全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(12): 2123−2134 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31200250)，国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2012AA101201)和广东省自然科学基金项目(S2011010
001892)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 刘永柱, E-mail: lively@scau.edu.cn; 陈志强, E-mail: chenlin@scau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: guo.tao@vip.163.com, Tel: 020-38604903 **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-03-26; Accepted(接受日期): 2013-06-20; Published online(网络出版日期): 2013-09-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130929.1536.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.02123
水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体 hfa-1的基因表达谱分析
郭 涛** 黄永相** 罗文龙 黄 宣 王 慧 陈志强* 刘永柱*
华南农业大学 / 国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东广州 510642
摘 要: hfa-1的白化转绿、多分蘖矮秆表型受单隐性核基因 hw-1(t)控制。该基因编码含线粒体交替氧化酶 AOX结
构的叶绿体蛋白, 通过参与叶绿体呼吸电子传递链, 对类胡萝卜素生物合成途经及其次生代谢途径进行调控。本研究
对 hfa-1 突变体叶色白化转绿过程中的类胡萝卜素生物合成途径、与该途径有关的植物激素代谢途径的相关基因进
行表达分析, 并分析了 hfa-1 突变体在白化、转绿 2 个时期的基因表达谱。结果表明, 类胡萝卜素、植物激素(GA、
ABA 和 SL)生物合成相关基因在 hfa-1 突变体白化期叶片中表达量减低, 暗示 hw-1(t)基因的突变抑制了苗期类胡萝
卜素合成, 同时还对涉及该过程相关多个次生代谢途径产生影响。通过基因表达谱芯片和功能分类分析, 发现 hfa-1
叶色白化转绿过程中上调和下调表达基因涉及的生理过程主要在光合作用、应对内源刺激物和胁迫响应等方面; 其
中电子传递体 Cytb6/f 复合蛋白合成相关基因上调表达明显, 推测 Cytb6/f 蛋白复合体在电子传递和质醌库还原氧化
上对 hw-1(t)起一定的补偿功能。
关键词: 水稻; 白化转绿; 突变体 hfa-1; 基因表达分析
Gene Differential Expression of a Green-Revertible Albino and High-Tillering
Dwarf Mutant hfa-1 by Using Rice Microarray
GUO Tao**, HUANG Yong-Xiang**, LUO Wen-Long, HUANG Xuan, WANG Hui, CHEN Zhi-Qiang*, and
LIU Yong-Zhu*
South China Agricultural University, National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, Guangzhou 510642, China
Abstract: Phenotype of the hfa-1 mutant characterized by green-revertible albino and high-tillering dwarf is controlled by a single
recessive nuclear gene hw- (t), which encodes a chloroplast protein containing the mitochondrial alternative oxidase (AOX) struc-
ture and involves in the electron transport chain of chloroplast respiratory regulating biosynthesis of carotenoid and carote-
noid-related secondary metabolic pathways. In this study, expression analysis of genes involved in carotenoid biosynthesis and
carotenoid-related plant hormones biosynthesis and gene-expression profiling were conducted before and after the turning-green
of hfa-1 mutant. the results displayed that expression levels of genes involved in carotenoid biosynthesis and carotenoid-related
plant hormones (GA, ABA, and SL) biosynthesis were decreased in the albino leaves of hfa-1, suggesting that mutation of hw-1(t)
inhibits the biosynthesis of carotenoid and has an impact on carotenoid-related secondary metabolic pathways. Gene expression
profiling and functional classification showed that genes related to physiological processes in response to photoeynthesis, en-
dogenous stimulus and stress were differently expressed in hfa-1 before and after its turning-green. Expression of genes encoding
proteins related to the electron transport complex Cytb6/f were up-regulated significantly, indicating that Cytb6/f would provide
some compensation in electron transport and redox of plastoquinone in the hfa-1 mutant.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Green-revertible albino; hfa-1 mutant; Gene expression analysis
叶色突变是一种常见的表型变异, 突变基因通
过直接或间接影响光合色素的合成和降解, 最终影
响植物的光合作用。已克隆的水稻叶色突变基因多
数与叶绿素合成、降解和叶绿体发育相关。例如
OsYGL1 编码的叶绿素合成酶催化叶绿素 a 的羧化
反应, 该基因的突变导致突变体内四吡咯中间产物
2124 作 物 学 报 第 39卷


