全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(7): 10171026 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因新品种生物培育科技重大专项(2014ZX08002-002)和北京市科技计划项目(Z141100002314018)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈明, E-mail: chenming02@caas.cn, Tel: 13683360891
第一作者联系方式: E-mail: huliqin_2012@163.com, Tel: 13051859528
Received(收稿日期): 2015-01-14; Accepted(接受日期): 2015-04-02; Published online(网络出版日期): 2015-04-17.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150417.0930.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01017
谷子非特异性磷脂酶 C基因 SiNPC4的克隆及功能分析
胡利芹 1 薛飞洋 1,2 李微微 1,3 王二辉 1,2 徐兆师 1 李连城 1 周永斌 1,2
贾冠清 1 刁现民 1 马有志 1 陈 明 1,*
1 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室, 北
京 100081; 2 西北农林科技大学农学院 / 旱区作物逆境生物学国家重点实验室, 陕西杨凌 712100; 3 哈尔滨师范大学生命科学与技术
学院 / 黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150025
摘 要: 非特异性磷脂酶 C (NPC, nonspecific phospholipase C)水解磷脂酰胆碱或磷脂酰乙醇胺产生第二信使二酰甘
油(DAG), NPC类基因在植物处于干旱、高盐、低磷等非生物胁迫条件下时发挥重要的作用, 并参与脱落酸(ABA)、
油菜素内酯(BL)等激素信号传导途径。本研究以谷子品种龙谷 25为试验材料, 通过序列比对, 克隆到一个新的 NPC
类基因, 命名为 SiNPC4。该基因被定位在谷子第 8条染色体上, 编码区全长 2877 bp, 由 3个外显子和 2个内含子组
成, 编码 512 个氨基酸, 蛋白分子量为 56.77 kD。系统进化树分析表明该基因位于 NPC 基因家族第 3亚族, 保守结
构域分析表明该蛋白含有保守的磷脂酶结构域和 4个基序。亚细胞定位结果显示, SiNPC4蛋白被定位在细胞质、细
胞膜、细胞核中。基因表达谱分析结果表明, 该基因主要在谷子根部表达, 并受干旱、盐、低温、黑暗、ABA、BL、
赤霉素(GA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等的诱导表达。将 SiNPC4 基因转入拟南芥中, 转基因拟南芥与野生型拟南芥相比
对 ABA和 BL激素的敏感性降低, 推测该基因可能作为负调控因子参与植物对 ABA和 BL激素的响应过程。在干旱
和高盐处理下, 过表达植株与野生型植株长势没有明显差异。
关键词: 谷子; SiNPC4; 逆境胁迫; ABA; BL
Cloning and Functional Analysis of Nonspecific Phospholipase C Gene SiNPC4
in Foxtail Millet (Setaria italic)
HU Li-Qin1, XUE Fei-Yang1,2, LI Wei-Wei1,3, WANG Er-Hui1,2, XU Zhao-Shi1, LI Lian-Cheng1, ZHOU
Yong-Bin1,2, JIA Guan-Qing1, DIAO Xian-Min1, MA You-Zhi1, and CHEN Ming1,*
1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement /
Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China; 2 College of Agronomy,
Northwest A&F University / State Key Laboratory of Arid Region Crop Adversity Biology, Yangling 712100, China; 3 Key Laboratory of Molecular
Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province / College of Life Science and Technology, Harbin Normal University, Harbin 150025,
China
Abstract: Nonspecific phospholipase C (NPC) catalyzes the hydrolysis of phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine to
generate diacylglycerol (DAG), which is an important second messenger in cells. NPC family plays a key role in response to some
stresses such as drought, high salinity and phosphorus deficiency, and is involved in some hormone signaling pathways such as
abscisic acid (ABA) and brassinolide (BL). Taking foxtail millet as material, we cloned a novel NPC gene named SiNPC4 by se-
quence alignment. This gene was detected to be located on chromosome 8. The full length of SiNPC4 was 2877 bp with three
exons and two introns encoding 512 amino acid residues and the protein molecular weight was 56.77 kD. Phylogenetic analysis of
NPC protein sequences indicated that SiNPC4 distributed to the third subfamily. The predicted protein structure of the gene con-
tained conserved phosphoesterase domain and four motifs. The protein subcellular localization analysis revealed that SiNPC4 was
localized in cytomembrane, cytoplasm, and nucleus. The gene expression profile results indicated SiNPC4 mainly expressed in
root and was induced by drought, salt, cold, dark, ABA, BL, methyl jasmonate (MeJA), and gibberellic acid (GA) treatments.
