全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1360−1365 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因植物新材料的育种价值评估项目(2011ZX08010-005)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 杨俐苹, E-mail: yangliping@caas.cn, Tel: 010-82105030
第一作者联系方式: E-mail: houwt1988@163.com, Tel: 15313572065
Received(收稿日期): 2013-01-06; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-05-20.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130520.1158.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01360
遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的
影响
侯文通 1 杨俐苹 1,* 陈茹梅 2 张少军 2
1中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 / 农业部植物营养与肥料重点实验室, 北京 100081; 2 中国农业科学院生物技术研究所,
北京 100081
摘 要: 以转黑曲霉植酸酶基因(phyA2)玉米 T9代纯合系及与之对应世代的阴性对照为材料, 通过低磷土壤培养试验
研究植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响。结果显示, 在施用植酸钠和不施磷的条件下, 与阴性对
照相比, 转基因玉米根际土壤的磷酸酶活性分别提高 5.17%和 5.48%, 根际中等活性有机磷分别降低 16.2%和 28.2%;
植株磷积累量分别增加 140%和 100%, 各生长指标都明显好于阴性对照。说明遗传转化的黑曲霉植酸酶基因能提高
玉米利用土壤有机磷的能力, 增加玉米体内磷的积累, 改善玉米的生长状况。
关键词: 植酸酶基因; 玉米; 土壤有机磷; 植株磷
Effects of Aspergillus niger phyA2 Transgenic Maize on Utilization of Organic
Phosphorus in Soil
HOU Wen-Tong1, YANG Li-Ping1,*, CHEN Ru-Mei2, and ZHANG Shao-Jun2
1 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Plant Nutrition and Fer-
tilizer, the Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China; 2 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing
100081, China
Abstract: Homozygous phyA2 transgenic maize lines at T9 generation and the corresponding generation of negative control were
grown in low-phosphorus (P) soil to investigate the ability of maize plant to acquire P from organic sources. It showed that the
soil phosphatase activity increased by 5.17% and 5.48%, the moderately labile organic P decreased by 16.2% and 28.2% respec-
tively in phyA2 transgenic maize rhizosphere, and the P accumulation of transgenic plant increased significantly by 140% and
100% respectively as compared with a control plant line when supplied with phytate as P sources and without P-fertilizer. The
plant growth of phyA2 transgenic maize was better improved than that of the negative control plant. These data indicated that we
can improve the ability of plant to utilize soil organic P, the plant P accumulation and the plant growth by transferring Aspergillus
niger phyA2 gene into maize.
Keywords: Phytase gene (phyA2); Maize; Soil organic phosphorus; Plant phosphorus
磷是作物生长发育所必需的大量营养元素之
一。通常, 土壤中大约 50%~80%的磷素以有机磷形
式存在, 其中 50%左右又以植酸态磷的形式存在[1],
这些磷很难被作物吸收利用[2]。能被作物吸收的磷
素主要是无机态磷酸根, 但磷酸根容易与土壤中的
金属离子结合形成沉淀, 致使土壤中可被利用的磷
更少而不能满足植物的需求。土壤全磷含量高而作
物可吸收利用的有效磷低 , 作物表现出“遗传学缺
磷”, 生产中施用磷肥的当季利用率不足 20% [3]。这
种现象不但严重制约了作物的高产、造成资源浪费,
而且还会引起环境的污染。因此, 提高作物对植酸
态等有机磷的吸收利用对于改善作物磷素营养进而
促进磷素资源的可持续利用具有重要的意义。
土壤有机磷经过矿化分解可转化为有效态磷 ,
供给植物吸收利用。在无机磷含量较低的土壤上 ,
有机磷经矿化后转换的无机态磷(Pi)成为植物吸收
第 8期 侯文通等: 遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响 1361