含量骤增、叶绿体发育迟滞[1]。此外, 也有少数水稻
叶色突变基因是通过影响类胡萝卜素合成而间接影
响叶绿素的合成和降解的。如类胡萝卜素合成相关
酶基因 PDS、ZDS、CRTISO和 β-LCY突变会导致类
胡萝卜素含量降低, 破坏光合系统, 降低叶绿素含
量, 导致幼苗白化[2]。
本课题组通过空间诱变获得突变体 hfa-1, 该突
变体在三叶期之前完全白化, 随后逐渐转绿, 并且
伴随多分蘖矮秆表型。前期研究表明[3-4], hfa-1的白
化转绿、多分蘖矮秆表型受单隐性核基因 hw-1(t)控
制 , 通过图位克隆筛选出候选基因 LOC_Os04g
57320, 该基因与拟南芥叶色花斑基因 im 同源[5-6]。
IM 基因编码含线粒体交替氧化酶 AOX 结构的叶绿
体蛋白, 通过参与叶绿体呼吸电子传递链, 在类胡
萝卜素生物合成途经中调控八氢番茄红素脱氢酶
PDS 活性。类胡萝卜素生物合成是类异戊二烯合成
途径中的重要分支, 其不同反应中间产物与众多次
生代谢途径有关[7]。与 IM 基因不同, hw-1(t)不但影
响叶色, 还对株高、分蘖等其他表型性状产生重要
影响, 暗示在单子叶植物中存在不同的调控机制。
近年来越来越多证据表明多分蘖矮秆表型与新发现
的植物激素独脚金内酯有关[8-9]。hw-1(t)作为调控独
脚金内酯合成前体类胡萝卜素的基因, 或许通过直
接影响类胡萝卜素含量而间接影响水稻独脚金内酯
合成, 从而调控植株形态构成。
本文对 hfa-1 突变体叶色白化转绿过程中的类
胡萝卜素生物合成途径及与该途径有关的植物激素
代谢途径的相关基因进行表达分析。在此基础上 ,
通过基因芯片技术分析 hfa-1突变体在白化、转绿 2
个时期的基因表达谱, 从整体水平上研究其代谢机
制和差异基因的功能, 为深入阐述 hw-1(t)调控矮秆
多蘖、白化转绿特异表型的机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 水稻材料
2003年利用返回式卫星搭载美国光身稻品种
Francis干种子于太空飞行18 d (卫星倾斜角度63°,
近地距离和高地距离分别为175 km和320 km, 辐射
剂量为2.656 mGy)。将空间诱变种子与对照一起萌
发, 移植M1代单株, 成熟时收获单株主穗, 混合主
穗种子得到M2代种子。移植M2代单株, 常规田间管
理, 在M2群体中发现一株白化转绿、多分蘖矮秆突
变体。经过连续4代的自交繁殖获得稳定突变株系,
命名为hfa-1。Francis为野生型(WT, wild-type)。
将hfa-1与野生型盆栽于人工气候箱中(光暗12 h /
12 h、温度25℃、湿度80%), 分别于二叶期、四叶期
取样, 每品种每次混取5株叶片(约200 mg), 3次重复。
然后迅速放入液氮冷冻, 置−70℃冰箱保存备用。
1.2 类胡萝卜素、植物激素生物合成相关基因的
RT-PCR和 QRT-PCR
用半定量RT-PCR方法, 分析已知水稻类胡萝卜
素、GA、ABA和SL生物合成途径部分相关基因在
hfa-1和野生型之间的表达差异。各组织总RNA提取
方法见文献[4]。以突变体和野生型叶片的第一链
cDNA为模板, 应用引物组合进行PCR扩增, 琼脂糖
凝胶电泳检测(引物信息见表1)。PCR程序为: 94 ℃
2 min; 94 30 s, 58 30 s, 72 30 s, ℃ ℃ ℃ 共30个循环;
最后72℃延伸7 min, 同时设定actin为内部参照。通
过调整模板浓度, 使各时期材料中actin的PCR扩增
产物量一致。
表 1 用于分析类胡萝卜素、植物激素生物合成相关基因的 RT-PCR引物
Table 1 RT-PCR Primers for analysis of genes related to carotenoid and hormones biosynthesis in rice
基因
Gene
正向引物序列
Forward primer (5′–3′)
反向引物序列
Reverse primer (5′–3′)
扩增产物大小
Amplicon size(bp)
OsPSY1 GGAGTATGCCAAGACCTTTTA AACACTCATTAGCCCCACAG 367
OsPSY2 TCTGGGCAATCTATGTATGG TCGCCTACGTCTCTGAGAAT 419
OsPDS CAGGTTGTTTGCCAGGACTT GTTCTGTATGTTGGGATAAGC 308
OsZDS TCGGGTGTTACAGCAATCTTT CCAATCGCTGAAACTTACATC 310
OsLCY AGGGAGTTCTTCTGCTTCGG CTTGCTGCTGCTAATGGTGT 395
OsCRTISO TGCTGAGTGCTTTATTGTGAG CAGGCAAAACTGAGGCTTTGA 412
OsCPS1 CTTGTTCTCCCCTTCAGCTA CTTGAACACACTTGGTGATAC 335
OsKS1 CGACTCTGTATTTCGTAGGAC TCAGTCCGAGAGTAGAACATG 348
OsZEP GTTGGTGATGATGCTATACTG AGATCAACGACGTTATCGCA 412
OsNCED1 ATAGTAGTTAGCCTCGGTCTT GAGCAAGAATCCCAAACTCTG 320
OsCCD7 GATGGTGGCTATGTTCTTCT GTAGTTATTTGGTTCCCCTGA 316
OsD3 AGGATAAGTGGGTTTCAGAC CGGGCTCCATTTGCTTACTT 373
Actin TCCTCTCTCTGTATGCCAGT CGGAAACGCTCAGCACCAAT 351
第 12期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体 hfa-1的基因表达谱分析 2125



同时用定量 QRT-PCR分析上述基因在 hfa-1突
变体和野生型之间的表达差异。采用 2×SYBRGreen
master mix荧光染料, 25 μL PCR体系, 设 3次重复,
荧光 PCR 反应在 CORBETT6200 定量 PCR 仪上进
行。程序为 95 30 s℃ 预变性, 之后 95 5 s, 58 30 s, ℃ ℃
72 30 s, ℃ 共 40个循环, actin为内参, 应用 2−ΔΔCT [10]
的方法计算基因表达量的相对变化 (引物信息见
表 2)。
表 2 用于分析类胡萝卜素、植物激素生物合成相关基因的 QRT-PCR引物
Table 2 QRT-PCR Primers for analysis of genes related to carotenoid and hormones biosynthesis in rice
基因
Gene
正向引物序列
Forward primer (5′–3′)
反向引物序列
Reverse primer (5′–3′)
扩增产物大小
Amplicon size(bp)
OsPSY1 GATACCATCTCCAAGTTTCC AACACTCATTAGCCCCACAG 152
OsPSY2 TCTGGGCAATCTATGTATGG CTACTGGAAACTTTGACACTG 179
OsPDS CAGGTTGTTTGCCAGGACTT TGCCAGATATTTTGCCGTTGA 170
OsZDS TCGGGTGTTACAGCAATCTTT GTTGGTTAGTTCGTAGGAATG 179
OsLCY CAGAGATAGGTGAGGTGAGG CTTGCTGCTGCTAATGGTGT 145
OsCRTISO TGCTGAGTGCTTTATTGTGAG CCCATCTGCCAAGGACATAG 144
OsCPS ACGAGAGATTGAACAGAACAT CTTGAACACACTTGGTGATAC 159
OsKS1 CGACTCTGTATTTCGTAGGAC GAACCACCACTGTGATGAACA 181
OsZEP GTTGGTGATGATGCTATACTG AGTTGCTTCTGATTGCCCGA 171
OsNCED1 ATAGTAGTTAGCCTCGGTCTT CCTCTTGGTTGCTCACTGGA 164
OsCCD7 GATGGTGGCTATGTTCTTCT GATGCTTGCTCTATGCTCATT 187
OsD3 GCTTTGTCTTCCAGGTGTAT CGGGCTCCATTTGCTTACTT 182
Actin TCCTCTCTCTGTATGCCAGT TGAATGAGTAACCACGCTCC 185

