全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(10): 14631471 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171575)和中国农业科学院科技创新工程(作物分子标记技术及其应用)项目资助。
 通讯作者(Corresponding authors): 李英慧, E-mail: liyinghui@caas.cn; 邱丽娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn
第一作者联系方式: E-mail: shixh_1988@163.com
Received(收稿日期): 2015-03-20; Accepted(接受日期): 2015-06-01; Published online(网络出版日期): 2015-6-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150629.1349.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01463
大豆胞囊线虫主效抗病基因 Rhg4 (GmSHMT)的 CAPS/dCAPS 标记开
发和利用
史学晖 1 李英慧 1,* 于佰双 2 郭 勇 1 王家军 2 邱丽娟 1,*
1 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部北京大豆生物学重点实验室 / 中国农业科学院作物科学研究所 , 北京
100081; 2黑龙江省农业科学院大豆研究所, 黑龙江哈尔滨 150086
摘 要: 大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode, SCN)严重危害世界大豆生产, Rhg4 (resistance to Heterodera glycines 4)
是控制大豆 SCN抗性的 2个主效位点之一。本研究针对 Rhg4 (GmSHMT)上的 2个单核苷酸多态性(single nucleotide
polymorphisms, SNP)位点开发了快速、经济、简便易行的 CAPS (Rhg4-389)和 dCAPS标记(Rhg4-1165), 并用开发的
2个标记鉴定了以大豆胞囊线虫应用核心种质为主的 193份代表性抗感种质。结果表明, Rhg4-389和 Rhg4-1165位点
间存在显著连锁不平衡(P=0.0001, r2=0.87), 可形成 4种单倍型。Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T和Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A
为优势单倍型, 稀有单倍型 Rhg4-389-G/Rhg4-1165-A和 Rhg4-389-C/Rhg4-1165-T是在中国抗源中新发现的单倍型。
结合 193份种质对 SCN 3号小种抗性鉴定分析发现, Rhg4-389-G和 Rhg4-1165-T主要存在于抗病种质, 它们形成的
单倍型对抗病种质鉴定效率可达 94.1%。本研究开发了可用于辅助大豆 SCN 抗性鉴定且方便育种家利用的
CAPS/dCAPS 标记, 且用其摸清了应用核心种质等重要抗源在 Rhg4 位点的“本底”, 为育种家有效利用这些优异抗源
提供了重要信息。
关键词: 大豆胞囊线虫; Rhg4; CAPS/dCAPS标记; 单倍型; 分子标记辅助选择
Development and Utilization of CAPS/dCAPS Markers Based on the SNPs
Lying in Soybean Cyst Nematode Resistant Genes Rhg4
SHI Xue-Hui1, LI Ying-Hui1,*, YU Bai-Shuang2, GUO Yong1, WANG Jia-Jun2, and QIU Li-Juan1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Soybean Biology in Beijing, Agriculture of Ministry /
Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 Soybean Research Institute, Heilongjiang Academy of
Agricultural Sciences, Harbin 150086, China
Abstract: Soybean cyst nematode (SCN, Heterodera glycines Ichinohe) is one of the most destructive diseases which largely
suppressed soybean production worldwide. Rhg4 was one of two major resistant loci for SCN. In this study two nonsynonymous
SNPs (Rhg4-389-G/C and Rhg4-1165-T/A) in GmSHMT were deduced to confer SCN resistance or susceptibility. One CAPS
marker (Rhg4-389) and one dCAPS marker (Rhg4-1165) with the advantages of rapid, economic, simple and easy way to use
were developed based on two nonsynonymous SNPs (Rhg4-389-G/C and Rhg4-1165-T/A), respectively. Then, a total of 193 soy-
bean cultivars mainly from SCN-applied-core collection were genotyped by markers Rhg4-389 and Rhg4-1165. Linkage disequi-
librium (LD) analysis indicated pairwise of Rhg4-389 and Rhg4-1165 was in significant LD (P-value = 0.0001) with r2 of 0.87.
Among four haplotypes detected in this panel, Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T and Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A were predominant;
while both Rhg4-389-G/Rhg4-1165-A and Rhg4-389-C/Rhg4-1165-T were rare, which only discovered in the resistant cultivars
from China. Rhg4-389-G and Rhg4-1165-T alleles mainly occurred in resistant cultivars, and almost coincided with Rhg4-389-G/
Rhg4-1165-T haplotype. Of 101 resistant cultivars with Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T haplotype, 94.1% (95) were resistant to SCN.
In this study, we not only developed convenient CAPS/dCAPS markers for marker assisted selection (MAS) breeding, but also
dissected the genetic architecture of Rhg4 locus among SCN-applied-core collection. Hopefully, this study will provide helpful
information for improving the utilization efficiency of resistant resources in soybean breeding.
1464 作 物 学 报 第 41卷


