全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(9): 13611371 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家农业部公益性行业(农业)科研专项(201403064), 国家自然科学基金项目(31360190)和国家现代农业产业技术体系建设专
项(CARS-22)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 余茂德, E-mail: yumd@163.com, Tel: 023-68250191
第一作者联系方式: E-mail: swuwxhong@163.com
Received(收稿日期): 2015-01-25; Accepted(接受日期): 2015-05-04; Published online(网络出版日期): 2015-06-03.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150603.0901.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01361
桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因MaPGIP1的克隆及功能分析
王晓红 1,2 朱攀攀 1 梁燕梅 1 韩淑梅 1 赵爱春 1 王传宏 1
鲁 成 1 余茂德 1,*
1 西南大学生物技术学院, 重庆 400716; 2 贵州省蚕业研究所, 贵州贵阳 550006
摘 要: 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种特异性结合和抑制真菌内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)活性的细
胞壁结合蛋白。采用 RT-PCR从嘉陵 40 (Morus atropurpurea Roxb.)果实中扩增 PGIP基因 cDNA, 利用生物信息学的
方法分析其编码蛋白的结构和功能。结果表明, 嘉陵 40PGIP 开放阅读框全长 1017 bp, 编码 338 个氨基酸残基, 被
命名为 MaPGIP1。MaPGIP1蛋白分子量 37.9 kD, 等电点为为 6.65, 信号肽为 N端 26个氨基酸残基, 具有 4个潜在
的N-糖基化位点。MaPGIP1蛋白的核心区域由 9个串联的 LRRs基序组成。原核表达产物经 SDS-PAGE分析, MaPGIP1
蛋白以包涵体形式出现, Western blot证实了重组蛋白的特异性, 经过Ni-NTA柱纯化和分步透析复性后获得可溶性蛋
白, 该蛋白能部分抑制果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana) PG (CsPG)活性, 其最适 pH值为 4.5~5.0, 最适温度 30
℃。抑菌试验结果表明, MaPGIP1蛋白在果桑肥大性菌核病菌菌丝侵染油菜叶片过程中具有一定的抑制效果。
关键词: 桑树; 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白; 序列分析; 原核表达; 蛋白活性
Molecular Cloning and Functional Analysis of Polygalacturonase-Inhibiting
Protein Gene MaPGIP1 from Mulberry (Morus atropurpurea Roxb.)
WANG Xiao-Hong1,2, ZHU Pan-Pan1, LIANG Yan-Mei, HAN Shu-Mei1, ZHAO Ai-Chun1, WANG
Chuan-Hong1, LU Cheng1, and YU Mao-De1,*
1 College of Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2 Guizhou Sericultural Research Institute, Guiyang 550006, China
Abstract: Polygalacturonase-inhibiting protein (PGIP) is a defense protein found in plant cell wall. It is involved in plant defense
against infection of pathogens by modulating/inhibiting the activity of endo-polygalacturonase. In this test, a pair of specific
primers were designed based on PGIP genes of mulberry (Morus notabilis) in Morus Genome Database. The cDNA of Jialing 40
PGIP gene was amplified from fruit by RT-PCR. The sequences of mulberry PGIP, physic-chemical parameters of PGIP protein
and phylogenetic relationship were analyzed by bioinformatics softwares. Using pET-28a(+) as a fused expression vector, a re-
combinant plasmid pET28a-PGIP containing the mature peptide of PGIP was constructed. Then its expression was induced in
Escherichia coli BL21 (DE3) with IPTG. The samples induced at different times were collected and SDS-PAGE was used to ana-
lyze the protein expression in E. coli BL21 (DE3). After purification of the protein by Ni-Hind affinity column and Western blot,
the PGIP gene expressed in E. coli BL21 (DE3). Finally its enzymatic activity was tested by bacteriostatic experiment. The
full-length cDNA of PGIP from Jialing 40 fruit was obtained. Sequence analysis showed that the fragment contains an open read-
ing frame of 1017 bp encoding 338 amino acid residues with a molecular mass of 37.9 kD, named MaPGIP1. This deduced pro-
tein has a pI of 6.65, a hydrophobic region of 26 amino acid residues in the N-terminal which was considered to be a signal pep-
tide, with four potential N-glycosylation sites, and it center LRR structural domain is composed of nine tandem LRR motifs. Phy-
logenetic tree showed that Jialing 40 had the closest evolutionary relationship with M. notabilis. The prokaryotic expression re-
sults showed that efficient expression of PGIP protein could be realized after induction with 0.5 mmol L–1 IPTG in E. coli BL21
(DE3) for five hours at 28 °C. The SDS-PAGE displayed that the recombinant proteins only appeared as inclusion bodies. The
inclusion bodies protein was purified by Ni-NTP affinity column and confirmed by Western blot. Soluble product could be re-
folded though stepwise dialysis strategies. The recombinant protein concentration was 0.58 μg μL–1 tested by Bradford method.
1362 作 物 学 报 第 41卷
MaPGIP1 partially inhibited CsPG with an optimum pH between 4.5 and 5.0, and an optimum temperature of 30°C. The prelimi-
nary infection experiment result showed that MaPGIP1 protein after renaturation had a certain inhibiting effect on Hypertrophy
Sorosis Sclerotenisis infected by Ciboria shiraiana.