1.3 基因芯片杂交
使用Affymetrix公司水稻基因组芯片(GeneChip
Rice GenomeArray), 覆盖约51 279个转录本, 代表2
种水稻品系 , 其中大约48 564个粳稻转录本和1260
个籼稻转录本 , 芯片内2次重复。序列信息来源于
NCBI UniGene Build #52 (May 7, 2004)、GenBank和
TIGROs1 v2 data set (ftp.tigr.org, FASTA, 89.3 MB)。
芯片杂交工作由博奥生物芯片有限公司——生物芯
片北京国家工程研究中心完成。杂交工作基本流程
详见GeneChip Expression Analysis Technical Man-
ual。使用Affymetrix GeneChip Scanner 3000扫描芯
片, 及Affymetrix GeneChip Operating Software Ver-
sion 1.4 (GCOS 1.4)分析软件分析芯片图像, 把图像
信号转化为数字信号, 并用dChip软件做校正和归一
化处理。
1.4 基因芯片数据分析
选取2次重复表达差异两倍基因(即log2 Ratio ≥ 1
或log2 Ratio ≤−1)为显著差异的探针。通过Cluster
3.0对hfa-1与野生型在2个时期的差异表达探针及各
样品中有效的检测信号值进行聚类分析 , 采用
Hierachical、Average linkage、K-means算法进行聚
类, 分析芯片的重复性, 并在整体上分析全部基因
的表达模式。对于筛选出的基因, 利用分子功能注
释系统MAS3.0的基因组数据库 (http://www.capi-
talbio.com/zh-hans/support/MAS), 根据每个基因的
TIGR登录号寻找对应的功能注释。对于未知功能或
未被注释为基因的序列, 使用TIGR Plant Trans cript
Assemblies工具(http://plantta.tigr.org/)查找最长序列,
然后用NCBI blastX工具进行序列比对, 找出同源性
最高的大麦、水稻、玉米以及拟南芥基因, 从而推
测其功能, 并依此分类。
2 结果与分析
2.1 类胡萝卜素生物合成相关基因的表达分析
由于 hw-1(t)同源基因(拟南芥 IM和番茄 PTOX)
的分子功能都涉及到类胡萝卜素生物合成途径, 利
用 RT-PCR 和 QRT-PCR 检测了 hfa-1 6 个类胡萝卜
素生物合成基因在不同时期(二叶期和四叶期)的表
达差异(WT为对照)。6 个基因分别是八氢番茄红素
脱氢酶基因 OsPDS、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因 OsZDS、
类胡萝卜素异构酶基因 OsCRTISO、番茄红素环化酶
基因 OsLCY、八氢番茄红素合成酶基因 OsPSY1 和
OsPSY2。
RT-PCR 分析结果(图 1-A)表明, hfa-1 在二叶期
(白苗期)和四叶期(转绿后)的基因表达具有较大差
异, 二叶期 OsPSY1 和 OsLCY 的表达水平低于野生
2126 作 物 学 报 第 39卷


型; 转绿后 6个基因的表达和野生型无明显差异。
QRT-RCR表明, hfa-1二叶期类胡萝卜素合成相关基
因的 mRNA 转录水平仅为野生型的一半左右(图
1-B); 植株转绿后, hfa-1 各相关基因的表达量上调
并基本恢复至野生型水平, 其中 OsPSY2、OsPDS、
OsZDS 和 OsCRTISO 的 mRNA 转录水平甚至高于
WT (图 1-C)。上述结果表明 hw-1(t)基因抑制了二叶
期 hfa-1类胡萝卜素的生物合成。


图 1 类胡萝卜素生物合成相关基因在 hfa-1和野生型内的表达分析
Fig. 1 Expression analysis of genes related to carotenoid biosynthesis in the hfa-1 and WT
A: 半定量 RT-PCR表达分析结果; B, C: 白化和转绿后的定量 RT-PCR表达分析结果, 3次重复; actin为内参基因。
A: semi-quantitative expression analysis of hw-1(t) and genes involving in carotene biosynthesis; B and C: quantitative RT-PCR analysis of
hw-1(t) and genes involving in carotene biosynthesis, and PCR was repeated three times. OsActin was used for normalization as a control.

2.2 植物激素代谢途径相关基因的表达分析
类胡萝卜素的生物合成涉及多种植物生长发育
激素, 如赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)和独脚金内酯
(SL)等。在二叶期(白化)和四叶期(转绿) 2个时期, 对
参与 GA生物合成基因 OsCPS1(柯巴焦磷酸合成酶)
和 OsKS1 (内根-贝壳杉烯合成酶)、ABA生物合成基
因OsZEP1 (玉米黄质环氧化酶)和OsNCED1 (9-顺式
环氧类胡萝卜素双加氧酶 )、SL 生物合成基因
OsCCD7 (胡萝卜素裂解双加氧酶)和 SL信号传导基
因 OsD3 (含 LRR 与 F-box 结构域蛋白酶)进行表达
分析(图 2)。RT-PCR 结果表明, 与 WT 相比, hfa-1
中参与 GA 代谢途径基因 OsKS1, ABA 代谢途径基
因OsZEP1、OsNCED1和 SL代谢途径基因OsCCD7、
Os D3在白化时期的表达均明显下调。转绿后, hfa-1
多个基因表达上调, 除 OsNCED1 和 OsD3 外, 其余
基因的表达量与野生型接近。QRT-PCR结果也表现
了同样趋势, hfa-1 各基因的表达水平在白化时期仅
为野生型的 5%~88%, 其中 OsZEP、OsCCD7 和
OsD3的表达量分别比野生型下降 40%、95%和 40%;
转绿后, 除 OsD3基因表达量仍为WT的 40%, 其余
基因的表达量均接近野生型。上述结果说明 hw-1(t)
基因对 GA、ABA和 SL代谢途径产生影响, 特别是
对 OsD3基因表达具有长期的抑制作用。
2.3 基因芯片质量检测及基因表达比较
在二叶期(白化)、四叶期(转绿后)分别提取 hfa-1
和野生型 RNA 进行水稻叶片组织的基因表达谱变
化分析, 样品的 RNA 和芯片质量检测结果见表 3。
提取的总 RNA 完好, 28S 18S rRNA∶ 条带亮度大
第 12期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体 hfa-1的基因表达谱分析 2127