Keywords: Soybean cyst nematode; Rhg4; CAPS/dCAPS marker; Haplotype; Marker assisted selection
大豆胞囊线虫病(soybean cyst nematode, SCN)
是危害世界大豆(Glycine max L. Merr.)生产的严重
病害, 种植抗病品种、合理轮作非寄主作物是当前
防治该病最经济有效的措施[1]。我国是大豆起源地,
拥有丰富的抗源, 国际上广泛应用的抗源如 Peking
(PI 548402)、PI 88788、PI 437654等(http://www.soybase.
org/)皆来自我国。1986—1990 年, 大豆种质抗 SCN
鉴定协作组鉴定了我国 1 万余份大豆种质资源对大
豆胞囊线虫 1号、3号和 4号生理小种的抗性, 筛选
出一批免疫和高抗种质[2]。Ma 等[3]以此为基础, 根
据表型性状和 SSR 标记分析结果, 浓缩了国内外优
异抗源的遗传多样性, 构建了蕴含丰富抗病等位变
异的大豆胞囊线虫初选应用和应用核心种质。虽然
百余份抗病资源被鉴定出来, 但我国大豆生产上应
用的抗病品种仍然存在抗性单一、遗传基础狭窄的
问题, 其原因是绝大多数优异抗源的遗传基础尚不
清楚, 迄今只有北京小黑豆/哈尔滨小黑豆等少数抗
源用于育种和生产[4]。因此, 有必要阐明这些抗源的
分子遗传基础, 以促进抗源的有效利用。
大豆胞囊线虫病是由多基因控制的复杂数量性
状, rhg1和 Rhg4 (resistance to Heterodera glycines 1
and 4)抗性基因是控制大豆胞囊线虫病抗性的2个
主效基因。其中, Rhg4基因(GmSHMT)已通过图位克
隆获得 , 该基因编码一种丝氨酸羟甲基转移酶
(SHMT), 在一碳单位代谢过程中调控丝氨酸和甘氨
酸相互转化, 突变体分析、基因沉默和转基因互补
等实验皆证明该基因与抗性相关[5]。并通过 28份大
豆抗感资源 Rhg4基因测序分析, 初步推断 2个非同
义突变 SNP 位点 Rhg4-389(G/C)和 Rhg4-1165(T/A)
的碱基变化可能与大豆胞囊线虫抗性相关[5]。这 2
个位点在 28份抗感资源中只形成Rhg4-389-G/Rhg4-
1165-T和 Rhg4-389-C/ Rhg4-1165-A两种单倍型, 未
发现发生位点间重组交换。其中携带 Rhg4-389-G/
Rhg4-1165-T 单倍型的 6 份(100%)大豆资源对 SCN
皆表现抗病, 携带 Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A 单倍型
的 22 份种质中, 18 份(82%)对 SCN 表现感病。但因
为鉴定资源数较少, 有必要扩大分析群体进行验证。
酶切扩增多态性序列 (cleaved amplified poly-
morphic sequence, CAPS)标记是利用特异引物 PCR
与限制性酶切相结合而产生的一种检测 SNP位点的
DNA标记[6]。为了检测无限制性酶切位点的 SNP位
点, Michaels 和 Amasino[7]及 Neff[8]在 CAPS标记基
础上, 开发了人工引入错配碱基的衍生酶切扩增多
态性标记(derived cleaved amplified polymorphic se-
quence, dCAPS)。无论是 CAPS还是 dCAPS标记, 皆
具有共显性、位点特异性、操作简单和成本低等特
点, 已广泛用于作物的分子鉴定、基因定位、图位
克隆和辅助育种等[9-17]。
本研究针对大豆抗胞囊线虫主要抗病基因Rhg4
上发现的 2个与抗性相关的非同义突变 SNP位点分
别开发 CAPS和 dCAPS标记, 鉴定国内外抗源的基
因型, 阐明抗源在 Rhg4 位点的遗传背景, 并评价开
发标记及单倍型在资源辅助鉴定中的效率, 为分子
标记辅助大豆胞囊线虫抗病品种的选育提供标记和
材料信息。
1 材料与方法
1.1 供试材料
根据Ma等[3]和 Chen等[18]文献报道, 筛选出以
我国大豆胞囊线虫初选应用核心种质为主的150份
抗源 (3号生理小种 )和43份来源广泛的感病资源 ,
共193份 , 包括165份 (85.5%)地方品种和16份选育
品种。大部分供试材料(87%, 168)来自我国的东北
(15份)、北方和黄淮海流域(139份)及南方(10份)(图
1)。剩余25份资源分别来自日本(10份)、韩国(7份)、
俄罗斯(2份)、美国(2份)、法国(1份)、澳大利亚(1
份)、波兰(1份)和阿根廷(1份)[18]。