Keywords: Mulberry; PGIP; Sequence analysis; Prokaryotic expression; Protein activity
细胞壁是植物寄主细胞抵御病原真菌入侵的第
一道防线。病原真菌侵染植物时能分泌多种水解细
胞壁的酶 , 如多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,
PG)、果胶甲基酯酶(pectin methylesterase, PME)、果
胶裂解酶(pectate lyase)[1]。其中多聚半乳糖醛酸酶可
以降解植物细胞壁中的果胶, 破坏细胞的完整性, 为
病原菌的生长和发育提供大量的营养物质[2-3]。植物
在抵御病原菌的进化中, 逐步形成了一系列自卫防
御机制 , 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 (polyga-
lacturonase inhibiting protein, PGIP)便是其中之一。
PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内切PG活性的
细胞壁结合蛋白, 富含抗病基因所具有的亮氨酸重
复序列(leucine-rich repeat, LRR), 属于LRR蛋白超
家族, 是一种重要的植物防御蛋白。PGIP具专一性、
可逆地与真菌多聚半乳糖酶结合, 竞争性抑制病原
菌PG酶的活性, 可阻断病原菌的侵染和抑制相应病
害的发生[1,4]。此外, PGIP在与PG的相互作用中使植
物细胞壁能形成有生物活性的寡聚半乳糖醛酸
(oligogalacturonide, OG), 有效地激活植物体内的防
御系统, 从而诱导植物的抗病性响应, 使植物获得
系统抗病性[5]。在植物免疫方面, PG-PGIP的互作方
式已成为蛋白质识别的模式系统[6]。另有报道, PGIP
还与花粉发育[7]、花的发育[8]、种子萌发[9]、胁迫反
应、果实冷藏和果实的病虫害响应有关 [10]。因而 ,
PGIP的研究已成为抗病基因工程和果实耐贮藏基
因工程研究的热点。目前, 国内外的研究者已经从
高山离子芥[11]、苹果[12]、番石榴[13]、马铃薯[14]、香
瓜[15]、梨[16]、扁桃[17]等植物中克隆了PGIP基因。
本研究从桑树基因组信息入手, 克隆了桑树的
PGIP基因, 并对该基因的生物功能进行了初步研究,
为果桑的抗病分子育种提供了新思路。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选取重庆市审定的果桑(Morus atropurpurea Roxb.)
品种嘉陵40的果实 , 液氮速冻后–80℃冰箱保存备
用。油菜中双10由西南大学农学与生物科技学院提
供。果桑肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)由本实
验室分离、鉴定并保存, 其中国典型培养物保藏中
心编号为CCTCC AF 2014019。大肠杆菌菌株DH5α、
BL21(DE3)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
pET28a(+)载体为本实验室保存 , T/A 克隆载体
pMD19-T simple vector 购自宝生物工程(大连)有限
公司。
T4 DNA连接酶、限制性内切酶 BamH I、Not I、
Taq DNA 聚合酶、RNAiso Plus 试剂盒、反转录酶
M-MLV、蛋白质 Maker 均购自宝生物工程(大连)有
限公司 ; 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自
Omega 公司; 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司
合成; 鼠抗 His·Tag 单克隆抗体(一抗)、辣根过氧化
物酶(HRP)标记羊抗鼠 IgG (二抗)、Ni-NTA 亲和树
脂购自南京金斯瑞生物科技有限公司。牛血清白蛋
白(BSA)购自生工生物工程有限公司 ; 其他试剂均
为国产分析纯。
1.2 总 RNA的提取及 MaPGIP1基因的克隆
取100 mg桑椹于预冷的研钵中加液氮迅速研磨
成粉末状, 参照TaKaRa公司RNA抽提试剂盒说明书
提取总RNA, 最后用50 μL DEPC水溶解RNA, 0.8%
琼脂糖变性凝胶电泳检测, 微量紫外分光光度计测
定浓度。以总RNA为模板, 以Oligod(T)18为引物, 利
用M-MLV反转录酶合成cDNA第1链, –80℃保存备
用。根据在川桑基因组数据库(http://morus.swu.edu.
cn/morusdb/)中检索到的PGIP基因序列设计了1对特
异性引物 (MaPGIP-CF: 5-ATGGACGATCGAAAG
CAGATC-3, MaPGIP-CR: 5-CTATTTACAACTTTC
CATGAGC-3)。以第1链cDNA为模板进行PCR扩增,
反应程序为94℃预变性4 min; 94℃变性45 s, 50℃退
火45 s, 72℃延伸60 s, 35个循环; 结束后72℃延伸10
min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 紫外灯
下切下目的条带, 用Omega胶回收试剂盒回收。回收
产物与pMD 19-T simple vector载体连接并转化大肠
杆菌 DH5α感受态细胞, 随机挑取抗性克隆, 菌液
PCR检测阳性单克隆送南京金斯瑞生物科技有限公
司测序。
1.3 MaPGIP1基因及编码蛋白质结构分析
将克隆得到的片段用Sequencher4.2软件拼接 ,
获得MaPGIP1的cDNA全长序列 , 使用ExPasy在线
工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)预
第 9期 王晓红等: 桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因 MaPGIP1的克隆及功能分析 1363
测PGIP编码氨基酸的基本理化性质, 使用ProtScale
(http://web.expasy.org/protscale/)分析亲水性与疏水
性 , SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测蛋
白质信号肽和亚细胞定位 , NetNGlyc (http://www.
cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测蛋白质糖基化位
点。在SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)上预
测蛋白质结构域 , 利用软件SWISS-MODEL Auto-
mated Mode (http://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白
的三维结构 , 并用软件 Swiss-PdbViewer (http://
spdbv.vital-it.ch/)展示获得的三维结构。将预测的氨
基酸序列与川桑(Morus notabilis)、拟南芥(Arabidopsis
thaliana)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、中国李(Prunus
salicina) 4种植物的PGIP编码的氨基酸序列进行多
重比对。利用MEGA5.2软件的邻近结合法(neighbor-
joining, NJ)构建 PGIP蛋白分子系统发育树 , 设
BootStrap值为1000。
1.4 MaPGIP1 基因原核表达载体的构建及在大
肠杆菌中的表达
预测信号肽切割位点后, 将桑树 PGIP 基因成
熟肽 cDNA 片段克隆到表达载体 pET28a(+)中构建
融合表达载体, 其过程为, 根据所克隆的 PGIP的序
列以及原核表达载体 pET28a(+)多克隆位点序列 ,
设计 1对引物 PGIP-BF: 5-CGGGATCCGAGCTCTG
CCATCCCCAAGAC-3, (下画线处为 BamH I酶切位
点)和 PGIP-NR: 5-GAATGCGGCCGCTCTATTTAC
AACTTTCCATGAGCG-3(下画线处为 Not I 酶切位
点)。用BamH I和Not I双酶切 PCR产物和 pET28a(+)
质粒, 分别回收目的片段, 二者经 T4 DNA 连接酶
连接后转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 随机挑取
抗性克隆, 然后将 PCR 及双酶切鉴定后的阳性克隆
送南京金斯瑞生物科技有限公司测序, 将测序正确
的重组表达载体命名为 pET28a-PGIP。MaPGIP1蛋
白的表达与检测参考李镇刚等[18]的方法。
1.5 融合蛋白的分离纯化及Western blot检测
将 0.5 mmol L–1 IPTG在 28℃下诱导表达量最高
时段收集的大肠杆菌 BL21菌液超声波破碎, 4℃、
13 000×g离心 10 min, 分别收集上清与沉淀(即包涵
体), 用适量 8 mol L–1 尿素溶解沉淀过夜, 4℃、
13 000×g离心 10 min, 收集上清液。采用 Ni-NTA亲
和层析柱将超声波破碎的上清液和包涵体溶液中的
表达蛋白分离纯化 , 参照金斯瑞蛋白纯化试剂盒
(Cat No. L00250)操作。取等量纯化样品进行
SDS-PAGE 电泳检测。然后将蛋白从 SDS-PAGE 胶
上转移到 NC 膜上, 用封闭液(TBST+5%脱脂奶粉)
4 ℃封闭过夜; 随后与鼠抗 6×His单克隆抗体室温孵
育 90 min, 以 TBST缓冲液清洗 3次; 加入 TBST缓
冲液稀释过的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗, 室
温反应 1 h, 以 TBST缓冲液清洗 3次; 将等体积的
ECL显色液 A和 B混匀后滴在 NC膜上, 避光显色
5 min, 于成像系统上曝光 2 min, 照相记录。
1.6 MaPGIP1蛋白的复性与检测
收集上述含有目的蛋白的流出液, 加入一定体
积的复性缓冲液(50 mmol L–1 Tris-HCl, 2 mmol L–1
还原型谷胱甘肽, 0.5 mmol L–1氧化型谷胱甘肽, 5%
甘油, pH 8.0), 4℃过夜后装入合适的透析袋中密封,
用透析缓冲液(PBS, 含 10%甘油, 5 mmol L–1 β-巯基
乙醇, 8、4、2、1、0.5、0 mol L–1尿素, pH 8.0) 4℃
下透析进行蛋白质复性。每种尿素浓度透析 3次, 每
次处理 8 h。最后将透析袋放入缓冲液 A (10 mmol
L–1 Tris-HCl, 1 mmol L–1 EDTA, 2 mmol L–1 β-巯基乙
醇, 10%甘油, pH 8.0)中 4℃下透析 24 h。然后低温冷
冻干燥浓缩蛋白液到 1 mL 左右。采用 Bradford 法
测定重组蛋白浓度。
1.7 MaPGIP1蛋白活性测定
按皇甫海燕 [19]的方法制作 D-半乳糖醛酸标准
曲线。参考周立等[20]的方法制备果桑肥大性菌核病
菌 PG 酶(CsPG): 将 PDA 固体培养基上生长的果桑
肥大性菌核病菌菌丝块接种到 Czapek-Dox 液体培
养基(0.5%果胶代替蔗糖), 25℃, 150转 min–1振荡培
养 5 d, 然后抽提得到滤液, 4500×g离心 30 min, 取
上清液 , millipore 超滤管浓缩菌液 , 制备浓缩的
CsPG。因 PGIP 具有抑制 PG 分解多聚半乳糖醛酸
生成D-半乳糖醛酸的特性, 取 0.5%多聚半乳糖醛酸
溶液(用 100 mmol L–1 NaAc-HAc, pH 5.0缓冲液配制)
300 μL, 加 CsPG 50 μL、不同量的 MaPGIP1蛋白,
用 100 mmol L–1 NaAc缓冲液补齐 1 mL, 30℃水浴
1 h。然后加入 1 mL DNS试剂, 沸水浴 5 min, 冷却
后用水稀释至 5 mL, 在紫外分光光度计 540 nm波长
下比色, 以不加 MaPGIP1 蛋白作对照, 记录其 OD
值。平行测定 3次取其平均值在标准曲线上查出反应
液中相当于 D-半乳糖醛酸的毫克数。定义 MaPGIP1
的活力单位为 30℃和 pH 5.0的条件下, 与对照相比,
每分钟酶促反应减少 1 μg当量半乳糖醛酸的量。
1.8 最适 pH值及酸碱稳定性的测定
