡萝卜素的含量均极显著下降, 但叶绿素 a/b
的比值却无显著差异, 说明突变体斑点的产生可能
与测定时的活细胞数目有关, 而与叶绿素代谢缺陷
无关, 这与之前报道的 spl30(t)明显不同[2]。另外, 突
变体 spl21叶片净光合速率、气孔导度和蒸腾速率均
比野生型极显著降低, 但胞间 CO2 浓度有所增加,
其原因与突变体大部分斑点叶片快速枯萎, 叶片失
水严重有关。突变体植株在抽穗后叶片快速枯萎 ,
似有早衰的迹象, 因此我们怀疑 spl21可能是一个早
衰突变体。在分蘖盛期突变体 spl21倒三叶的 CAT、
SOD和APX活性极显著降低, 此时叶片已经产生斑
点但还未枯萎, 不过可能已经不能有效清除不断积
累的过氧化氢或其他活性氧自由基, 导致加速叶片
衰老; 同时, 突变体的可溶性蛋白含量极显著降低,
不足以提供植物体生长所需, 也会导致叶片加速衰
老死亡; 突变体倒三叶的 POD 活性极显著升高, 可
能是斑点的产生导致细胞壁及细胞器机械损伤, 从
第 10期 宋莉欣等: 水稻斑点叶突变体 spl21的鉴定与基因定位 1525
而削弱结合态 POD的结合能力, 致使较多结合态的
POD从细胞壁上游离出来, 引起游离态 POD的大幅
上升[41]。有趣的是突变体倒三叶 MDA含量升高, 但
未达到显著程度, 有别于植物正常衰老过程。因此,
spl21是否是一个早衰的突变体还有待进一步研究。
到目前为止 , 在第 12 染色体上已经定位了
sl[29]、spl11[15]、spl29(t)[42]、spl30(t)[43]、syl1[44]、splt[45]、
spl31[46]、lmm3[47]等 8 个斑点叶相关基因, 其中 sl
和 spl11基因已被克隆。syl1与 spl(t)位于第 12染色
体短臂上, lmm3、spl29(t)与 spl31相距较近, 都位于
第 12染色体着丝粒附近, spl30(t)位于长臂着丝粒与
标记 RM3739之间, 而本研究定位的 spl21(t)靠近长
臂末端, 两者之间相隔约 100 Mb, 因此, 初步确定
spl21(t)是一个新斑点叶基因。本研究定位的 spl21(t)
位于第 12染色体 InDel-8和 RM28746之间约 87 kb
区段内, 该区段内共 13个开放阅读框, 其中 LOC_
Os12g42290、LOC_Os12g42320、LOC_Os12g42390、
LOC_Os12g42410 和 LOC_Os12g42360 编码不同的
假定蛋白, LOC_Os12g42300编码钾离子流出逆向转
运蛋白 , LOC_Os12g42310 编码丝 /苏蛋白磷酸酶
BSL2, LOC_Os12g42330 编码舌下腺粘蛋白前体 ,
LOC_Os12g42340编码含OsFBX464-F-box结构域的
蛋白, LOC_Os12g42370编码未知结构域的 GTP酶、
LOC_Os12g42380编码表达蛋白、LOC_Os12g42400
编码核转录因子 Y 亚基、LOC_Os12g42420 编码
DNA结合蛋白, 这些基因均未被克隆。目前, spl21(t)
候选基因的鉴定正在进行中。
4 结论
红褐斑突变体 spl21 属于扩散型斑点叶突变体,
该性状受一个新的单隐性核基因控制, 位于第 12染
色体长臂末端。该基因的突变除导致突变体株高、
穗长、结实率以及千粒重等重要农艺性状显著降低
外, 还导致光合色素和光合效率极显著降低。此外,
衰老相关指标包括活性氧自由基清除系统中的
APX、CAT、SOD 酶活性和可溶性蛋白含量均显著
降低, 但MDA含量并未明显改变, 有别于正常的衰
老过程。深入研究 spl21(t)基因的功能将有助于对植
物衰老现象本质的理解。
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附表 1 分蘖期叶片光合色素含量
Supplementary table 1 Pigment contents at the tillering stage
材料
Material
叶绿素 a
Chlorophyll a (mg g–1)
叶绿素 b
Chlorophyll b (mg g–1)
叶绿素 a/b
Chlorophyll a/b
类胡萝卜素
Carotenoid (mg g–1)
IR64 3.211±0.170 A 0.909±0.047 A 3.531±0.048 A 0.649±0.039 A
spl21-NO 3.123±0.196 A 0.889±0.064 A 3.514±0.049 A 0.615±0.090 A
spl21-SPL 1.506±0.104 B 0.452±0.041 B 3.332±0.082 A 0.400±0.027 B
A、B表示 Duncan’s测验显著(P≤0.05)。Duncan’s test significance at P≤0.05.
