全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18 (1) : 15～ 20
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
禾谷类作物雄性不育及育性恢复表达载体的构建Ξ
张晓国2　刘玉乐1　杨清平2　田　波1
(1 中国科学院微生物研究所　北京　100080)　　 (2 武汉大学生命科学学院　武汉　430072)
提　要　通过 PCR 反应扩增出了玉米花药特异启动子CA 55, 将其分别与Barnase 和Barstar
基因融合, 构建成了植物雄性不育基因 CA 55BNNO S 和其育性恢复基因 CA 55BSNO S, 再将
它们分别插入到 pCAM B IA 3300 中, 获得了应用于禾谷类作物的基因工程雄性不育及其育性
恢复的表达载体。
关键词　雄性不育, 育性恢复, 表达载体, 禾谷类作物
CONSTRUCT ION OF EXPRESSION VECTORS FOR CEREAL
M AL E STER IL ITY AND ITS FERT IL ITY RESTORAT ION
Zhang X iaoguo 2　L iu Yu le1　Yang Q ingp ing2　T ian Bo 1
(1 Institu te of M icrobiology , T he Ch inese A cad emy of S ciences　Beijing　100080)
(2 Colleg e of L if e S ciences,W uhan U niversity　W uhan　430072)
Abstract 　T he tapetum 2p romo ter (CA 55) w as amp lified from the to ta l DNA of Z ea m ay s L. by
po lym erase chain reaction, and w as fused w ith barnase (BN ) and barstar (BS) genes, respectively. T he
m ale sterile gene. CA 55BNNO S and its fert ility resto rat ion gene CA 55BSNO S w ere construced. T hey
w ere cloned in to pCAM B IA 3300, respectively. T he exp ression vecto rs fo r cereal m ale sterility and its
fert ility resto rat ion w ere ob tained.
Key words　M ale sterility, Fert ility resto rat ion, Exp ression vecto r, Cereal
1990 年M arian i 等用花药特异表达基因 TA 29 启动子与Barnase 基因融合成植物雄
性不育基因, 经遗传转化首次获得了烟草基因工程雄性不育系〔1〕。2 年后, 他们又用 TA 29
启动子与Barstar 基因融合, 通过转基因获得了能使烟草基因工程雄性不育系育性得以
恢复的基因工程雄性不育恢复系, 从而开创了通过基因工程进行植物杂种优势利用的新
课题〔2〕。由此, 国内外的研究者纷纷利用这一策略在烟草、油菜、花耶菜、莴苣等双子叶植
物上成功地获得了转基因的雄性不育系〔3～ 7〕。但是单子叶植物如重要的禾谷类作物乃是
极少地报道获得基因工程雄性不育系, 这主要是因为植物花药特异启动子来源于烟草、拟
南芥菜、矮牵牛、油菜以及蕃茄的居多。Sh im amo to 研究了转基因植物启动子功能, 认为Ξ 收稿日: 1998210218, 修回日: 1998212230。第一作者: 男, 1963年出生, 副教授 (博士) , 主要从事发育遗传学研究。国家“863”计划和武汉市晨光计划资助的课题。
来源于单子叶植物启动子难以在转基因的双子叶植物启动外源基因中表达, 然而在转基
因单子叶植物中启动它高效表达〔8〕。因此, 需要发掘和利用新的植物花药特异启动子。笔
者应用的CA 55 启动子是来源于玉米的花药绒毡层特异启动子, 由此构建的植物雄性不
育及育性恢复表达载体, 它适合于应用基因工程创造禾谷类作物雄性不育系和其相应的
恢复系。
1　材料和方法
1. 1　材料与试剂
玉米 (Z ea m ay s L. )D 黄 17 来自中国农业科学院作物育种栽培研究所。常规菌种大