图 1 163 份中国大豆资源的地理分布
Fig. 1 Provenance of 163 soybean accessions in China
R: 抗病; MR: 中抗; MS: 中感; S: 感病。
R: resistant; MR: moderately resistant; MS: moderately susceptible;
S: susceptible.
第 10期 史学晖等: 大豆胞囊线虫主效抗病基因 Rhg4 (GmSHMT)的 CAPS/dCAPS标记开发和利用 1465


1.2 DNA提取和检测
取每份种质 3 粒种子于温室育苗, 并单株繁种,
取其新鲜的三出复叶 100 mg于 2 mL离心管中(加钢
珠 ), 速放入液氮冷冻 , 用打样机捣碎叶片 (2000
GENO/GRINDER)后按照快速 DNA 提取试剂盒
(MBI Fermentas公司)的操作指南提取植物基因组总
DNA保存于 100 μL去离子水中。所得 DNA经 1%
琼脂糖凝胶电泳检测 , 并使用紫外分光光度计
(UV-Vis Spectrophotometer Q5000)测其浓度。
1.3 大豆胞囊线虫 3号生理小种抗性鉴定
采用 Riggs和 Schmitt设计的大豆胞囊线虫生理
小种鉴别模式[19], 2014 年在黑龙江农业科学院田间
病圃与温室 2种环境条件下对 193份大豆资源(其中
包括 5个鉴别寄主 Pickett、Peking、PI 90763、PI 88788
和 Lee)[20]进行大豆胞囊线虫 3号小种抗性鉴定。田
间采用完全随机区组试验, 重复 3 次。田间种植行
宽 0.65 m, 行长 1.50 m, 株间距 0.05 m。温室采用盆
栽鉴定, 每份种质 3盆, 每盆 5株。出苗 30 d后, 对
田间和温室的每份种质均随机选择长势相同 10 株
进行鉴定, 数每株胞囊数, 计算每份鉴定种质的平
均胞囊数。为了检测胞囊指数(female index, FI)差异,
每隔 40行以中品 03-5373作为抗病对照, 中黄13作
为感病对照。以基于胞囊指数划分的抗病等级评估
每份种质的抗性。胞囊指数 FI=(鉴定品种每株平均
胞囊数/感病对照品种的平均胞囊数)×100%, 其中
鉴别寄主的胞囊指数以 Lee 为感病对照品种 , 根
据鉴别寄主的抗性确定生理小种 , 其他193份大豆
资源以中黄13为感病对照品种计算胞囊指数。以
Schmmit 等[21]提出的抗感指标为分级标准, FI<10为
抗病(resistant, R); 10≤FI<30为中抗(moderately re-
sistant, MR); 30≤FI<60为中感(moderately suscepti-
ble, MS); FI=60+为感病(susceptible, S)。
1.4 标记的发掘
从 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/
JQ714083)下载 Rhg4 (GmSHMT)基因序列(GenBank
登录号为 JQ714083, 来自抗病种质 Forrest), 根据文
献报道定位已知的 2个候选SNP位点, 以已报道的与
大豆胞囊线虫抗性相关的 2个非同义突变位点(Rhg4-
389 和 Rhg4-1165)[5]为候选 SNP 位点, 分别开发 CAPS
和 dCAPS 标记。利用在线软件 dCAPS Finder 2.0
(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)确认 SNP位点
酶切信息, 其中 Rhg4-389 位点存在限制性酶切位点,
开发 CAPS 标记; Rhg4-1165 位点不存在限制性酶切
位点, 利用反向互补序列, 人工引入一个错配碱基,
发现限制性酶切位点, 开发 dCAPS 标记, 分别选择特
异、经济的内切酶 Bsr B I和 Hin f I作为候选标记所用
酶。利用 Primer 5.0软件[22]在候选 CAPS/dCAPS标记
位点两侧设计 PCR引物(表 1), 涵盖 Rhg4-389位点的
PCR产物预计长度为 369 bp, Rhg4-389经 Bsr B I酶酶
切后理论上可获得 237 bp 和 132 bp 片段; 含有
Rhg4-1165位点的 PCR产物长度为 219 bp, 经 Hin f I
酶酶切后理论上可获得 196 bp和 23 bp片段。