图 2 GA、ABA和 SL代谢途径相关基因在 hfa-1突变体和野生型的表达分析
Fig. 2 Expression analysis of genes in plant hormone metabolic pathway and hw-1(t) of the hfa-1 mutant and the wild-type at the
2nd-leaf stage (albino) and the 4th-leaf stage (green)
A: 半定量 RT-PCR表达分析结果; B, C: 白化和转绿后的定量 RT-PCR表达分析结果。
A: semi-quantitative expression of hw-1(t) and genes involving in plant hormone biosynthesis; B and C: quantitative RT-PCR analysis of
hw-1(t) and genes involving in plant hormone biosynthesis.
表 3 样品的 RNA和芯片质量检测结果
Table 3 Quality test of total RNA and chip signal
芯片序号
No. of chips
A260/A280 A260/A230
浓度
Content (μg μL−1)
总量
Total amount (μg)
检出率
Percent present (%)
效率得分
Scale factors
F1 2.05 1.30 1.44 280.6 44.92 2.85
F2 1.99 1.54 1.08 156.1 41.19 3.69
H1 2.06 1.49 1.37 265.7 45.67 3.02
H2 1.99 1.55 0.96 186.5 45.50 3.15

于或接近 2 1, ∶ A260/A280比值和 RNA总量均分别大
于 1.8 µg和 15.0 µg。芯片杂交的 Oligo B2、Poly-A
等阳性对照信号及 3′/5′比值正常, 基因检出率处正
常范围, 这些检测结果显示芯片结果可用于后续分
析。F1、F2代表野生型二叶期和四叶期; H1、H2代
表 hfa-1二叶期(白化)和四叶期(转绿后)。
图 3显示了 57195个表达探针的芯片信号强度
在 hfa-1突变体和野生型不同时期(二叶期、四叶期)
的差异变化。可见 , 在野生型 (F2/F1)或突变体
(H2/H1)中 , 绝大部分基因表达水平差异均不明显
(黑色部分)。以二叶期(白化)为参比, hfa-1突变体转
绿后上调表达的探针数目较多(红色区域较大), 而
下调表达的探针数目较少(绿色区域较小), 这与野
生型情况恰好相反。
2.4 差异表达基因的筛选
根据荧光强度比值, 分别筛选同一品种在不同
时期间的差异基因。选择表达差异两倍基因(即 log2
Ratio≥1 或 log2 Ratio≤−1)为显著差异的探针, 共涉
及 4 361个探针。通过 Cluster 3.0对 hfa-1与野生型
在 2个时期的差异表达探针进行聚类分析, 结果见
图 4-A。由于 hfa-1 在白化与转绿 2 个时期间差异表
达的基因源于两方面, 即由 hw-1(t)突变引起的在 2
2128 作 物 学 报 第 39卷



图 3 hfa-1突变体和野生型在不同时期的探针信号差异变化
Fig. 3 Scatter plots of signal intensities for all expressed probes on the Affymetrix microarray
F1、H1: 分别代表野生型和 hfa-1突变体在二叶期(白化); F2、H2: 分别代表野生型和 hfa-1突变体在四叶期(转绿后); 绿点代表基因
表达下调, 红点代表基因表达上调。
F1 and H1 indicate the wild-type and the hfa-1 mutant at 2nd-leaf stage (albino), respectively; F2 and H2 indicate the wild-type and the hfa-1
mutant at 4th-leaf stage (green), respectively. Green or red dots indicate the down or up regulation of gene expression, respectively.


图 4 差异探针的 Cluster聚类分析结果
Fig. 4 Clustering analysis of significant probes
绿色代表基因表达下调, 红色代表基因表达上调。
Green and red indicate the down-and up-regulation of gene expression, respectively.

个时期表达量不同的基因, 和水稻品种自身发育而
差异表达的基因。因此, 需要从 hfa-1和野生型两组
所有差异表达探针中, 筛选出变化趋势相异的探针,
即图中 Down和 Up所示部分(图 4-A)。与白化时期相
比, hfa-1 在叶色白化转绿过程中表达上调的探针数
为 868组, 下调探针数为 576组, 共 1444组(图 4-B)。
2.5 差异表达基因的功能分类
对筛选的差异表达基因进行功能注释和分类。
利用分子功能注释系统 MAS3.0 的基因组数据库
(http://www.capitalbio.com/zh-hans/support/MAS),
根据每个基因的 TIGR登录号寻找对应的功能注释。
功能注释结果显示, 大约 60%的基因可通过系统进
行功能分类。这些差异表达基因广泛参与了水稻生
理、发育、细胞、代谢、催化、蛋白结合以及外源
应激等生理生化过程。进一步分析可知, 在 hfa-1叶
色白化转绿过程中, 差异表达上调基因与下调基因
在功能模式上差异较大(图 5)。其中, 表达下调基因
主要与转录因子、谷胱甘肽转移酶(抗氧化)和核苷酸
活性等分子功能有关, 涉及生理过程主要有内源刺
激物和抗逆胁迫响应等方面。
2.6 光合作用差异表达基因的 Pathway构建
通过 KEGG 数据库对 hfa-1 叶色白化转绿过程
中差异表达基因进行 Pathways分析(表 4), 结果显示
hfa-1在 2个时期差异表达基因涉及光合作用、碳固
第 12期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体 hfa-1的基因表达谱分析 2129