肠杆菌 (E. coli) DH 5Α、JM 109 和 T G1 由中国科学院微生物研究所提供。 pGEM 7Z2
6BBNNO S 和 pGEM 7ZBS 已由我们构建而成〔9〕。质粒 pCAM B IA 3300 由澳大利亚
CAM B IA (Cen ter fo r the A pp lica t ion of M o lecu lar B io logy to In ternat ional A gricu ltu re)
的D r. Jefferson RA 提供。限制性内切酶及其他工具酶购自 P rom ega、Boeh ringer M ann2heim、Gib ico BRL , 华美等公司。W izardTM P lu s M in ip rep s DNA 纯化系统购自 P rom ega
公司; Α232P2dCT P 和 Α235S2dA T P 为D uPon t 公司产品; PCR 引物由中国科学院微生物研
究所生物技术中心合成; 常用化学药品购自国内各公司或厂家。
1. 2　基因组D NA 的提取
采用Rogers 介绍的CTAB 方法提取玉米基因组总DNA〔10〕。
1. 3　花药特异启动子序列测定
参考 Pharm acia T 7 DNA 聚合酶序列分析试剂盒的操作指南进行。
1. 4　花药特异启动子的扩增
引物设计参照世界专利文献 W O 92ö13956 记载的碱基序列〔11〕, 所设计的引物
pCA 5521 和 pCA 5522 如下:
pCA 5521: 　5′CGGGTA CCA T GGCT GCA GCTA GT TA GC3′
Kp nÉ
pCA 5522: 　5′CGGAA T TCT GGTA T GCA TCAA TA GA GCC3′
E coR É
PCR 反应的总体为 50 ΛL , 其中含有 50 mmo löL KC l, 10 mmo löL T ris2HC l, 011%
T riton2100, 115 mmo löL M gC l2, 012 mmo löL dN T P, 012 Λmo löL 引物, 215 U T aq DNA
聚合酶, 约 50 ng 模板DNA , pH 8. 3。PCR 反应条件为 95 ℃变性 3 m in, 94℃ 40 s, 52℃
40 s, 72 ℃ 3 m in, 38 个循环, 72℃延伸 30 m in。
1. 5　花药特异启动子的克隆
用琼脂糖凝胶电泳检查 PCR 扩增产物的有无和大小, 选取扩增片段特异性强且大小
正确的 PCR 产物, 用低熔点琼脂糖电泳回收, 接着将其用 E coR É 和 Kp nÉ 双酶切, 然后
插入到 pGEM 7Z 上的相应位点即得 pGEM 7Z2CA 55。
1. 6　含CA55 启动子雄性不育表达载体的构建
先分别将 pGEM 7Z2CA 55 用B am H É , pGEM 7Z26BBNNO S 用 X hoÉ 酶切; 接着用
k lenow 酶补平它们的粘性末端; 然后用酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) 抽提, 乙醇沉淀回
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收线状 DNA ; 再分别用 N co É 对其进行酶切, 经低熔点琼脂糖凝胶电泳回收线状
pGEM 7Z2CA 55 和BNNO S DNA 片段; 最后用 T 7 DNA 连接酶, 将它们连成环状, 即用
E coR É 从 pGEM 7Z2CA 55BNNO S 上切下 CA 55BNNO S, 并将其插入到 pCAM B IA 3300
上的相应位点。
1. 7　含CA55 启动子雄性不育育性恢复表达载体的构建
含CA 55 启动子雄性不育育性恢复表达载体的构建方法与方法“116”相似。只是将不
育表达载体中的Barnase 基因替换成Barstar 基因即可。其过程是用B spH É 和B am H É ,
从 pGEM 7ZBS 上切下BS, 将其插入到用N coÉ 和B am PH É 酶切除去BN 的 pGEM 7Z2
CA 55NO S 相应位点上, 即构建成 pGEM 7Z2CA 55BSNO S, 下面的过程与方法“116”相同。
2　结果与分析
2. 1　CA55 启动子的获得
用引物 pCA 5521 和 pCA 5522, 经 PCR 扩增出了大小为 112 kb 的特异带, 即 CA 55。
将其克隆在 pGEM 7Z 的多克隆位点上, 即得重组质粒 pGEM 7Z2CA 55。酶切鉴定
pGEM 7Z2CA 55 结果表明, 重组质粒 pGEM 7Z2CA 55 正确, 见图 1。