磷素的重要来源。有机态磷的矿化速率取决于土壤
磷酸酶的活性。按照 Bowman-Cole 法, 土壤有机磷
可分为 4 组, 即易矿化、易为植物吸收的活性有机
磷 , 较易矿化、同时也较易为植物吸收的中活性
有机磷, 较难矿化、且较难为植物吸收的中稳性有
机磷, 和很难矿化、基本不被植物吸收的高稳性有
机磷。
植酸酶即肌醇六磷酸水解酶 , 一种磷酸酯酶 ,
是可以特异地催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸
(或磷酸盐)的一类酶的总称[4]。通过转基因技术, 将
来源于微生物的植酸酶基因导入作物中, 使其能在
根部高效表达植酸酶并分泌到根外, 促进根系对有
机态磷的利用, 是提高作物磷素利用效率的一种新
途径。目前, 关于植酸酶转基因研究不仅在模式植
物烟草[5-6]和拟南芥[7]中有报道, 而且在三叶草[8]、大
豆[9]、小麦[10]、水稻[11]、油菜[12]、玉米[13]等作物中
也成功表达。
前人有关拟南芥[7]、玉米[13]等遗传转化植酸酶
转基因利用植酸态磷的研究, 多在生长培养基中添
加植酸盐作为唯一磷源。目前, 在土壤环境中转基
因植物对有机态磷吸收利用的研究不多 , 其中转
phyA 基因烟草 [14]在无施肥处理的缺磷土壤中未能
增加磷的积累量, 施用有机磷处理的磷积累量增加
52%; 施植酸处理下, 转 phy基因棉花[15]植株磷含量
较野生型显著提高 , 各农艺性状指标好于野生型 ;
不施磷处理下, 转 phy 基因油菜[16]各农艺性状指标
差于野生型, 但施用植酸处理下, 各农艺性状指标
好于野生型。以上研究表明, 当缺磷土壤中施用植
酸作为磷源, 转 phy基因作物生长状况都优于对照。
转 phyA2 基因的玉米在土壤环境中效果如何, 能否
有效利用土壤中的有机磷, 前人对此研究很少。本
研究采用转 phyA2 基因的玉米 T9代纯合株系, 通过
低磷土壤培养试验验证其利用有机磷的能力, 为进
一步培育和筛选转 phyA2 基因磷高效玉米新品种提
供试验依据。
1 材料与方法
1.1 转基因植株的 PCR验证
用十六烷三甲基溴化铵(CTAB)法提取玉米叶
片基因组 DNA, 扩增引物为黑曲霉(Aspergillus ni-
g e r )的植酸酶基因的特异引物 , 上游引物为
5′-CAGTCCCCGCCTCGAGAAAT-3′, 下游引物为
5′-TGCCGTTGTACAGACCCAAA-3′。扩增体系为
10×Taq buffer 2.0 μL, 10 mmol L−1 dNTP Mix 0.4 μL,
10 μmol L−1的上、下游引物各 0.5 μL, 5 U μL−1 Taq
DNA polymerase 0.2 μL, ddH2O 15.4 μL, 基因组
DNA 1 μL, 总体积 20 μL。PCR 扩增程序为 95℃
4 min; 94℃ 30 s, 55℃ 45 s, 72℃, 1 min; 32个循环,
72℃延伸 10 min。
1.2 供试材料
从黑曲霉(Aspergillus niger)中分离得到植酸酶
基因 (phyA2), 5′端融合来自胡萝卜的分泌信号肽
extensin, 由 Ubi 启动子驱动, 参照 Tomes [17]方法,
用基因枪法转化玉米(Zea mays L.)幼胚。获得再生苗
后, 将 PCR 检测叶片植酸酶基因阳性的植株移栽到
温室土壤中生长。与黄早四杂交得到 T1代种子, 后
代经自交繁殖, 至 T4 代纯合后, 与黄早四回交, 推
进世代。通过籽粒酶活性测定选择得到转基因事件
C63(GM), 植酸酶在这个材料中组成型表达 , 在玉
米的整株和整个生长过程中能持续表达植酸酶, 并
向根外分泌。本研究的供试材料为 C63事件 T9代种
子, 为纯合系, 籽粒植酸酶活性为 18 084.4±569.6 U
kg−1, 阴性对照(CK)为在选育过程中分离出来的阴
性材料, 酶活性低于 493.4 U kg−1。
1.3 试验设计
供试土壤采自中国农业科学院(万庄)农业高新技
术产业园中长期定位试验5年不施磷处理的土壤(0~20
cm), 土壤类型为潮土, 土壤质地为砂壤。土壤 pH 8.1,
含有机质 1.02%、全氮 0.06%、全磷 0.06%、全钾 2.03%、
速效磷 2.6 mg kg−1、速效钾 118.1 mg kg−1。将土样采
回后避光风干, 去除杂质, 研磨过 2 mm筛后备用。
盆栽试验的盆砵直径 25 cm, 高 20 cm, 每盆装
土 5.5 kg。设 3个磷肥水平, 即不施磷(−P)、施无机
磷(+Pi)和施有机磷(+phy)。6个处理分别为: (1)不施
磷+转基因玉米; (2)不施磷+阴性对照; (3)无机磷+转
基因玉米; (4)无机磷+阴性对照; (5)有机磷+转基因
玉米; (6)有机磷+阴性对照。其中, 无机磷为磷酸二
氢钾, 有机磷为 Sigma 公司生产的 P-0109 植酸钠,
用量为 P2O5 0.10 g kg−1土; 每个处理施用相同的氮
钾底肥, 以尿素和硫酸钾提供, 用量分别为氮 0.15 g
kg−1土, K2O 0.15 g kg−1土。每个处理 4次重复。将
土壤与肥料混合均匀后装盆。
试验于 2012年 6月 30日至 8月 31日在中国农
业科学院露天进行。选择大小一致的玉米种子催芽,
露白后按处理每盆 3 颗, 三叶期经叶片 PCR检测为
阳性者, 每盆只留一株, 玉米在抽雄至吐丝期(2012
年 8月 31日)收获。
1362 作 物 学 报 第 39卷