表 1 CAPS/dCAPS 标记的引物序列、PCR 扩增和内切酶信息
Table 1 Summary information of CAPS/dCAPS markers developed
标记
Locus
突变位点
SNP
标记类型
Marker type
酶
Enzyme
引物序列
Sequence of primer (5′–3′)
退火温度
Tm (℃)
PCR片段
PCR product
(bp)
酶切后片段长度
After digestion-bp
Allele 1/Allele 2 (bp)
F: CCTCCAAGCCTTCCACCTCG
Rhg4-389 C/G CAPS Bsr B I
R: CCGCACTTATCAGCGACTTCC
56 369 369 / (237+132)
F: AGATCACAGAGTTTCTCCACCTGAT
Rhg4-1165 T/A dCAPS Hin f I
R: GCTTGGAAAATACTTGATGGGG
57 219 219 / (196+23)
dCAPS标记的错配碱基用下画线标出。Mismatched base in the dCAPS primer sets is underlined.

1.5 PCR扩增及标记验证
以基因组 DNA 为模板, 反应体系 20 μL, 包括
50 ng 基因组 DNA、10× PCR缓冲液, 2 mmol L–1
dNTPs, 2 μmol L–1引物和 1 U Taq聚合酶(全式金生
物技术有限公司)。PCR在 ABI (Applied Biosystems,
美国)公司的 PCR 扩增热循环仪上进行, 反应程序
为 95℃预变性 3 min, 94℃变性 30 s, 优化退火温度
(表 1) 40 s, 72℃延伸 50 s, 38个循环, 最后 72℃延伸
8 min, 于 4℃保存。对 PCR产物采用 1.5%琼脂糖凝
胶电泳检测, 利用 ABI 3730 (Applied Biosystems, 美
国)对条带单一的 PCR 产物进行测序, 采用 Multalin
(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html)
和 DNAMAN软件[23]进行测序比对和分析。
1.6 酶切位点识别和酶切分析
酶切分析参照 NEB (New England Biolabs)限制
性内切酶操作指南, 酶切反应体系 10 μL, PCR产物
1466 作 物 学 报 第 41卷