在 30℃的测活体系下 , 用不同 pH 值的 100
mmol L–1 NaAc-HAc缓冲液配制 0.5%的多聚半乳糖
1364 作 物 学 报 第 41卷
醛酸溶液, 取 300 μL底物, 加入 100 μL的MaPGIP1
蛋白液, 50 μL CsPG酶, 用对应的缓冲液补齐 1 mL,
以不加 MaPGIP1 蛋白液为对照, 测定 MaPGIP1 对
CsPG 的抑制作用 , 确定其最适 pH 值。4℃下将
MaPGIP1酶液在不同 pH值缓冲液中处理 12 h, 然后
在 30℃、pH 5.0的条件下检测MaPGIP1蛋白对CsPG
的抑制作用, 分析其 pH稳定性。试验数据为平行测
定 3次的平均值。
1.9 最适温度及热稳定性的测定
反应体系同上, 在 pH 5.0 的条件下, 测定不同
温度(20~80℃)下MaPGIP1酶促反应速度, 确定其最
适温度。将 MaPGIP1 在不同温度(20~100℃)热处理
30 min, 迅速冷却至室温, 在最适的测活体系(30℃,
pH 5.0)中检测 MaPGIP1 蛋白对 CsPG 酶的抑制作
用, 分析其热稳定性。试验数据为平行测定 3 次的
平均值。
1.10 MaPGIP1 蛋白对油菜菌核病菌丝侵染油
菜叶片的抑制作用
按皇甫海燕[19]的方法, 待油菜长到 6~8 片真叶
时 , 取若干生长一致的油菜叶片 , 表面消毒后 , 用
灭菌的牙签轻轻刺伤表面, 然后在受伤部位依次滴
加 50 μL的灭菌水、PBS缓冲液、MaPGIP1蛋白液,
每个处理重复 3 次, 然后将直径大约为 5 mm 带有
PDA的果桑肥大性菌核病菌丝块反贴在油菜叶片处
理处, 置灭菌培养皿中, 移入培养箱(25℃恒温, 12 h
光照, 12 h黑暗, 光照度 300 µmol m–2 s–1, 相对湿度
90%), 逐日观察 3 d 叶片被侵染的情况并统计病斑
直径。
2 结果与分析
2.1 MaPGIP1 序列的获得与编码蛋白基本理化
性质
以嘉陵40果实总 RNA为模板, 通过 RT-PCR扩
增 , 获得大约1000 bp 的条带。将该片段克隆到
pMD19-T simple vector 载体上, 经测序表明, 该序
列全长1017 bp, 含一个开放阅读框(ORF), 编码一
个由338个氨基酸残基组成的蛋白质(图1)。在线软件
预测该蛋白质的分子量为37.9 kD, 理论等电点为
6.65, 分子式为 C1717H2650N442O495S14, 酸性氨基酸
(Asp+Glu)占 9.8%, 碱性氨基酸 (Lys+Arg)占 9.5%,
亮氨酸比例最高(13.3%); 不稳定系数为38.71, 说明
该蛋白为稳定蛋白。将该 cDNA 及其推导的氨基酸
序列在 NCBI 网站上进行 Blast 比对, 表明该 cDNA
及其推导的氨基酸序列与已报道的 PGIP 基因及其
推导的氨基酸的序列同源性最高。分析结果表明 ,
所克隆片段为桑树的 PGIP 基因, 命名为 MaPGIP1,
并提交给 GenBank, 登录号为 KJ704112。蛋白质疏
水性分析表明, 该蛋白 N 端有一明显的疏水区, 采
用神经网络方法预测蛋白质信号肽表明, MaPGIP1
信号肽为 N 端的26个氨基酸残基, 这与疏水性分析
结果相一致。序列分析结果还表明, MaPGIP1成熟肽
氨基酸序列中具有4个潜在的 N-糖基化位点, N端和
C 端各有4个参与二硫键形成的半胱氨酸残基, 亚细
胞定位分析表明, 该蛋白属于胞外蛋白。MaPGIP1
三级结构预测结果表明, 由 MaPGIP1肽链构建的三
维模型(图2左)含10个 α-螺旋和20个 β-折叠, 主体结
构由9个串联的 LRRs 基序组成; MaPGIP1氨基酸序
列从第 76个氨基酸开始的 LRRs 基序均具有
“LxxLxLxxNxLS/TGxIPxxLxxL” (x代表任意氨基酸
残基)这样的共有序列, 除个别替换、插入或缺失外,
序列高度保守(图2-右)。
2.2 MaPGIP1 编码氨基酸序列比对及分子进化
关系
MaPGIP1编码氨基酸序列多重比对结果 (图3)
表明, MaPGIP1与川桑 PGIP 蛋白同源性最高, 一致
性达84%, 与菜豆、拟南芥和中国李 PGIP蛋白同源
性只有50%~65%。4条氨基酸序列都含有位点十分
保守的8个半胱氨酸残基。选用 GenBank 中已登录
的11个物种的17条氨基酸序列绘制同源进化树(图
4)。结果表明, MaPGIP1与川桑 PGIP具有较近的亲
缘关系; 与豆科植物 PGIP蛋白关系较远。同属一科
的植物聚为一类, 不同科的植物 PGIP蛋白进化上形
成不同分支。
2.3 MaPGIP1 原核表达载体的构建和重组子鉴
定
利用 BamH I 和 Not I 对重组子 pET28a-PGIP
和 pET28a(+)分别进行双酶切鉴定, 酶切产物用 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测, 结果 pET28a(+)仅在 5300
bp 处出现一条亮带 , 而 pET28a-PGIP 则分别在
5300 bp和 1000 bp处出现 2条亮带。此外, 重组质
粒的测序结果与克隆序列完全一致, 开放阅读框正
确 , 表明 MaPGIP1 基因原核表达载体 pET28a-
PGIP构建成功。
2.4 MaPGIP1在大肠杆菌 BL21中的表达
将酶切鉴定和测序后的重组质粒 pET28a-
PGIP转化大肠杆菌 BL21 (DE3), 经 0.5 mmol L–1
第 9期 王晓红等: 桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因 MaPGIP1的克隆及功能分析 1365
IPTG诱导表达后进行 SDS-PAGE分析(图 5)。融合
蛋白在 28℃条件诱导产生了一条约 38 kD 蛋白条
带, 与理论分子质量一致。28℃、200 转 min–1 的
诱导条件下, 目的蛋白 2 h 后即高效表达且 5 h 后
表达量最高。
2.5 融合蛋白的纯化及Western blot检测
诱导后大肠杆菌 BL21(DE3)菌液超声波破碎后,
经 SDS-PAGE 分别检测上清液和沉淀, 结果表明,