1018 作 物 学 报 第 41卷


Arabidopsis carrying SiNPC4 decreased the sensitivity to ABA and BL compared with WT. Thus, we deduced that SiNPC4 may
act as a negative regulator in ABA and BL signaling pathways. Besides, there were no significant difference in growth between
transgenic and wild type plants under drought and high salinity treatments.
Keywords: Foxtail millet; SiNPC4; Abiotic stress; ABA; BL
磷脂酶是一类磷脂水解酶, 根据水解磷脂位点
的不同主要分为3个家族(磷脂酶A、磷脂酶C和磷脂
酶D)[1], 在响应植物生物和非生物胁迫信号转导途
径中发挥重要作用[2-4]。其中, 磷脂酶C (PLC)依水解
底物不同分为特异性水解磷脂酰肌醇磷脂酶C
(PI-PLC)和非特异性磷脂酶C (NPC)[5]。NPC类磷脂
酶是在植物中发现的与细菌PC-PLC同源的新型磷
脂酶[6-7], 拟南芥和水稻中分别有6个和5个NPC类磷
脂酶基因[6,8]。研究表明, NPC类基因在不同处理条
件下的表达模式不同, 分别参与不同生长发育和逆
境响应过程。在拟南芥中, AtNPC1在各个器官的表
达量相当 , AtNPC2和AtNPC6在角果中表达最高 ,
AtNPC3主要在根部表达, AtNPC4主要在成熟的叶片
和根部表达, AtNPC5主要在花序中表达。AtNPC4对
ABA信号途径起正向调控作用 [7], 在拟南芥中过表
达AtNPC4植物对干旱和高盐胁迫的抗性增强 [7,9]。
AtNPC3和AtNPC4受低磷胁迫诱导表达 , 并且参与
生长素(IAA)和油菜素内酯(BL)介导的根系生长发
育过程 [6,10]。 AtNPC5在低盐胁迫下表达显著上调 ,
促进侧根生长[11]。在水稻中, OsNPC1在盐胁迫条件
下表达上升 , 低温条件下表达下降 ; OsNPC2和
OsNPC4均受盐和干旱诱导表达; OsNPC5受低温和
干旱诱导表达下调; OsNPC3表达不受干旱、低温和
高盐胁迫的影响; OsNPC2、OsNPC4和OsNPC5在生
殖发育阶段表达上调 ; 在种子发育的晚期 , 只有
OsNPC4表达持续增加 ; 圆锥花序阶段 , 只有
OsNPC1表达下调。此外, NPC类蛋白的亚细胞定位
也不相同, AtNPC5定位在胞质[12], AtNPC4定位在质
膜上[6], OsNPC1主要定位在细胞质, OsNPC3定位在
叶绿体中[8]。
谷子具有抗旱、耐贫瘠、适应性广等特点 [13],
是单子叶作物抗逆研究的理想材料之一。并且谷
子基因组序列的公布为我们进一步解析谷子逆境
应答分子机制创造了条件 [14-15]。目前 , 关于谷子
NPC家族的研究尚未见报道。本研究利用生物信息
学方法从谷子基因组中获得5个NPC类基因 , 对其
基因结构、染色体分布、蛋白序列特征以及系统
进化关系进行了系统分析 , 并克隆到一个与拟南
芥AtNPC4同源的基因SiNPC4。鉴于该基因受不同
逆境胁迫和激素处理的诱导表达 , 将其构建到过
表达载体上转化拟南芥验证其功能。通过对过表
达该基因的拟南芥植株对ABA、BL、PEG和NaCl
等的响应 , 探讨了SiNPC4在ABA等激素信号传导
过程和逆境胁迫抗性中的作用。本研究为进一步
阐明谷子NPC家族在其抗逆响应过程中发挥的作
用提供了依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料与试剂
谷子品种龙谷25种子由中国农业科学院作物科
学研究所刁现民研究员课题组提供 , 拟南芥
Columbia野生型(WT)种子、农杆菌GV3101菌株、
163hGFP载体和带有 CaMV35S启动子无 GUS的
pBI121载体由本实验保存。植物总RNA提取试剂盒、
FastQuant RT Super Mix反转录试剂盒和Real Master
Mix (SYBR Green)试剂盒购自天根生化公司。脱落
酸(ABA)、油菜素内酯(BL)、赤霉素(GA)、茉莉酸
甲酯(MeJA)、利福平和卡那霉素购自拜耳迪公司 ,
DNA聚合酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase、