1.4 样品采集与测定
收获时先测量株高、叶长、叶宽, 然后把植株
地上部与地下部分开。称取植株地上部分干重、鲜
重 , 测定植株磷含量 , 并计算植株磷积累量 ; 采用
抖根法 [18]取根际土 , 用来测定根际土壤磷酸酶活
性、速效磷以及各有机磷组分等。
参考《土壤农业化学分析方法》 [19]。采用
H2SO4-H2O2 法测定植株磷含量 , 植株磷积累量 (g
株 −1)=植株磷含量 (%)×对应单株植株质量 (g)/100;
采用对硝基苯磷酸二钠-分光光度法测定土壤磷酸
酶活性, 采用 Olsen法浸提-分光光度法测定速效磷,
对有机磷按照 Bowman-Cole法分级。
1.5 数据处理
采用 Microsoft Excel 2010处理数据和唐启义的
DPS12.50进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 转基因玉米 PCR验证
从图 1 中可以看出, 转 phyA2 基因的玉米植株
全部为阳性, DNA 扩增的片段与阳性对照(17 泳道)
DNA扩增的片段大小一致(1076 bp), 而阴性对照植
株(18泳道)DNA未扩增出相应的条带。可证明外源
植酸酶基因已经存在于转 phyA2基因的玉米植株中,
这也可以解释其籽粒植酸酶活性高的原因。


图1 转基因植株的PCR检测结果
Fig. 1 PCR analysis of transgenic plants
1: 1 kb ladder分子量标准; 2~16: 转基因植株DNA扩增片段;
17: 阳性对照; 18: 阴性对照。
1: 1 kb ladder DNA marker; 2−16: transgenic plants;
17: positive control; 18: negative control.