图 5 转绿过程中 hfa-1突变体差异表达基因的功能分类(P<0.01)
Fig. 5 Functional classification of differentially expressed genes during the revertible green of the hfa-1 mutant (P<0.01)
表 4 KEGG代谢 Pathways分析(P<0.01)
Table 4 Metabolic Pathways identified by KEGG(P<0.01)
通路
Pathway
基因数
Count
P值
P-value
通路
Pathway
基因数
Count
P值
P-value
Photosynthesis 17 3.13E–29 Porphyrin and chlorophyll metabolism 3 5.73E–05
Carbon fixation 13 1.67E–22 Gamma–hexachlorocyclohexane degradation 3 1.51E–04
Nitrogen metabolism 6 4.71E–11 Glutamate metabolism 3 1.84E–04
Pentose phosphate pathway 5 2.43E–08 Ascorbate and aldarate metabolism 3 2.42E–04
Glycine, serine and threonine metabolism 5 2.43E–08 Proteasome 3 2.63E–04
Glycolysis; Gluconeogenesis 6 3.33E–08 Lysine biosynthesis 2 4.58E–04
Oxidative phosphorylation 6 2.41E–07 One carbon pool by folate 2 6.88E–04
Glyoxylate and dicarboxylate metabolism 4 3.09E–07 Protein export 2 2.75E–03
Fructose and mannose metabolism 4 1.38E–06 Fluorene degradation 2 3.00E–03
Biosynthesis of steroids 4 2.27E–06 Alanine and aspartate metabolism 2 3.26E–03
Flavonoid biosynthesis 3 6.81E–06 Limonene and pinene degradation 2 5.05E–03
Starch and sucrose metabolism 4 2.96E–05

定和氮代谢等多个反应通路, 所涉及基因数为 2~17
个。在各反应途径中, 以光合作用通路最为显著, 有
多个基因的表达发生很大变化, 这些基因与该通路
中的光反应中心、聚光色素复合体、细胞色素和辅
助因子等蛋白复合体组分合成代谢有关(表 5)。此外,
在该通路中除 V-ATPase基因外, 其余基因表达均上
2130 作 物 学 报 第 39卷


调。V-ATPase是液泡化型 H+-ATP合成酶, 其主要作
用是利用 ATP 水解产生的能量, 将质子从真核细胞
类囊体内跨膜转移到体外, 形成膜间质子梯度[11]。
V-ATPase基因表达下调, 可使 H+转运到细胞质的数
量减少, 降低 ATP 能量消耗, 从而尽量满足类囊体
内光合作用增强所需。
表 5 在芯片中表达差异显著的光合作用相关基因
Table 5 Differentially expressed genes associated with photosynthesis
基因名称
Gene name
功能描述
Description of function
基因名称
Gene name
功能描述
Description of function
Up-regulated genes Os08g0560900 Photosystem I reaction center subunit II (PsaD)
Os04g0235600 ATP synthase b chain Os07g0435300 Photosystem I reaction center subunit IV (PsaE)
Os12g0207500 ATP synthase beta chain Os09g0481200 Photosystem I reaction center subunit V (PsaV)
Os10g0355800 ATP synthase beta chain Os07g0148900 Photosystem I reaction center subunit psaK (PsaK)
Os07g0513000 ATP synthase gamma chain, chloroplast Os05g0560000 Photosystem I reaction center subunit VI (PsaH)
Os10g0527100 Chloroplast ATP synthase a chain precursor. Os12g0189400 Photosystem I reaction centre subunit N (PsaN)
Os02g0750200
Similar to chloroplast ATP synthase delta chain
precursor
Os03g0333400 Photosystem II Psb27 protein (A)
Os03g0278900 F-type H+-transporting ATPase subunit b Os01g0881600 Photosystem II reaction center J protein (PsbJ)
Os02g0750100 F-type H+-transporting ATPase subunit delta Os01g0773700 Photosystem II reaction center W protein (PsbW)
Os08g0104600 Ferredoxin I, chloroplast precursor (PetF) Os02g0578400
Photosystem II oxygen evolving complex protein
PsbQ family
Os06g0107700 Ferredoxin--NADP reductase2, leaf isozyme
(FNR2)(PetH)
Os01g0869800 Photosystem II subunit PsbS
Os02g0103800 Ferredoxin--NADP reductase1, leaf isozyme
(FNR1)(PetH)
Os08g0119800 Photosystem II core complex proteins psbY
(psbY-A1)
LOC_Os10g21290 Apocytochrome f precursor (PetA) Os01g0938100 Photosystem II protein PsbW, class I family
protein
LOC_Os03g55720 Cytochrome b6f complex subunit (PetB) Os04g0690800 22 kD protein of photosystem II (OsPsbS2)
LOC_Os07g37030
Cytochrome b6 f complex iron sulfur subunit
(PetC)
Os07g0141400 23 kD polypeptide of photosystem II (PsbP1)
LOC_Os01g57945 Cytochrome b6-f complex subunit 4 (PetD) Down-regulated genes
Os01g0501800 Oxygen-evolving enhancer protein 1(OEE1)
(PSbO)
Os06g0662000 Vacuolar H+-ATPase subunit A (V-ATPase)
Os01g0792400 Photosystem I assembly protein ycf4