5 μL、3 U内切酶、1.5 μL NEB缓冲液。将酶切反应
体系放入 37℃保温箱或水浴锅中, 30 min后取出, 采
用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 CAPS标记的酶切产物;
dCAPS标记的酶切产物变性后采用 7%变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳(PAGE)分离, 银染显色检测。
1.7 数据分析
CAPS/dCAPS 标记的抗病种质选择效率 (%)=
(携带某一等位变异的抗病种质数/携带该等位变异
的总种质数)×100%
使用 TASSEL v4.0 (http://www.maizegenetics.
net/)计算 Rhg4-389 和 Rhg4-1165 间的 r2 (squared
allele frequency correlation, 等位基因频率相关系数
平方)和 D (standardized disequilibrium coefficient,
标准平衡系数)[24]值, 评估 2个 SNP位点间的连锁不
平衡(linkage disequilibrium, LD)水平。基于 Fishers’
exact测验[25]检验位点间 LD的显著性。
使用 Microsoft Excel 2007进行表型次数分布与
单倍型相关性卡方检验[26]。
2 结果与分析
2.1 抗源鉴定
用鉴别寄主 Pickett、Peking、PI 90763、PI 88788
检测鉴定结果显示, 黑龙江省农业科学院哈尔滨田
间病圃和温室病土皆为3号生理小种(SCN3)(表2)。
以 Lee 作为对照, 中品03-5373表现为免疫(FI 为0),
中黄13表现为高感(FI=239)。193份大豆资源的 FI (%)
变化范围是0~251.34, 呈现连续分布。大多数种质
(64.5%, 124份)表现抗病, 19份种质(6.5%)表现感病,
中 抗 和 中 感 种 质 分 别 为 26份 (13.5%)和 24份
(12.1%)。在124份抗病和26份中抗种质中, 121份是
地方种质, 主要来自我国大豆胞囊线虫初级应用核
心种质(112份)。

表 2 哈尔滨地区大豆胞囊线虫生理小种鉴定结果
Table 2 Determination of physiological races of soybean cyst nematode in some areas of Harbin
鉴别寄主 Differential hosts 抗性鉴定
Determination Peking Pickett PI 88788 PI 90763
生理小种
Race
胞囊指数 FI 5.9 3.2 3.2 1.3
反应 Response — — — —
3
“—”表示 FI <10%, 为抗病。FI: female index; “—” means FI < 10%, being resistant.

2.2 CAPS/dCAPS标记开发与验证
针对 2个位点 Rhg4-389和 Rhg4-1165分别设计
的引物 , 对 9 份已知基因型[Peking、PI 90763、
Forrest、PI 437654、PI 209332、PI 548316 (Cloud)、
PI 88788、Essex、Williams 82]和 4份未知基因型(元
钵黑豆、赤不流黑豆、抗线 1号和泰兴黑豆)的 DNA
进行 PCR 扩增, 均获得与目标片段长度大小相近的
单一 PCR产物。分别取 Peking和 Essex涵盖 Rhg4-
389 和 Rhg4-1165 位点的 PCR 产物进行测序并与
Forrest参考序列比对分析显示, PCR产物皆为 Rhg4
基因目标片段, 不同种质间在目标 SNP 位置上存在
碱基变化, 与预测一致(图 2-A, B)。从图 3-A可以看
出, CAPS标记 Rhg4-389 PCR扩增产物片段大小为
369 bp, 等位变异为 C; Bsr B I酶切后产生 2个片段,
分别为 237 bp和 132 bp, 等位变异为 G, 与预期一
致(图 3-A, 表 1)。dCAPS标记Rhg4-1165产生的 PCR
片段经 Hin f I酶切后理论上产生 3个酶切产物, 由
于其中一个 23 bp 的片段长度过小, 电泳时迁移速
度快, 跑出 PAGE 胶而无法检测, 因此, 只检测到 2
种酶切产物。未经酶切反应的 DNA片段大小为 219
bp, 等位变异为 T; 酶切反应的 DNA片段为 196 bp,
等位变异为 A (图 3-B, 表 1)。已鉴定 9份种质在 2个
SNP 位点上的鉴定结果与已报道一致, 表明开发的
CAPS/dCAPS标记可用于大豆种质资源基因型鉴定。
2.3 抗源基因型鉴定
利用开发的 CAPS 标记 Rhg4-389 和 dCAPS 标
记 Rhg4-1165 对 193 份大豆抗感种质进行基因型鉴
定, 发现 2个位点上不同等位变异的发生频率接近。
Rhg4-389-G 等位变异的发生频率为 54.5%, Rhg4-
389-C等位变异为 45.6%。Rhg4-1165-T等位变异发
生频率为 53.4%, Rhg4-1165-A为 46.6%。Rhg4-389-G
等位变异在 105份检出种质中抗病种质有 99份, 对
抗病种质的鉴定效率为 94.3%; Rhg4-1165-T等位变
异在 103份检出种质中抗病种质有 96份, 对抗病种
质的鉴定效率为 93.2%, 表明 Rhg4-389-G 和 Rhg4-
1165-T 等位变异主要分布于抗病种质(表 3)。携带
Rhg4-389-C和 Rhg4-1165-A等位变异的种质在不同
抗感种质中均有分布, 其中携带 Rhg4-389-C等位变
异的感病种质有 19份, 中感种质有 23份, 占关联分
析群体感病种质(包括 MS 和 S, 共 43 份)的 97.7%;
第 10期 史学晖等: 大豆胞囊线虫主效抗病基因 Rhg4 (GmSHMT)的 CAPS/dCAPS标记开发和利用 1467