2.2 转基因玉米根际土壤磷酸酶活性变化
由图 2 可以看出, 在施植酸钠和不施磷的条件
下, 转基因玉米根际土壤磷酸酶活性都显著高于阴
性对照, 酶活性分别提高 5.17%和 5.48%; 施用无机
磷的处理, 转基因玉米和阴性对照根际土壤磷酸酶
活性差异不显著。施植酸钠和不施磷处理的根际土
壤酶活性显著高于施无机磷处理; 阴性对照, 3 个处
理下差异都不显著。这表明在施植酸钠和不施磷处理
下, 转基因玉米显著提高了根际土壤磷酸酶活性。

图2 玉米根际土壤磷酸酶活性
Fig. 2 Soil phosphatase activity in maize rhizosphere
柱上不同小写字母代表处理间差异达5%显著水平。−P: 不施磷;
+Pi: 施无机磷; +phy: 施植酸钠。GM: 转基因玉米; CK: 阴性
对照。
Different letters above the bars indicate significant difference
between treatments at P< 0.05. −P: no P; +Pi: KH2PO4; +phy:
phytate. GM: transgenic maize; CK: negative control.

2.3 转基因玉米根际土壤速效磷变化
由图 3 可以看出, 使用无机磷肥可使土壤速效
磷含量显著增加, 施无机磷处理的转基因植株和阴
性对照植株根际速效磷含量均显著高于施植酸钠和
不施磷的处理; 施无机磷处理转基因植株根际速效
磷含量与阴性对照植株的差异不显著; 施植酸钠处
理和不施磷的处理转基因植株根际土壤速效磷含量
均比阴性对照显著降低, 分别为 35.7%和 34.5%。通
常作物吸收土壤中的磷是土壤速效磷降低的主要原
因。这里在施植酸钠和不施磷的条件下, 转基因植
株根际土壤速效磷含量低于阴性对照, 可能是转基
因植株生长好于阴性对照造成的。


图3 玉米根际土壤速效磷含量
Fig. 3 Soil available phosphorus content in maize rhizosphere
柱上不同小写字母代表处理间差异达5%显著水平。−P: 不施磷;
+Pi: 施无机磷; +phy: 施植酸钠。GM: 转基因玉米; CK: 阴性
对照。
Different letters above the bars indicate significant difference
between treatments at P< 0.05. −P: no P; +Pi: KH2PO4; +phy:
phytate. GM: transgenic maize; CK: negative control.
第 8期 侯文通等: 遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响 1363


2.4 转基因玉米根系土壤有机磷分级
由图 4 可知, 施用无机磷的转基因植株和阴性
对照的根际活性有机磷含量均低于施植酸钠和不施
磷的处理; 同一处理之间, 转基因植株的根际活性
有机磷含量与阴性对照无显著差异 ; 不施磷处理 ,
转基因植株根际中等活性有机磷显著降低, 低于阴
性对照 28.2%, 施无机磷和有机磷的处理也分别降
低 18.2%和 16.2%, 但差异不显著; 转基因植株根际
中等活性有机磷含量在不施磷处理下显著低于施磷
处理。这表明, 转基因植株根系分泌的植酸酶对根
际活性有机磷影响不大, 对中等活性有机磷影响较
大, 其下降幅度明显。
2.5 转基因植株各生长指标测定
由表 1 可以看出, 无机磷处理条件下, 转基因
玉米的株高、干重、鲜重、叶长和叶宽与阴性对照
的均无显著差异; 植酸钠处理下, 转基因玉米的株
高、干重、鲜重、叶长和叶宽均显著高于阴性对照;
不施磷处理下, 转基因玉米除了叶宽与阴性对照无
显著性差异外, 株高、干重、鲜重和叶长都显著高
于阴性对照。植酸钠处理下, 转基因玉米株高与施
磷处理的没有显著差异 , 但显著高于不施磷处理 ;
转基因玉米鲜重、叶宽显著低于施磷处理, 但显著
高于不施磷处理; 转基因玉米干重和叶长与另外 2
个处理无显著差异。在施植酸钠和无磷条件下, 转
基因玉米株高是阴性对照的 1.7倍和 1.4倍, 鲜重是
阴性对照的 3.7 倍和 2.3 倍, 干重是阴性对照的 3.5
倍和 3.8 倍, 叶长是阴性对照的 1.5 倍和 1.4 倍, 叶
宽是阴性对照的 1.3倍和 1.1倍。这表明, 在施植酸
钠和不施磷的条件下, 转基因玉米生长状况显著好
于阴性对照。
2.6 转基因玉米磷含量以及磷积累量变化
由图 5 可以看出, 同一施磷处理, 转基因玉米
磷含量显著低于阴性对照, 施无机磷处理的转基因
玉米和阴性对照磷含量分别显著高于施植酸钠和不
施磷的处理; 施无机磷处理中, 2个材料磷积累量无
显著差异, 施植酸钠和不施磷处理的转基因玉米磷