目的蛋白主要以包涵体的形式存在, 即该融合蛋白
为不可溶。随即用 8 mol L–1尿素溶解沉淀, 离心后
图 1 MaPGIP1 cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of MaPGIP1 cDNA
单下画线为信号肽; ATG 为起始密码子; TAG 为终止密码子; 粗体“C”为参与二硫键形成的 Cys残基; 阴影部分为潜在的
N-糖基化位点。
Single underlines indicate the signal peptide; ATG indicates the start codon; TAG indicates the stop codon; the bold letters “C” indicate the
Cys residues contributing to the formation of disulfide bond; shaded areas indicate the potential N-glycosylation sites.
图 2 MaPGIP1三维结构预测图(左)及二级结构 LRRs基序(右)
Fig. 2 Schematic map of predicted MaPGIP1 three dimensional model (left) and secondary structure organization of the
LRRs motif (right)
β-折叠用灰色显示, α-螺旋用黑色表示。β-sheets are colored grey, α-helices are colored black.
1366 作 物 学 报 第 41卷
图 3 嘉陵 40与其他 4个不同物种 PGIP编码氨基酸序列多重比对
Fig. 3 Multiple alignment of the PGIP amino acid sequences of Jialing 40 and four other species
*表示 Cys残基。MaPGIP1: 嘉陵 40; MnPGIP: 川桑; AtPGIP1: 拟南芥; PvPGIP: 菜豆; PsPGIP: 中国李。
* indicates the Cys residues. MaPGIP1: Jialing 40 (Morus atropurpurea Roxb., AID61550.1); MnPGIP: Chuansang (Morus notabilis,
EXC30880.1); AtPGIP1: Arabidopsis thaliana (AED91076.1); PvPGIP: Phaseolus vulgaris (CAA46016.1); PsPGIP: Chinese plum (Prunus
salicina, ACY41032.1).
图 4 基于 NJ法构建的 PGIP氨基酸序列系统进化树
Fig. 4 Phylogenic tree of PGIP amino acid sequence constructed by Neighbor-Joining method
●代表获得的嘉陵 40PGIP基因的氨基酸序列。Pa: 美洲李; Ps: 中国李; Pm: 马哈利樱桃; Pp: 桃; Mh: 湖北海棠; Pu: 秋子梨;
Ma: 嘉陵 40桑; Mn: 川桑; At: 拟南芥; Pv: 菜豆; Gm: 大豆。
●Shows the position of amino acid sequence of PGIP gene from ‘Jialing 40’. Pa: Prunus americana; Ps: Prunus salicina;
Pm: Prunus mahaleb; Pp: Prunus persica; Mh: Malus hupehensis; Pu: Pyrus ussuriensis; Ma: Morus atropurpurea Roxb.;
Mn: Morus notabilis; At: Arabidopsis thaliana; Pv: Phaseolus vulgaris; Gm: Glycine max.
取上清液, 采用 Ni-NTA 亲和层析柱对表达蛋白进
行分离纯化。当用含 100 mmol L–1咪唑的洗脱冲洗
柱子时 , 少量目的蛋白能被洗脱 , 用含 250 mmol
L–1 咪唑的洗脱液可以把目的蛋白完全洗脱 (图
6-A)。进一步检测所表达的蛋白是否含有 6×His 表
达标签的融合蛋白, 以鼠抗 6×His 为一抗, 以辣根
过氧化酶标记的羊抗鼠为二抗 , 对表达产物的
Western blot印迹分析表明, 经 0.5 mmol L–1 IPTG诱
导 5 h产生的 38 kD的蛋白条带与抗体发生很强的
交叉反应, 进一步证明融合蛋白得到表达(图 6-B)。
第 9期 王晓红等: 桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因 MaPGIP1的克隆及功能分析 1367
图 5 重组 MaPGIP1蛋白表达产物 SDS-PAGE分析
Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the expressed product of recombinant MaPGIP1
箭头所指为目的蛋白条带; M: 蛋白分子量标准; 1: pET28a(+)空载诱导 6 h; 2~7: pET28a-PGIP 28℃诱导 0、2、3、4、5和 6 h。
Arrows indicate the target protein bands; M: protein molecular weight standard; 1: strains harbouring pET-28a(+) after induced for 6 hours;
2–7: total proteins of engineering bacteria strains after induction for 0, 2, 3, 4, 5, and 6 hours, respectively.