A. pGEM 7Z2CA 55+ E coR É + Kp nÉ
B. CA 55 p romo ter amp lified by PCR
C. ΚDNA + B stEÊ
图 1　CA55 PCR 扩增和 pGEM 7Z2CA55 酶切鉴定
F ig. 1　Amp lification of CA 55 p romo ter by PCR and
its iden tification of pGEM 7Z2CA 55 by
enzym e digestion
又用 pCA 5521 和 pCA 5522 作为测序引物, 对已克隆的CA 55 启动子 5’端和 3’端序
列进行了测定。从测出的两端各约 100 个核苷酸序列分析表明, 所得的CA 55 正是已知玉
米花药绒毡层特异表达基因 (世界专利文献号W O 92ö13956)的相应启动子〔11〕。
2. 2　含CA55 启动子雄性不育表达载体的获得
为获得含CA 55 启动子雄性不育表达载体, 首先必须获得含CA 55 启动子的雄性不
育基因CA 55BNNO S, 然后将其插入到植物表达载体中, 这一过程见图 2。
按方法“115”, 我们获得了含雄性不育基因的重组质粒 pGEM 7Z2CA 55BNNO S, 酶切
鉴定结果见图 3。从图中可以看到, 用E coR É 和N coÉ 双酶切pGEM 7Z2CA 55BNNO S, 可
以得到 600 bp 的DNA 片段, 即BNNO S 和 1. 20 kb 的DNA 片段, 即CA 55 启动子。用
B am H É、E coR É 和N coÉ 三酶切, 结果表明也出现了 1120 kb 的CA 55 启动子。同时, 将
600 bp 的BNNO S 分成了 2 个更小的DNA 片段, 即 1 个 330 bp 的BN 和 1 个 270 bp 的
NO S。由此, 证明 pGEM 7Z2CA 55BNNO S 重组质粒的正确性。
将获得的 118 kb 雄性不育基因CA 55BNNO S 插入到 pCAM B I3300 上, 使载体上的
抗除草剂膦化类黄酮 PPT 基因Bar 与不育基因CA 55BNNO S 紧密连锁, 这样就获得了
71　第 1 期　　　　　　　　　张晓国等: 禾谷类作物雄性不育及育性恢复表达载体的构建
图 2　禾谷类作物雄性不育及其育性
恢复表达载体构建流图
F ig. 2　Schem e of the exp ression vecto r construction fo r
cereal m ale sterility and its fert ility resto ration
A. ΚDNA + B stEÊ ;
B. pGEM 7Z2CA 55BNNO S+ E coR É + N coÉ ;
C. pGEM 7Z2CA 55BNNO S+ B am H É + E coR É + N coÉ ;
D. pGEM 7Z2CA 55BSNO S+ B am H É + E coR É + N coÉ ;
E. pGEM 7Z2CA 55BSNO S+ B am H É + E coR É + B spH É
图 3　pGEM 7Z2CA55BNNO S 和 pGEM 7Z2
CA55BSNO S 酶切鉴定
F ig. 3　 Iden tification of pGEM 7Z2CA 55BNNO S
and pGEM 7Z2CA 55BSNO S by enzym e digestion
A. pCAM B IA 33002CA 55BNNO S+ E coR É
B. pCAM B IA 33002CA 55BSNO S+ E coR É
C. ΚDNA + B stEÊ
图 4　pCAMB IA33002CA55BNNO S 和
pCAMB IA33002CA55BSNO S 酶切鉴定
F ig. 4　 Iden tification of pCAM B IA 33002
CA 55BNNO S and pCAM B IA 33002
CA 55BSNO S by E coR É植物雄性不育表达载体。对这一表达载体进行酶切鉴定, 结果见图 4。从图 4 中可以看到有118 kb的雄性不育基因的存在, 表明表达载体构建正确。2. 3　含CA55 启动子雄性不育育性恢复表达的
获得
按照方法“115”, 我们获得了含雄性不育育性恢复基因的重组质粒 pGEM 7Z2
CA 55BSNO S 以及其相应的表达载体 pGEM B IA 33002CA 55BSNO S。从图 3 中的酶切鉴
定结果可以看到 pGEM 7Z2CA 55BSNO S 上含有约 1184 kb 的DNA 片段 CA 55BSNO S,