In-Fusion HD Cloning System试剂盒购于TaKaRa公
司; 试验中使用的各种引物由北京奥科生物技术公
司合成并由其完成各种测序工作。
1.2 材料处理
在温度 22℃, 相对湿度 65%, 光照周期 16 h/8 h
的温室环境中培养谷子和拟南芥幼苗。基因表达谱
分析参考霍冬英等[16]和闵东红等[17]的处理方法, 取
三叶一心期长势一致的谷子幼苗分别进行干旱(6%
PEG-6000)、NaCl (100 mmol L–1)、低温(4℃)、黑暗、
ABA (100 μmol L–1)、BL (100 μmol L–1)、GA (100
μmol L–1)和 MeJA (100 μmol L–1)等水培处理。除了
黑暗处理在 0 h和 48 h取样以外, 其他均在处理后
的 0、1、6和 24 h取整个植株, 所有样品置液氮速
冻, –80℃保存备用。
1.3 谷子 NPC基因家族生物信息学分析
参考已报道的拟南芥NPC4 (AT3G03530)的蛋
白质序列 (http://www.uniprot.org/), 在谷子基因组
数据库 (Phytozome v10.0.4)中进行BlastP比对 , 搜
索可能的谷子NPC家族成员 ; 用Pfam (http://pfam.
第 7期 胡利芹等: 谷子非特异性磷脂酶 C基因 SiNPC4的克隆及功能分析 1019


xfam. org/)和InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)
数据库分析蛋白质的保守结构域 , 用在线工具
MEME (Multiple Em for Motif Elicitation)和ScanProsite
tool (http://prosite.expasy.org/scanprosite/)分析蛋
白质的motif序列 , 用 SignalP 4.1 Server (http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白质的信
号肽 , 用Compute pI/Mw tool (http://expasy.org/
tools/)计算蛋白质的分子量和等电点 , 用GSDS在
线工具 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因结构 ,
利用 ClustalX 2.0进行多序列比对 , 并用软件
MEGA 5.1以相邻法(Bootstrap设为1000)构建系统
进化树。
1.4 RNA提取和 Real-time PCR分析
采用植物总RNA提取试剂盒提取1.2中各样品
以及谷子幼苗的根、茎和叶的总 RNA, 按照
FastQuant RT Super Mix反转录试剂盒说明书的要求
合成cDNA。使用Real Master Mix (SYBR Green)试剂
盒, 荧光定量PCR仪(ABI7500)进行Real-time PCR扩
增。以SiActin (Si001873m.g)为内参(表1)。25 μL反应
体系含2×SuperReal PreMix Plus1 2.5 μL, 正向引物
和反向引物(10 μmol L–1)各0.75 μL, cDNA模板(约
120 ng μL–1) 1 μL, 50×ROX Reference Dye 0.5 μL,
ddH2O 9.5 μL。采用3步法反应程序, 95℃ 5 min; 95
℃ 10 s, 60℃ 20 s, 72℃ 32 s, 40个循环。根据各样
品特定荧光阈值下的Ct值,采用2–ΔΔCt法计算基因在
不同样品中的相对表达量
1.5 SiNPC4基因克隆和表达载体构建
设计 SiNPC4 基因引物 SiNPC4-F 和 SiNPC4-R
(表 1), 以谷子品种龙谷 25 的 cDNA 为模板扩增
SiNPC4 基因的完整编码框。采用 In-Fusion 重组
酶技术将测序正确的目的基因分别构建到 163hGFP
和带有 CaMV35S 启动子的 pBI121 载体上(表 1)。
1.6 SiNPC4蛋白亚细胞定位
以生长 2 周的谷子叶片为材料, 参考 Yoo 等[18]
的方法进行原生质体制备和转化, 25℃培养 16 h以
后 , 在激光共聚焦荧光显微镜(Zeiss LSM700)下观
察蛋白亚细胞定位情况。
1.7 拟南芥转化及转基因纯合植株的获得
参考 Clough等[19]的方法进行 SiNPC4基因的拟
南芥遗传转化, 将收获的 T0代拟南芥种子种于含卡
那霉素(50 mg L–1)的 MS培养基上进行筛选, 获得 2