图 6 重组 MaPGIP1蛋白的纯化及 Western blot分析
Fig. 6 Purification and Western blot analysis of recombinant
MaPGIP1
A: 重组 MaPGIP1蛋白的纯化; M: 蛋白分子量标准;
1: pET28a(+)空载诱导 5 h总蛋白; 2: 咪唑浓度为 10 mmol L–1的
洗脱液; 3: 咪唑浓度为 100 mmol L–1的洗脱液; 4: 咪唑浓度为
250 mmol L–1的洗脱液。B: Western blot分析; M: 蛋白分子量标
准; 1: 6×His标签 Western blot。
A: purification of recombinant MaPGIP1; M: protein molecular
weight standard; 1: total proteins of strains harbouring pET-28a(+)
after induction for 5 hours; 2: sample from the eluted solution with
10 mmol L–1 imidazole; 3: sample from the eluted solution with 100
mmmol L–1 imidazole; 4: sample from the eluted solution with 250
mmol L–1 imidazole; B: Western blot analysis; M: protein molecular
weight standard; 1: 6×His Western blot.
2.6 MaPGIP1 蛋白的复性及对油菜菌核病菌丝
侵染油菜叶片的抑制效果
由于重组 MaPGIP1 蛋白全部存在于包涵体中,
因此, 只有通过复性才能获得有生物活性的蛋白。
收集经 Ni-NTA 亲和层析柱纯化的目的蛋白, 装入
透析袋中密封, 4℃下用透析缓冲液进行蛋白质复性,
经过分步透析后, 获得可溶性蛋白, 采用 Bradford
法测定重组蛋白浓度 , 标准曲线方程 y=20.442x–
7.5948 (R2=0.9988), 线性范围 0.2~0.8 μg。经计算,
复性的 MaPGIP1蛋白浓度为 0.58 μg μL–1。
抑菌试验的结果表明, 滴加灭菌水或 PBS 缓冲
液的叶片 , 接种菌丝后所产生的病斑面积比滴加
MaPGIP1 蛋白的叶片病斑面积要大, 并且前两者对
叶片的侵害程度也比后者严重(表 1和图 7)。说明果
桑肥大性菌核病菌在侵染油菜叶片的过程中, MaP-
GIP1蛋白对其有一定的抑制效果。
2.6 MaPGIP1蛋白对 CsPG的抑制作用
D-半乳糖醛酸标准曲线公式 y = 1.2871x –
0.0512 (R2 = 0.9998), 线性范围 0.1~0.8 mg。PG可以
降解多聚半乳糖醛酸生成 D-半乳糖醛酸 , 而
MaPGIP1 会抑制 PG 酶的活性, 从而影响到所生成
D-半乳糖醛酸的量 , 从图 8 可以看出 , 随着
MaPGIP1蛋白量的增加, CsPG降解多聚半乳糖醛酸
生成 D-半乳糖醛酸的量逐渐减少 , 当添加 20 μL
MaPGIP1 蛋白液时, 对 CsPG 酶的抑制率为 6.9%,
当添加 100 μL MaPGIP1蛋白液时, 对 CsPG酶的抑
表 1 MaPGIP1蛋白对肥大性菌核病菌侵染油菜叶片的抑制效果
Table 1 Inhibition effect of MaPGIP1 protein against infection by Ciboria shiraiana to rape leaves (mm)
病斑直径 Lesion diameter 处理
Treatment 24 h 48 h 72 h
H2O 7.16±0.35 a 19.88±0.73 a 28.61±0.57 a
PBS 6.95±0.52 a 19.72±0.67 a 26.97±1.00 a
MaPGIP1 4.93±0.25 b 9.88±0.51 b 16.04±0.49 b
表中数据为 3次重复取平均值, 同列中不同字母表示差异显著(P<0.05)。
Data are the means of three replicates. Values followed by different letters within columns are significantly different at P < 0.05.
1368 作 物 学 报 第 41卷
图 7 MaPGIP1蛋白抑制果桑肥大性菌核病菌丝侵染油菜叶片
情况
Fig. 7 Inhibition effects of MaPGIP1 protein against infection
by Ciboria shiraiana to rape leaves
A: 滴加无菌水 1~3 d感染情况; B: 滴加 PBS缓冲液 1~3 d感染
情况; C: 滴加 MaPGIP1蛋白 1~3 d感染情况。
A: infection status of 1–3 days after dropping sterile water, B: in-
fection status of 1–3 days after dropping PBS buffer, C: infection
status of 1–3 days after dropping MaPGIP1.