同样, 用 B am H É、E coR É 和N coÉ 或 B am H É、E coR É 和 B spH É 三酶切 pGEM 7Z2
81 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18 卷　
CA 55BSNO S 只有约 1147 kb 的 CA 55BS 和 270 bp 的NO S, pGEM 7Z2CA 55BSNO S 上
N coÉ 和B spH É 位点在构建过程中均消失, 故均不能切下 1120 kb 的DNA 片段CA 55。
由此可见, pGEM 7Z2CA 55BSNO S 的构建正确。同样由图 4 可看到用 E coR É 酶切
pCAM B IA 33002CA 55BSNO S也可以得到与CA 55BNNO S大小相似的CA 55BSNO SDNA
片段, 重组质粒 pCAM B IA 33002CA 55BSNO S 即为所建的带CA 55 启动子植物雄性不育
育性恢复表达载体。
3　讨论
我们在实验中获得的植物雄性不育及其育性恢复表达载体含有CA 55 启动子。CA 55
启动子来源于单子叶植物玉米花药绒毡层特异表达基因CA 55 的 5’端上游调控区〔11〕。它
能启动外源基因在玉米花药绒毡层中特异表达。D e B lock 等 1997 年用CA 55 启动子与
Barnase 基因融合, 构建成植物雄性不育基因, 转化小麦, 首次获得了基因工程雄性不育
的单子叶植物〔11〕。由此植物基因工程雄性不育由双子叶植物向单子叶植物, 尤其是禾谷
类粮食作物延伸取得了突破。这一突破的取得主要归结于CA 55 启动子的应用, 它是由
CA 55 启动子启动Barnase 基因在小麦花药绒毡层中特异表达形成的, 这表明CA 55 启动
子在小麦中具有生物活性。E llis 等的研究结果表明, 玉米乙醇脱氢酶基因A db1 启动子在
转基因烟草中无活性〔12〕; 但 Kyozuka 等在转基因水稻的研究中发现A db1 启动子表现与
在玉米中相同的活性〔13〕。Yam aguch i 等在研究来源于水稻对ABA 反应的基因 ra t16 启动
子也获得了相似的结果〔14〕。因此, 我们推断CA 55 启动子在水稻中也具有生物活性。因
此, 我们构建的含 CA 55 启动子的植物雄性不育基因CA 55BNNO S 及其育性恢复基因
CA 55BSNO S, 可以应用于小麦、水稻和玉米等禾谷类作物, 创造基因工程雄性不育系及
其恢复系。
pCAM B IA 3300 是由位于澳大利亚的分子生物学应用于农业的国际研究中心 (简写
为 CAM B IA ) 的科学家构建的, 大小为 814 kb 植物表达载体, 其上含有来自 pBR 322 和
pV S1 的复制子。因此它在大肠杆菌中极高拷贝地复制, 易于获得大量质粒DNA , 以便用
于基因枪的转化。而且, pCAM B IA 3300 上还含有 T 2DNA , 可以借助农杆菌进行植物的遗
传转化。在 T 2DNA 的中间装配有用于克隆外源基因的多克隆位点。我们很方便地将构建
好 的 植 物 雄 性 不 育 基 因 CA 55BNNO S 和 其 育 性 恢 复 基 因 CA 55BSNO S 插 入
pCAM B IA 3300 中, 通过兰白斑筛选重组质粒。此外, 其上还带有抗卡那霉素 (Kan) 和除
草剂膦化类黄酮 (PPT ) 供筛选的标记基因。pCAM B IA 3300 上的 T 2DNA 是来源于农杆
菌A 281 中的质粒 pT iBo524 上的毒性区, 它能诱导更广泛的植物更早地产生出更大的冠
瘿瘤〔15〕。 Ish ida 等借助这一毒性区, 用农杆菌介导, 成功地转化了玉米〔16〕; H iei 等同样借
此转化了粳稻, 转化效率均在 12. 8% 以上, 最高达 2816%〔17〕。R ash id 等用此转化籼稻, 转
化效率高达 22% , 几乎相等于农杆菌转化双子叶植物〔18〕。肖含和黄大年从CAM B IA 引进
这种质粒, 通过农杆菌介导, 转化籼稻品种 Basm ati1 悬浮细胞, 转化效率为 5%～
10%〔19〕。因此, 本实验构建的禾谷类作物雄性不育及其育性恢复表达载体具有很好的应
用潜力, 用以转化禾谷类作物, 可望获得雄性不育及其育性恢复系, 进行杂种优势利用。
91　第 1 期　　　　　　　　　张晓国等: 禾谷类作物雄性不育及育性恢复表达载体的构建
参 考 文 献
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