携带 Rhg4-1165-A等位变异的感病种质有 19份, 中
感种质 22 份, 占感病种质(包括 MS 和 S, 共 43 份)
的 95.3%, 表明感病种质主要携带 Rhg4-389-C 和
Rhg4-1165-A等位变异。
2.4 连锁不平衡分析和单倍型分析
Rhg4-389和 Rhg4-1165间的物理距离为776 bp,
存在显著连锁不平衡(P<0.0001), r2为0.87, D为
0.96。进一步分析发现, 193份大豆抗感资源在2个
SNP 位点中共形成4个单倍型, 其中前人已报道[5]的
Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T 和 Rhg4-389-C/Rhg4-
1165-A 为优势单倍型 , 发生频率分别为52.3%和
44.6%; Rhg4-389-G/Rhg4-1165-A 和 Rhg4-389-C/
Rhg4-1165-T 为新单倍型; 其中 Rhg4-389-G/Rhg4-
1165-A 发生频率仅2%, 携带该单倍型的种质有小

图 2 抗感种质的 PCR 扩增片段序列比对
Fig. 2 Alignment of PCR fragments from Peking, Essex, and reference Forrest
A: Peking和 Essex扩增的 Rhg4-389 PCR片段基因序列与 Forrest参考序列的比对; B: Peking和 Essex扩增的 Rhg4-1165 PCR片段基因
序列与 Forrest参考序列的比对。箭头方向表示开发标记的位置。 ☆ 表示错配碱基; ★ 表示突变位点。
A: Sequence alignment of Rhg4-389 PCR fragment among Peking, Essex, and reference Forrest; B: Sequence alignment of Rhg4-1165 PCR
fragment among Peking, Essex, and reference Forrest. Mi☆ smatched base; Mutation site★ .
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图 3 2 个 CAPS/dCAPS 标记在 13 份大豆种质中的多态性分析
Fig. 3 Polymorphism analysis of two CAPS/dCAPS markers in 13 soybean cultivars
A: Rhg4-389标记在 13份大豆种质的多态性; B: Rhg4-1165标记在 13份大豆种质的多态性。M: DNA marker DL100; 1~13: PCR 产物的
酶切产物, 引物及内切酶信息见表 1; 1: Williams 82; 2: Peking; 3: PI 90763; 4: Forrest; 5: Essex; 6: PI 437654; 7: 元钵黑豆; 8: PI 209332;
9: PI 548316 (Cloud); 10: 赤不流黑豆; 11: PI 88788; 12: 泰兴黑豆; 13: 抗线 1号; S: 抗病种质; R: 感病种质。
A: Polymorphism of CAPS marker Rhg4-389 in 13 soybean cultivars; B: Polymorphism of dCAPS marker Rhg4-1165 in 13 soybean cultivars.
M: DNA molecular marker (100-bp ladder); 1–13: digested products of PCR amplicons; the primers and enzymes informations are shown in
Table 1; 1: Williams 82; 2: Peking; 3: PI 90763; 4: Forrest; 5: Essex; 6: PI 437654; 7: Yuanboheidou; 8: PI 209332; 9: PI 548316 (Cloud);
10: Chibuliuheidou; 11: PI 88788; 12: Taixingheidou; 13: Kangxian 1; S: susceptible varieties; R: resistant varieties.