图 8 MaPGIP1蛋白量对 CsPG的抑制
Fig. 8 Inhibition effects of MaPGIP1 on CsPG
制率为 44%, 充分说明 MaPGIP1蛋白对 CsPG有一
定的抑制作用, 当添加 MaPGIP1蛋白液为 120、150
和 200 μL 时, 对 CsPG 酶的抑制率分别为 45.4%、
46.0%和 47.0%, CsPG酶活性并没有被完全抑制, 推
测可能是由于MaPGIP1缺乏糖基化修饰而不能完全
表现该蛋白活性, 并且进一步增加 MaPGIP1 蛋白
液, CsPG酶的活性并没有出现明显下降, 因此, 取100
μL MaPGIP1蛋白液进行下一步试验是比较适宜的。
2.7 MaPGIP1蛋白特征分析
在 pH值在 3.5~6.5范围内, 重组MaPGIP1蛋白
对 CsPG酶都具有一定的抑制作用, 随 pH值增大呈
上升趋势, 在 pH 5.0时达到高峰, 之后随 pH值增大
呈下降趋势, 并且在 pH 4.5~5.0之间, MaPGIP1蛋白
对 CsPG 酶抑制作用最强 , 抑制率达到 44.9%~
46.3%; 而 pH为 3.5或 6.5时, MaPGIP1蛋白抑制能
力迅速下降 , 分别为 13.7%和 13.9%; 由此表明 ,
MaPGIP1蛋白的最适 pH可能在 4.5~5.0之间(图 9-A)。
在 pH 值在 4.0~6.0 范围内, MaPGIP1 蛋白能抑制
CsPG酶 32.6%~45.5%的活力; 当 pH > 7或 pH <3时,
MaPGIP1 蛋白的活力迅速降低, 几乎丧失, 说明该
蛋白不耐酸碱(图 9-B)。如图 9-C所示, MaPGIP1蛋
白在低温情况下随温度的增加对 CsPG 酶的抑制能
力逐渐增强, 至 30℃抑制能力达到最高, CsPG酶活
力下降了 46%, 之后随着温度的上升蛋白活力开始
下降, 80℃时, CsPG酶几乎失去活性, 无法准确测定
MaPGIP1 蛋白活性。当 MaPGIP1 蛋白在低温(20~
30℃)处理 30 min 后, 对 CsPG 酶的抑制能力略有下
降, 40℃处理后, 其抑制能力为 38%, 50~70℃ MaP-
GIP1蛋白活力迅速下降, 抑制能力从 30%降到 3%, 在
80℃及更高温度, MaPGIP1蛋白活力已经丧失(图 9-D)。
3 讨论
本研究从果桑嘉陵 40果实中克隆到一条长 1017
bp、包含完整开放阅读框的 cDNA 序列, 同桃、中
国李、梅的 PGIP 基因同源性为 64%~67%, 氨基酸
序列分析显示其具有 PGIP 蛋白典型的 LRR 重复序
列, 符合 LRR 蛋白家族特征。确定为桑树的 PGIP
基因 , 命名为 M a P G I P 1 , G e n B a n k 登录号为
KJ704112。LRR 蛋白广泛存在于自然界中, 参与许
多重要的生命活动, 包括植物防御、信号传导、发
育、DNA修复和 RNA加工等[5,7-9]。PGIP属于高等
植物 LRR蛋白家族, 具有典型的 LRR结构。在植物
中大多数已知抗性基因的表达产物都是 LRR 蛋白,
具有“xxLxLxxLxxNxLxxGxIPxxLxxL”共有序列, 这
一结构由 β-折叠/β-转角/β-折叠/α-螺旋结构区域构成,
其主要功能可能是提供一个通用的蛋白质-蛋白质相
互作用的结构骨架, 被认为是参与蛋白质-蛋白质相互
作用的关键区域, PGIP正是通过LRR基序暴露于外表
面的氨基酸残基来抑制 PG 的活性[21-23]。如果暴露于
表面的某些氨基酸残基发生改变, 则会对 PGIP的活
性有重要的影响[24]。对嘉陵 40的MaPGIP1蛋白序列
预测分析发现, 该蛋白成熟肽 N端和 C端各有 4 个
第 9期 王晓红等: 桑树多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因 MaPGIP1的克隆及功能分析 1369
图 9 MaPGIP1蛋白对 CsPG抑制性分析
Fig. 9 Inhibition assay of MaPGIP1 on CsPG
A: 最适 pH; B: pH稳定性; C: 最适温度; D热稳定性。
A: optimum pH; B: pH stability; C: optimum temperature; D: temperature stability.