附表 2 抽穗期剑叶光合色素含量
Supplementary table 2 Pigment contents of flag leaves at the heading stage
材料
Material
叶绿素 a
Chlorophyll a (mg g–1)
叶绿素 b
Chlorophyll b (mg g–1)
叶绿素 a/b
Chlorophyll a/b
类胡萝卜素
Carotenoid (mg g–1)
IR64-flag leaf 2.887±0.072 0.882±0.031 3.276±0.094 0.543±0.023
spl21-flag leaf 2.414±0.029** 0.753±0.010** 3.204±0.008 0.477±0.003**
** 表示在 0.01水平差异显著。** Significant at the 0.01 probability level.
附表 3 抽穗期倒二叶光合色素含量
Supplementary table 3 Pigment contents of the second upper leaf at the heading stage
材料
Material
叶绿素 a
Chlorophyll a (mg g–1)
叶绿素 b
Chlorophyll b (mg g–1)
叶绿素 a/b
Chlorophyll a/b
类胡萝卜素
Carotenoid (mg g–1)
IR64-second upper leaf 3.338±0.189 1.086±0.054 3.073±0.023 0.621±0.040
spl21-second upper leaf 1.128±0.080** 0.360±0.026** 3.134±0.066 0.301±0.023**
** 表示在 0.01水平差异显著。** Significant at the 0.01 probability level.
1528 作 物 学 报 第 41卷
附表 4 来源于 spl21/Moroberenkan的 F3分离株系的遗传分析
Supplementary table 4 Genetic analysis of F3 segregation lines derived from spl21/Moroberekan
F3株系
F3 line
总植株数
Total No. of plants
野生型数
No. of wild type plants
突变型数
No. of mutant type plants
χ2 (3:1)
株系 1 Line 1 150 119 31 1.502
株系 2 Line 2 188 147 41 1.021
株系 3 Line 3 176 137 39 0.758
附表 5 用于 spl21(t)基因定位的分子标记
Supplementary table 5 Polymorphic markers used for spl21(t) gene mapping
标记
Marker
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
RM235 AAGCTAGGGCTAACGAACGAACG TCTCCATCTCCATCTCCATCTCC
RM28723 TGCACAACAGGAGTTCAGAAAGC GACATGTCTCAACGGACGTAGGC
RM28746 GAAGAAAGAAGACGCCAAGAAACG CATTCCATTCCCTTCCTCTTCG
RM28753 TGCTGAAACTTGAGGGAATAGC GCCTGCATATACAGTGGTTGG
RM28763 AAGGGAATGCCATTTGAACTCG AGGAACGGATCTGAGCGAGAGG
RM17 GGAGAAAGAGAGGTGATCCTTTCC CATGTCTTGGTGAGTGATGTTGC
InDel-1 ATGTGGGAGATGGGATTT CTTATGCAAGTCATGTAGGAGT
InDel-8 AAGCCGAAGGTTGGTTACTG ATAGGGTTCTTATTGTTCAGCTCA