图4 玉米根际土壤有机磷含量
Fig. 4 Soil organic phosphorus content in maize rhizosphere
柱上不同小写字母代表处理间差异达5%显著水平。−P: 不施磷; +Pi: 施无机磷; +phy:施植酸钠。GM: 转基因玉米; CK: 阴性对照。
Different letters above the bars indicate significant difference between treatments at P< 0.05. −P: no P; +Pi: KH2PO4; +phy: phytate.
GM: transgenic maize; CK: negative control.

表1 玉米植株生长指标
Table 1 Plant growth parameters
处理
Treatment
株高
Plant height (cm)
鲜重
Fresh weight (g)
干重
Dry weight (g)
叶长
Leaf length (cm)
叶宽
Leaf width (cm)
GM 85.67±3.21 b 48.82±3.55 c 12.20±2.30 bc 56.3±4.9 ab 2.4±0.1 c −P
CK 60.33±2.52 c 20.77±1.49 d 3.16±0.17 d 40.0±7.7 c 2.1±0.2 c
GM 108.67±4.73 a 94.55±12.86 a 23.44±5.71 a 67.3±2.2 a 3.9±0.3 a +Pi
CK 99.33±5.86 ab 80.56±2.52 ab 16.16±1.29 ab 63.3±5.6 a 3.7±0.1 a
GM 102.00±8.66 a 71.32±10.51 b 15.77±4.78 ab 64.5±2.1 a 2.9±0.1 b +phy
CK 61.33±5.51 c 19.18±5.87 d 4.50±2.29 cd 43.3±7.0 bc 2.3±0.3 c
同一列标以不同字母的值差异达5%显著水平。−P: 不施磷; +Pi: 施无机磷; +phy:施植酸钠。GM: 转基因玉米; CK: 阴性对照。
Values within a same column followed by different letters are significantly different at P <0.05. −P: no P; +Pi: KH2PO4; +phy: phytate.
GM: transgenic maize; CK: negative control.
1364 作 物 学 报 第 39卷


图5 玉米植株磷含量与磷累积量
Fig. 5 Phosphorus content and the phosphorus accumulation in maize plant
柱上不同小写字母代表处理间差异达5%显著水平。−P: 不施磷; +Pi: 施无机磷; +phy:施植酸钠。GM: 转基因玉米; CK: 阴性对照。
Different letters above the bars indicate significant difference between treatments at P< 0.05. −P: no P; +Pi: KH2PO4; +phy: phytate.
GM: transgenic maize; CK: negative control.