对差异表达基因进一步进行光合作用 Pathway
构建, 由图 6可知, 该通路中的两个光反应中心 PSI
和 PSII、细胞色素 Cytb6/f、ATP合成酶以及辅助因
子等蛋白复合体组分合成基因多为上调表达。
Cytb6/f 复合体是一种存在于类囊体膜间的蛋白质,
主要催化 PQH2氧化和 PC 还原, 并把质子从类囊体
膜间质中跨膜运输到膜内腔中。通过查询水稻基因
芯片探针数据库 (http://www.ricechip.org/), 获得与
Cytb6/f 复合体组分有关的水稻基因芯片探针 7 个,
其功能注释仅涉及 PetA、PetB、PetC 和 PetD。进
一步对这些探针在 hfa-1 与野生型中的表达进行分
析(表6), 与野生型相比, hfa-1在白化转绿过程中参
与 Cytb6/f 复合体组分合成的相关基因表达均明显
上调, 其差异表达倍数比野生型高出 0.29~4.90倍。
此结果暗示, 在 hfa-1 叶色白化转绿过程中, 很有
可能存在通过提高 Cytb6/f 蛋白复合体活性替代
hw-1(t)基因功能以调节电子传递和质醌库还原氧
化的机制。
2.7 芯片结果与定量 RT-PCR结果相关性分析
为了验证基因芯片的结果, 以定量 RT-PCR 分
析 hfa-1 和野生型在二叶期(白化)、四叶期(转绿后)
的类胡萝卜素及植物激素生物合成相关基因, 与基
因芯片结果进行相关性分析(图 7)。结果显示, 定量
RT-PCR结果与基因芯片两样本间相关系数为 0.409,
达显著水平, 表明两者趋势基本一致。在进行定量
RT-PCR的 26个基因差异表达结果中有 20个结果与
芯片实验结果相近, 仅其余 6个结果差异较大, 这可
能是因为 RT-PCR 方法为定量, 而基因芯片方法是
定性, 两者在信号强度和基因转录丰度上线性关系
拟合度不高。
第 12期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体 hfa-1的基因表达谱分析 2131



图 6 光合作用差异表达基因的 Pathway图
Fig. 6 Differentially expressed genes related to photosynthesis Pathways
表 6 转绿过程中 hfa-1突变体与 WT的 Cytb6/f复合体组分合成基因的差异表达分析
Table 6 Analysis of differentially expressed genes of cytochrome b6/f complex during the revertible green of the hfa-1 mutant
差异表达倍数 Fold 探针号
Probe set ID
代表基因功能注释
Annotation F2/F1 H2/H1
倍数差值
Fold change
Os.29056.1.S1_s_at Apocytochrome f precursor, PETA 1.01 5.91 4.90
OsAffx.32260.1.A1_at Apocytochrome f precursor, PETA 0.91 1.35 0.44
OsAffx.32260.1.S1_at Apocytochrome f precursor, PETA 0.94 2.72 1.78
Os.12837.1.S1_at Cytochrome b6/f complex subunit, PETB 1.19 3.21 2.02
Os.2248.1.S1_at Cytochrome b6/f complex iron sulfur subunit, PETC 1.60 3.18 1.58
OsAffx.32330.1.A1_at Cytochrome b6/f complex subunit 4, PETD 1.13 1.42 0.29
OsAffx.32330.1.S1_x_at Cytochrome b6/f complex subunit 4, PETD 1.68 2.06 0.38


图 7 类胡萝卜素与植物激素生物合成相关基因的基因芯片与
定量 RT-PCR结果的相关分析(r0.05, 24 = 0.388; r0.01, 24 = 0.496)
Fig. 7 Correlation analysis of expression ratios measured by
quantitative RT-PCR and microarray in the selected 13 genes
associated with biological synthesis of carotenoids, GA, ABA, and SL
3 讨论
前期研究表明 hw-1(t)与拟南芥叶色花斑基因 im
同源。拟南芥 IMMUTANS(IM)基因突变引起的叶片
花斑是目前研究最为深入的一类植物叶色突变, 早
在孟德尔遗传学时期就发现此类突变[12]。拟南芥 im
突变体于 1963年首次被分离鉴定, 研究结果显示 im
突变体属隐性核遗传突变体, 具有白绿相间的嵌合
叶色表型[13-15]。通过图位克隆和转座子标签法, 拟
南芥 IM基因被成功克隆[16-18]。在番茄中, IM的同源
2132 作 物 学 报 第 39卷