表 3 不同等位变异对应的抗病种质次数分布及选择效率
Table 3 Frequency distribution and selection efficiency of different alleles on resistant materials
表型 Phenotype 等位变异
Allele
种质数
Number
发生频率
Frequency (%) 抗病 R 中抗 MR 中感 MS 感病 S
抗病种质选择效率
Selection efficiency of resistant materials (%)
Rhg4-389-G 105 54.4 99 5 1 0 94.3
Rhg4-389-C 88 45.6 25 21 23 19 28.4
Rhg4-1165-T 103 53.4 96 5 2 0 93.2
Rhg4-1165-A 90 46.6 28 21 22 19 31.1
R: resistant; MR: moderately resistant; MS: moderately susceptible; S: susceptible.

黑豆、小黑豆、黑豆、PI438489B; Rhg4-389-C/Rhg4-
1165-T发生频率仅1%, 携带该单倍型的种质有黑豆
和邳县大紫花糙(表4)。表型次数分布与单倍型经卡
方独立性检测显示 P<0.0001 (P=1.49E–36), 说明单
倍型与表型极显著相关。携带 Rhg4-389-G/Rhg4-
1165-T单倍型(101份)的资源中表现抗病的种质有95
份, 该单倍型对抗病种质的鉴定效率为94.1%, 由于
2个 SNP 位点间存在显著的连锁不平衡, 抗病单倍
型与单个抗病等位变异对抗病种质的鉴定效率相近;
携带Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A单倍型的抗病(包括R
和 MR, 共45份)和感病(包括 MS 和 S, 共41份)种质
数目相近, 但对抗病种质的鉴定效率却比较低, 为
30% (表4), 推测这些携带感病单倍型的抗病种质具
有其他抗病基因。

表 4 不同等位变异单倍型对应的抗病种质次数分布及选择效率
Table 4 Frequency distribution and selection efficiency of different haplotypes on resistant materials
表型 Phenotype 单倍型
Haplotype
种质数
Number
发生频率
Frequency (%) 抗病 R 中抗 MR 中感 MS 感病 S
抗病种质选择效率
Selection efficiency of
resistant materials (%)
Rhg4-389-G/Rhg4-1165-T 101 52.3 95 5 1 0 94.1
Rhg4-389-C/Rhg4-1165-T 2 1.0 1 0 1 0 50.0
Rhg4-389-G/Rhg4-1165-A 4 2.1 4 0 0 0 100.0
Rhg4-389-C/Rhg4-1165-A 86 44.6 24 21 22 19 27.9

3 讨论
近年来, 许多研究利用分子标记对大豆胞囊线虫
抗性基因进行了定位和克隆, 筛选出一些与抗病基因
紧密连锁标记, 主要是与 rhg1 位点连锁的标记[27]。
Mudge等[28]在 SCN抗性位点 rhg1 两侧发现 SSR标
记 Satt038 与 Satt130, 鉴定 SCN 的准确率分别为
95%和 74%, 用 2 个标记联合鉴定的准确率为 98%,
但无法将 PI 88788或 PI 209332等抗源与美国南部
的一些感病种质区分开。Cregan等[29]用和 rhg1共分
离的标记 Satt309和 Sat_168 (位于 rhg1的两侧), 发
现 Satt309能够区分出 Peking (PI 548402)、PI 90763、
PI 437654 和绝大多数的感病种质, Sat_168 能够将
PI 88788 和 PI 209332 与美国南部的感病种质如
第 10期 史学晖等: 大豆胞囊线虫主效抗病基因 Rhg4 (GmSHMT)的 CAPS/dCAPS标记开发和利用 1469