Cys残基, 可以形成 2对二硫键, 推测其对维持蛋白
质结构稳定和生物活性具有重要作用。在线软件预
测MaPGIP1有 4个潜在的 N-糖基化位点, 核心区域
由 9个 LRR基序串联组成, 都具有“LxxLxLxxNxLS/
TGxIPxxLxxL” 这一保守结构。从预测的 MaPGIP1
三级结构来看 , 它与菜豆 PGIP2 结构类似 [25], 但
MaPGIP1 缺少一个 LRR 基序, 这说明不同植物的
PGIP与 PG的相互识别具有一定的特异性。
PGIP 序列比对结果表明 , 本试验所克隆的
MaPGIP1与川桑 PGIP的氨基酸序列同源性为 84%,
与中国李和菜豆的氨基酸同源性分别为 65%和 50%,
表现出属内同源性高、属间相对较低的特点。在所
有 PGIP蛋白中, 半胱氨酸残基位点高度保守, 这反
映了该位点的半胱氨酸对 LRR蛋白生物功能具有十
分重要的作用。进化树分析结果也显示近缘属内距
离较近、远缘属间相对较远的特点。虽然不同植物
PGIP 蛋白之间的同源性不高, PGIP 蛋白功能多样,
但 LRR蛋白家族中保守氨基酸残基十分一致, 而且
二级结构也惊人地相似, 暗示 LRR基序在进化过程
中保持较高的选择压力[26]。Mattei 等[26]同时通过对
氨基酸序列比对发现, 所有已知的 LRR蛋白都具有
十分保守的序列模式, 双子叶植物 PGIP蛋白有 3个
保守的结构域, 即 LRR 区、N 端区和 C 端区, 本文
克隆的 MaPGIP1在 N端有 LC、DK、LL、IK等保
守的氨基酸残基, 中心结构由 9 个高度保守的 LRR
基序组成, C 端有 CLCGxPL 保守序列, 这与 Mattei
等[26]的研究报道一致。
利用原核表达系统是表达重组蛋白的一种重要
和有效的方法。原核表达系统简便、快速、高效, 然
而, 大肠杆菌中高效表达的重组蛋白往往导致包涵
体的产生, 虽然包涵体在分离纯化蛋白方面具有明
显的优势, 但将其从变性状态复性为有生物学活性
的产物仍是一大难题[27]。目前, 提高重组蛋白活性
和产量的方法主要有两个, 一是促进重组蛋白的可
溶性表达; 二是优化蛋白复性过程。包涵体的复性
方法主要有稀释复性、透析复性、超滤复性和柱上
复性等 , 而稀释法和透析法是最简单和常用的方
法。Nalumpang等[28]在大肠杆菌中表达柑橘PGIP基
因时, 表达产物主要以不溶的包涵体形式出现, 可
溶部分很少, 纯化效率也很低, 但将可溶部分用硫
酸铵沉淀后表现出对PG有部分抑制作用。本实验将
MaPGIP1 基因导入大肠杆菌诱导融合蛋白的表达,
1370 作 物 学 报 第 41卷
然后用高浓度尿素溶解表达产物, 通过Ni-NTA柱纯
化收集目的蛋白, 利用含有氧化还原系统的复性缓
冲液分步透析复性 , 最终获得了具有活性的蛋白 ,
这为原核表达包涵体蛋白的复性提供了有效的试验
方法。
PG 是病原菌重要的致病因子, 在寄生过程中,
病原菌分泌 PG 以降解细胞壁的多聚半乳糖醛酸。
由于能与病原菌 PG 相互作用, PGIP 蛋白成为植物
防御机制的重要组成部分, 这也为其在转基因育种
中的应用提供了可能性。Powell 等[29]将梨 PGIP 基
因导入番茄后, 可以显著抑制灰霉菌(Botrytis cine-
rea)在转基因植株叶片上的扩散 , 而且转基因植株
组织的腐烂速度也明显低于非转基因植株。杨丽华
等[30]将人参 PgPGIP1转入小麦, T0至 T4代转基因株
系对全蚀病与根腐病的抗性明显提高。也有研究表
明, PGIP 由小的基因家族编码, 不同成员对 PGs 的
识别具有特异性 , 不同物种甚至同一物种不同的
PGIP蛋白的抑菌效果存在差异[22,31], 所以, 转 PGIP
基因的植株可能不会表现对特定 PGs抑制。因此, 在
通过转 PGIP 基因进行植物抗病育种前有必要进行
体外抑菌试验。Prabhu等[32]将珍珠粟 Pglpgip1基因
转入大肠杆菌并获得了有活性的 PglPGIP1蛋白, 该
蛋白在 pH 4.0~4.5 时对 AnPGII 酶具有 26%的抑制
作用; 而来自棉花的 PGIP蛋白对黑曲霉和大丽轮枝
菌 PG 酶分别有 50%和 25%的抑制作用[33]; 但 Kemp
等[34]研究发现, 小麦 PGIP对黑曲霉和腐病菌 PG的
抑制性只有 5%。本研究以果桑肥大性菌核病菌为测
试菌株, 体外抑菌试验结果表明, MaPGIP1 对该菌
具有一定的抑制作用, 在 pH 4.5~5.0、30℃时, 抑制
作用最强, 能抑制 CsPG酶 45.5%的活力, 从这一试
验结果来看, MaPGIP1 可以用于作物抗病分子育种
的目的基因。
吕蕊花等[35]研究表明, 果桑肥大性菌核病菌和
油菜菌核病菌的子囊孢子能相互交叉传染果桑和油
菜。本实验也证实这一结论, 离体接菌表明 MaPGIP1
蛋白对该菌在侵染油菜前期有一定的抑制效果, 能
缓解油菜的发病症状。这也说明 MaPGIP1基因在桑
树体内行使一定的功能, 但植物抗病是一个复杂的
调控网络, MaPGIP1 在其中扮演怎样的角色, 如何
响应外界信号以及在桑树中的表达模式, 仍需进一
步研究。
4 结论
获得了桑树 PGIP 全长 cDNA 序列 , 命名为
MaPGIP1, 并成功实现了该基因编码蛋白在大肠杆
菌体内的高效表达。经过透析复性获得了可溶性蛋
白, 该蛋白对果桑肥大性菌核病菌前期侵染过程有
一定的抑制效果, 抑制的最适 pH值为 4.5~5.0, 最适
温度为 30℃。
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