基因 PTOX 突变导致部分叶片白化, 并造成果实缺
乏类胡萝卜素 [19-20]。与拟南芥及番茄相比, hw-1(t)
由于碱基突变导致蛋白质翻译提前终止, 形成不具
备功能的残缺多肽。推测 hw-1(t)可能对类胡萝卜素
及其次生代谢途径造成显著影响。
高等植物类胡萝卜素生物合成的前体是含有
CS 的异戊二烯焦磷酸(IPP)[21]。IPP 在 IPP 异构酶
(IPPI)、垅牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)、八氢番茄红
素合成酶(phytoenesynthase, PSY)的催化下形成八氢
番茄红素(Phytoene)[22]。八氢番茄红素在八氢番茄红
素脱氢酶(PDS)、ξ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和类胡萝
卜 素 异 构 酶 (CRTISO) 催 化 下 形 成 番 茄 红 素
(Lyeopene)[23]。番茄红素由番茄红素 β-环化酶 (β-
LCY)和番茄红素 ε-环化酶(ε-LCY)共同催化生成 α-
胡萝卜素[24], 进一步由酶催化形成含氧类胡萝卜素。
类胡萝卜素在类胡萝卜素裂解双氧合酶(Carotenoid
cleavage dioxygenase, CCD)作用下生成多种生物活性
物质, 如 ABA、SL、植物生长调节因子等[25]。八氢
番茄红素去饱和环化反应是类胡萝卜素生物合成的
关键环节, hw-1(t)基因的突变有可能导致二叶期八
氢番茄红素去饱和途径电子传递受阻, 造成类胡萝
卜素合成减少, 缺少类胡萝卜素保护的叶绿体被单
线态氧破坏, 产生叶片白化表型。本研究中类胡萝
卜素相关基因的表达结果证实了上述推测, hfa-1 二
叶期类胡萝卜素合成相关基因的 mRNA转录水平仅
为野生型的一半左右, 而四叶期各相关基因的表达
量上调并基本恢复至野生型水平, 这与 hfa-1二叶期
白化、四叶期复绿的表型是相符的。
由于类胡萝卜素是多种激素合成的前体, 推测
hw-1(t)基因可能对赤霉素、脱落酸和独角金内酯代
谢途径产生影响。本研究中, hfa-1 中参与 GA 代谢
途径基因 OsKS1, ABA 代谢途径基因 OsZEP1、
OsNCED1和 SL代谢途径基因 OsCCD7、OsD3在白
化时期的表达均明显下调, 此结果与前人对拟南芥
pds突变体的研究报道相似[26]。拟南芥 T-DNA突变
体 pds编码八氢番茄红素合成酶的 PDS基因发生变
化 , 其植株叶片出现白化 , 叶绿体发育受阻 , 同时
植株矮化。对 pds 突变体类胡萝卜素及其相关代谢
途径分析发现, 涉及类胡萝卜素、叶绿素和赤霉素
生物合成基因的表达均受抑制[27]。通过两结果的比
较, 可推测 hw-1(t)基因的作用机制与 PDS基因相类
似, 即通过反馈机制对不同次生代谢途径的基因表
达产生影响。但 hw-1(t)突变对其他表型的影响与拟
南芥和番茄不尽相同, 最明显的区别在于拟南芥和
番茄没有出现多分枝现象。造成这种差异的原因可
能是单子叶植物与双子叶植物进化差异 ; 此外 ,
hfa-1四叶期(转绿后)多个基因表达量与野生型接近,
但 OsD3表达量仍然较低, 这暗示 hw-1(t)基因对 SL
的信号传导具有长期的抑制作用, 而 SL传导受阻将
减少对分蘖芽的抑制, 从而产生多分蘖的表型。综
上所述 , 除类胡萝卜素生物合成外 , hw-1(t)及其同
源基因在水稻的发育中具有更广泛的作用。
对 hfa-1 叶色白化转绿过程的调控基因进行筛
选, 发现大多数在白化时期相对表达量较高的基因
均与蛋白翻译、细胞分裂以及抗逆胁迫相关。hfa-1
在二叶期由于叶片白化、光合色素含量低而不能进
行有效的光合作用, 导致植株体内的代谢物质和能
量缺乏, 而这些与蛋白翻译、细胞分裂以及抗逆胁
迫有关基因的表达上调, 有利于协调胁迫应激的解
除和幼苗快速生长。其中, 参与 Cytb6/f复合体组分
合成的相关基因表达均明显上调, 其差异表达倍数
比野生型高出 0.29~4.90 倍。Cytb6/f 复合体作为连
接光系统 PSII 和 PSI 的中间电子载体, 能均衡两个
光系统间的电子传递。当一个光系统受损时, 能使
另一光系统的电子传递仍然进行, 并使多个 PSII 复
合体与质醌库联系, 使类囊体膜上的电子传递成网
络式[28-31]。在 hfa-1叶色白化转绿过程中, 很可能存
在通过提高 Cytb6/f 蛋白复合体活性替代 hw-1(t)基
因功能以调节电子传递和质醌库还原氧化的机制。
此外, Miura 等[31]对拟南芥 im 突变体绿白嵌合
叶片的绿斑部分与野生型绿色叶片进行基因表达谱
比较, 发现 im突变体叶片绿斑部分的光合基因表达
并未发生明显的变化, 而与细胞壁合成相关基因却
显著下调, 认为这可能与向白斑部分转运更多的蔗
糖或己糖, 以维持白斑部分生长有关。但本研究的差
异表达基因 Pathways 分析结果显示, hfa-1 叶色白化
转绿过程中差异表达基因主要涉及光合作用、碳固定
和氮代谢。从能量供应的角度看, 这 3种代谢途径是
能够相互转化和调节的。在 hfa-1叶色白化转绿过程
中涉及 3种代谢途径的大多数基因表达上调, 可促进
突变体植株体内对营养物质的摄取和能量的储存。然
而 , 要探讨这些代谢途径相关基因的表达是否与
hfa-1突变体特异表型相关, 还需进一步的实验验证。
4 结论
类胡萝卜素、植物激素(GA、ABA 和 SL)生物
第 12期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体 hfa-1的基因表达谱分析 2133