Essex、Lee、Bragg 区分开来 , 但无法将感病品系
Hutcheson、Noir-1与抗源 PI 88788、PI 209332区分
开, 2个标记联合鉴定可显著增加对杂交后代的鉴定
效率。王文辉等[30]也利用 Satt309对我国634份大豆
种质进行分子标记辅助鉴定, 发现128 bp 和134 bp
等位变异对抗病资源的鉴定效率为72.46%, 其中免
疫、双抗、三抗种质的鉴定效率分别达到77.27%、
87.69%和100%。Li等[31]对8份抗感种质(6份抗源和2
份感病种质)的候选基因 rhg1测序, 根据发现的 SNP
位点开发经济简便的 SNAP 标记, 通过关联分析发
现由2个非同义突变 SNP 位点689C>A 和757C>T 形
成的单倍型可有效的区分抗病和感病资源。南海洋
等 [32]同样以 rhg1基因序列为基础开发 InDel 标记
rhg1-I4, 对 SCN 抗病种质鉴定效率为88.2%, 感病
种质鉴定效率为100.0%, 与 Satt309联合鉴定可提高
检测效率。但是目前还没有针对主效抗病位点 Rhg4
开发的可用于分子标记辅助选择的有效标记。Liu
等[5]图位克隆了 Rhg4基因, 并在该基因编码区上发
现 2个非同义突变 SNP 位点 Rhg4-389 (G/C)和
Rhg4-1165 (T/A), 通过28份抗感种质的关联分析推
测这2个 SNP 位点可能与大豆胞囊线虫抗性相关,
因为分析群体数量过少, 有必要在大规模群体上进
行验证。本研究针对 Rhg4-389和 Rhg4-1165分别开
发了 CAPS 和 dCAPS 标记, 通过对193份大豆抗感
资源的鉴定和分析, 确认 Rhg4-389和 Rhg4-1165与
大豆胞囊线虫抗性密切相关, 其中 Rhg4-389 (94.3%)
对抗病种质的鉴定效率稍好于 Rhg4-1165 (93.2%)。
Rhg4-389和 Rhg4-1165间处于高度连锁不平衡状态,
抗感种质在2个位点的基因型具有协同性 , 形成的
抗病单倍型对抗病种质的鉴定效率为94.1%, 说明
Rhg4-389或 Rhg4-1165单独使用即可辅助 SCN 抗性
的鉴定。
Rhg1 和 Rhg4 是控制大豆胞囊线虫病抗性的主
效基因。研究表明, 大豆胞囊线虫抗源中存在 PI 88788-
Type 和 Peking-Type 两种类型材料, PI 88788-Type
抗病种质的抗性仅由 rhg1控制, Peking-Type种质由
rhg1和 Rhg4两个抗性基因控制[5,33-35]。在本研究供
试的来自大豆胞囊线虫核心种质的抗源中, 90%以
上携带 Rhg4 抗病等位基因, 抗源以 Peking-Type 类
型为主, 加大 PI 88788-Type抗病种质在我国抗病育
种中的利用可有效拓宽抗病品种的遗传基础。此外,
在标记辅助选择实践中, 应该结合使用 rhg1和 Rhg4
相关标记联合对种质进行鉴定, 阐明 SCN抗性在这
2个位点的遗传基础, 以促进抗源利用。
随着分子生物学研究发展与技术手段提高 , 数
以百万计的大豆 SNP 被发掘[36-38], 为大豆遗传育种
和分子进化研究提供了丰富的标记资源, 高通量的
SNP基因分型技术(如 Illumina公司的GoldenGate等)
及应运而生的基因特异性 SNP 鉴定技术 (如
KASPar[39]、CAPS 标记、SNAP[40]等)的使用大大促
进了标记资源的利用。与自动化程度较高、对少量标
记大群体基因型鉴定更经济有效的 KASPar 技术[41]
相比, 本研究开发的 CAPS 和 dCAPS 标记, 不需要
荧光实时定量 PCR 仪等设备, 利用琼脂糖和聚丙烯
酰胺凝胶电泳就可以检测 , 花费较低 , 方便我国育
种家利用。
4 结论
针对大豆胞囊线虫主效基因 Rhg4上的2个 SNP
位点, 开发了简便、经济的 CAPS 标记(Rhg4-389)
和 dCAPS 标记(Rhg4-1165), 单标记抗病等位变异
Rhg4-389-G (94.3%)和 Rhg4-1165-T (93.2%)及它们
组成的抗病单倍型(94.1%)对抗病种质的鉴定效率
相近, 说明2个标记具有协同性, 皆可用于辅助 SCN
抗性鉴定。
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