积累量均显著高于阴性对照, 分别高 140%和 100%。
土壤无机磷充足的条件下, 转基因玉米提高植株磷
积累量的效果不明显 , 施植酸钠或者低磷条件下 ,
转基因玉米提高植株磷积累量的效果才明显。
3 讨论
玉米几乎不能利用土壤中大量存在的有机态磷,
有机态磷中一半左右是植酸态磷。通过基因工程的
方法, 提高玉米本身对植酸态磷的吸收利用, 对于
减少磷肥施用、提高玉米产量、降低环境污染都起
到重要作用。本研究表明, 转 phyA2 基因玉米纯合
系能有效利用土壤中的有机磷, 植株中磷积累量显
著增加。这与转 phy 基因烟草、棉花和油菜研究结
果一致。
玉米大喇叭口期到抽雄期是其从营养生长转向
生殖生长的过渡时期, 是玉米吸收磷素的最大效率
期 , 玉米需要磷素的绝对数量和相对数量都最大 ,
吸收速度也最快, 这个时期不同玉米根际分泌植酸
酶量不同, 取样更具有代表性。玉米根系向外分泌
植酸酶的多少 , 直接影响根际土壤中磷酸酶的活
性。phyA2基因为组成型表达, 且在整个生长过程中
能持续表达植酸酶, 并向根外分泌。本试验表明, 施
植酸钠或者低磷条件下, 转基因玉米提高根际土壤
磷酸酶活性的效果明显; 而土壤无机磷充足时, 转
基因玉米提高根际土壤磷酸酶活性的效果不明显 ,
这可能是因为磷充足条件下酶的活性受到抑制。根
际磷酸酶活性的变化必然影响根际有机磷组分的变
化。有研究表明, 植物根际有机磷的亏缺量与磷酸
酶活性密切相关, 根际磷酸酶活性越强, 有机磷的
亏缺越多[20]。本研究表明, 同一处理下, 转基因玉米
根际土壤活性有机磷与阴性对照差异不明显, 而中
等活性有机磷均比阴性对照降低。不施磷处理下 ,
转基因玉米根际中等活性有机磷比阴性对照显著降
低, 这是因为转基因玉米分泌的植酸酶增加了对土
壤有机磷的活化, 造成中等活性有机磷的亏缺。施
植酸钠处理的转基因玉米根际土壤中等活性有机磷
较阴性对照出现亏缺, 但差异不明显, 可能是因为
加入植酸磷使得中等活性有机磷得到一定的补充。
施植酸钠和不施磷条件下, 转基因玉米根际土壤速
效磷比阴性对照显著降低。根据李比希的养分归还
学说, 作物以不同方式从土壤中吸收养分, 土壤中
养分就会减少, 如果通过施肥使之归还, 就能维持
土壤养分平衡。本研究是在缺磷土壤中进行的, 转
基因玉米吸收利用了土壤中的更多的速效磷, 即使
有机磷向无机磷转化, 但利用大于转化, 因此造成
根际土壤速效磷的降低。
磷是细胞质和细胞核的主要成分之一, 直接参
与植株体内糖蛋白质和脂肪等代谢, 供磷不足就会
影响植株的正常生长发育。施无机磷条件下, 转基
因玉米和阴性对照都能正常生长, 各生长指标之间
并没有显著差异。阴性对照在施植酸钠和无磷条件
下, 生长受到严重阻碍, 植株矮小, 叶片伸展短, 转
基因玉米各指标显著好于阴性对照。这表明, 在速
效磷供应不足的情况下, 转基因玉米能高效利用土
壤有机态磷进行生长。
Gerloff等[21]认为磷高效基因型总是能够以最低
的磷浓度进行正常的代谢。Elliot等[22]研究玉米时也
发现磷高效品种能以较低的磷浓度生长发育, 产生
较多经济产量。本实验表明, 不同磷处理下, 转基因
玉米磷含量均显著低于阴性对照, 转基因玉米能高
第 8期 侯文通等: 遗传转化的黑曲霉植酸酶基因(phyA2)对玉米利用土壤有机磷能力的影响 1365


效利用土壤中的有机磷, 这与上述研究结果是一致
的。施无机磷条件下, 转基因玉米与阴性对照磷积
累量差异不明显, 但是在施植酸钠和不施磷条件下,
转基因玉米磷积累量显著高于阴性对照。有研究表
明, 以植酸钠作为磷源时, 大豆的吸磷量与其根系
分泌酸性磷酸酶活性之间呈显著正相关[23]。本研究
结果与其也是一致的。
4 结论
与对照相比 , 在施用植酸钠和不施磷条件下 ,
转 phyA2 基因玉米根际土壤的磷酸酶活性提高, 根
际中等活性有机磷降低 , 植株磷积累量增加显著 ,
各生长指标都明显好于阴性对照。说明遗传转化的
黑曲霉植酸酶基因能提高玉米利用土壤有机磷的能
力, 增加玉米体内磷的积累, 改善玉米的生长状况。
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