合成相关基因在 hfa-1 突变体白化期叶片中表达量
减低, 表明 hw-1(t)基因的突变抑制了苗期类胡萝卜
素合成, 同时还对涉及该过程相关多个次生代谢途
径产生影响。hfa-1叶色白化转绿过程中上调和下调
表达基因涉及的生理过程主要是光合作用、内源刺
激物及抗逆胁迫的响应等。差异表达基因显著涉及
光合作用通路, 且电子传递体 Cytb6/f复合蛋白合成
相关基因在 hfa-1 叶色白化转绿过程中上调表达明
显, 推测 Cytb6/f蛋白复合体在电子传递和质醌库还
原氧化上对 hw-1(t)起补偿功能。
References
[1] Wu Z, Zhang X, He B, Sheng S, Wang J, Guo X, Su N, Wang L,
Jiang L, Wang C, Zhai H, Wan J. A chlorophyll-deficient rice
mutant with impaired chlorophylide esterification in chlorophyll
biosynthesis. Plant Physiol, 2007, 145: 29–40
[2] Fang J, Chai C, Qian Q, Li C, Tang J, Sun L, Huang Z, Guo X,
Sun C, Liu M, Zhang Y, Lu Q, Wang Y, Lu C, Han B, Chen F,
Cheng Z, Chu C. Mutations of genes in synthesis of the carote-
noid precursors of ABA lead to preharvest sprouting and photo-
oxidation in rice. Plant J, 2008, 54: 177–189
[3] Guo T(郭涛), Huang X(黄宣), Huang Y-X(黄永相), Liu Y-Z(刘
永柱), Zhang J-G(张建国), Chen Z-Q(陈志强), Wang H(王慧).
Characterizations of a mutant gene hw-1(t) for green-revertible
albino, high tillering and dwarf in rice (Oryza sativa L.). Acta
Agron Sin (作物学报), 2012, 38(1): 23–35(in Chinese with Eng-
lish abstract)
[4] Guo T(郭涛), Huang Y-X(黄永相), Huang X(黄宣), Liu Y-Z(刘
永柱), Zhang J-G(张建国), Chen Z-Q(陈志强), Wang H(王慧).
Map-based cloning of a green-revertible albino and high-tillering
dwarf gent hw-1(t) in rice. Acta Agron Sin (作物学报), 2012,
38(8): 1397–1406(in Chinese with English abstract)
[5] Carol P, Stevenson D, Bisanz C, Breitenbach J, Sandmann G,
Mache R, Coupland G, Kuntz M. Mutations in the Arabidopsis
gene immutans cause a variegated phenotype by inactivating a
chloroplast terminal oxidase associated with phytoene desatura-
tion. Plant Cell, 1999, 11: 57–68
[6] Wu D, Wright D A, Wetzel C, Voytas D F, Rodermel S. The
IMMUTANS variegation locus of Arabidopsis defines a mito-
chondrial alternative oxidase homolog that functions during early
chloroplast biogenesis. Plant Cell, 1999, 11: 43–55
[7] Chappell J. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid
biosynthetic pathway in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant
Mol Biol, 1995, 46: 521–547
[8] Beveridge C A, Kyozuka J. New genes in the strigolactone-
related shoot branching pathway. Curr Opin Plant Biol, 2010, 13:
34–39
[9] Domagalska M A, Leyser O. Signal integration in the control of
shoot branching. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12: 211–221
[10] Nakatsuka T, Nishihara M, Mishiba K, Yamamura S. Temporal
expression of flavonoid biosynthesis-related genes regulates
flower pigmentation in gentian plants. Plant Sci, 2005, 168:
1309–1318
[11] Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H. The
cellular biology of proton-motive force generation by V-ATPases.
J Exp Biol, 2000, 203: 89–95
[12] Yu F, Fu A, Aluru M, Park S, Xu Y, Liu H, Liu X, Foudree A,
Nambogga M, Rodermel S. Variegation mutants and mechanisms
of chloroplast biogenesis. Plant Cell Environ, 2007, 30: 350–365
[13] Rédei G P. Somatic instability caused by a cysteine-sensitive
gene in Arabidopsis. Science, 1963, 139: 767–769
[14] Chung S C, Rédei G P. An anomaly of the genetic regulation of
the de novo pyrimidine pathway in the plant Arabidopsis. Bio-
chem Genet, 1974, 11: 11441–11453
[15] Wetzel C M, Jiang C Z, Meehan L J, Voytas D F, Rodermel S R.
Nuclear-organelle interactions: the immutans variegation mutant
of Arabidopsis is plastid autonomous and impaired in carotenoid
biosynthesis. Plant J, 1994, 6: 161–175
[16] Carol P, Stevenson D, Bisanz, C, Breitenbach J, Sandmann G,
Mache R, Coupland G, Kuntz M. Mutations in the Arabidopsis
gene immutans cause a variegated phenotype by inactivating a
chloroplast terminal oxidase associated with phytoene desatura-
tion. Plant Cell, 1999, 11: 57–68
[17] Wu D, Wright D A, Wetzel C, Voytas D F, Rodermel S. The
IMMUTANS variegation locus of Arabidopsis defines a mito-
chondrial alternative oxidase homolog that functions during early
chloroplast biogenesis. Plant Cell, 1999, 11: 43–55
[18] Lennon A M, Prommeenate P, Nixon P J. Location, expression
and orientation of the putative chlororespiratory enzymes, Ndh
and IMMUTANS, in higher-plant plastids. Planta, 2003, 218:
254–260
[19] Josse E M, Simkin A J, Gaffé J, Labouré A M, Kuntz M, Carol P.
A plastid terminal oxidase associated with carotenoid desatura-
tion during chromoplast differentiation. Plant Physiol, 2000, 123:
1427–1436
[20] Barr J, White W S, Chen L, Bae H, Rodermel S. The GHOST
terminal oxidase regulates developmental programming in tomato
fruit. Plant Cell Environ, 2004, 27: 840–852
[21] Eisenreich W, Bacher A, Arigoni D, Rohdich F. Biosynthesis of
isoprenoids via the non-mevalonate pathway. Cell Mol Life Sci,
2004, 61: 1401–1426
[22] Armstrong G A. Eubacteria shows their true colors: genetics of
carotenoid pigment biosynthesis from microbes to plants. J Bac-
teriol, 1994, 176: 4795–4802
[23] Park H, Kreunen S S, Cuttriss A J, DellaPenna D, Pogson B J.
Identification of the carotenoid isomerase provides insight into
carotenoid biosynthesis, prolamellar body formation, and photo-
morphogenesis. Plant Cell, 2002, 14: 321–332
[24] Cunningham F X, Gantt E. Idenification of multi-gene families
encoding isopentenyl diphosphate isomerase in plants by het-
erologous complementation in Escherichia coli. Plant Cell
2134 作 物 学 报 第 39卷


Physiol, 2000, 41: 119–123
[25] Auldridge M E, Mccarty D R, Klee H J. Plant carotenoid clea-
vage oxygenases and their apocarotenoid products. Curr Opin
Plant Biol, 2006, 9: 315–321
[26] Qin G, Gu H, Ma L, Peng Y, Deng X W, Chen Z, Qu L. Dis-
ruption of phytoene desaturase gene results in albino and
dwarf phenotypes in Arabidopsis by impairing chlorophyll,
carotenoid, and gibberellin biosynthesis. Cell Res, 2007, 17:
471–482
[27] Pyke K A, Leech R M. Chloroplast division and expansion is
radically altered by nuclear mutations in Arabidopsis thaliana.
Plant Physiol, 1992, 99: 1005–1008
[28] Pyke K A, Leech R M. A genetic analysis of chloroplast division
and expansion in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol, 1994, 104:
201–207
[29] Joët T, Genty B, Josse E M, Kuntz M, Cournac L, Peltier G.
Involvement of a plastid terminal oxidase in plastoquinone oxida-
tion as evidenced by expression of the Arabidopsis thaliana en-
zyme in tobacco. J Biol Chem, 2002, 277: 31623–31630
[30] Casano L M, Zapata J M, Martin M, Sabater B. Chlororespiration
and poising of cyclic electron transport. J Biol Chem, 2000, 275:
942–948
[31] Miura E, Kato Y, Sakamoto W. Comparative transcriptome
analysis of green/white variegated sectors in Arabidopsis yellow
variegated 2: responses to oxidative and other stresses in white
sectors. J Exp Bot, 2010, 61: 2433–2445