个转基因株系 OE3 和 OE4, 经筛选和扩繁后, 选择
纯合的 T3代种子进行功能分析。
1.8 SiNPC4转基因拟南芥的处理条件
将拟南芥野生型及转基因株系OE3和OE4种子
经 70%的无水乙醇处理 3 min、1%的 NaClO溶液浸
泡 15 min、ddH2O 漂洗 3 次后, 点播于 MS 培养基
上, 4℃春化 3 d后于 1.2中的环境下培养。参考 Peters
等[7]和 Wimalasekera 等[10]的处理方法, 将生长 4 d
长势一致的 WT、OE3和 OE4的幼苗移至分别含有
25和 35 μmol L–1 ABA、0.01和 1.00 μmol L–1 BL、
4%和 6% PEG、100和 150 mmol L–1 NaCl的 MS培
养基方皿上, 对照为MS培养基, 每个处理每个株系
各放 4棵幼苗。生长 7 d后在 EPSON Flatbed Scanner
EPSON Expression 10000XL扫描仪上用WINRHIZO
proLA2400 软件对各种处理下的幼苗进行根系扫描,
测量根长和根系表面积, 采用单因素方差分析法统
计分析数据, 用 GraphPad Prism 5软件作图。
2 结果与分析
2.1 谷子 NPC基因家族特性分析
利用拟南芥 AtNPC4 保守区氨基酸序列对谷子
基因组数据库进行 BlastP 比对, 获得 5 个谷子 NPC
类基因, 分别命名为 SiNPC1-5 (表 2), 5个 NPC类基
因之间核酸序列和基因结构变化较大 , 其中 ,
SiNPC2最长, 为 4959 bp, 包含 4个外显子; SiNPC3
最短, 为 1629 bp, 只有 1 个外显子(图 1-A)。谷子
NPC家族各成员间的氨基酸序列长度变化范围较小,
在 512~546 个氨基酸之间 , 预测的平均分子量为
58.39 kD, 最大的 SiNPC1为 61 kD, 最小的 SiNPC4
为 56.77 kD。预测 NPC家族各成员蛋白质的等电点
在 5.56~7.22 之间。对这 5 个谷子 NPC 的氨基酸序
列比对分析发现(图 1-B), NPC3和NPC4相似度最高,
达到 71.29%, 而其他蛋白序列间的相似度在
47.09%~56.86%之间。蛋白结构域预测发现这 5 个
NPC 蛋白均含具有磷酯酶活性的结构域 (Pfam
PF04185), 并且结构域长度变化不大 , 在 359~370
个氨基酸之间。蛋白基序分析表明 SiNPC1-5没有如
C2、XY、EF、PH、PX、ENTH、FYVE 等已知的
磷脂酶基序, 但含有 4个与拟南芥 NPC家族相同的
保守基序 , 即 ENRSFD×××G、T×PNR、DE××G××
DHV和 G×RVP×××××P。信号肽预测发现, SiNPC1、
SiNPC2 和 SiNPC5 的 N 端含有信号肽。5 个 NPC
类基因位于 3 条不同的染色体, SiNPC1 和 SiNPC3
位于第 9染色体, SiNPC2和 SiNPC5位于第 5染色体,
SiNPC4单独位于第 8染色体。

1020 作 物 学 报 第 41卷


表 1 SiNPC4基因克隆和 Real-time PCR分析所用引物以及引物退火温度
Table 1 Primers used for SiNPC4 gene cloning and Real-time PCR analysis and annealing temperature of the primers
引物名称
Primer
引物序列
Primer sequence (5′–3′)
用途
Function
退火温度
Annealing (℃)
SiNPC4-F ATGGCGGGCAAGATCAAGAC 基因克隆
SiNPC4-R TTACGCACTGAAGCAGGGGA Gene cloning
58
SiNPC4-pBI121-F CTCTAGAGGATCCCCGGGATGGCGGGCAAGATC pBI121载体构建
SiNPC4-pBI121-R ACTAGTGGATCCCCCGGGTTACGCACTGAAGCA Vector construction of pBI121
62
SiNPC4-GFP-F CCCAAGCTTATGGCGGGCAAGATC GFP载体构建
SiNPC4-GFP-R GCTCTAGACGCACTGAAGCAGGG Vector construction of GFP
63
SiNPC4-RT-F GACTTCAAGCGGCACTGC 实时定量 PCR
SiNPC4-RT-R TGCTCGTCGTAGGTGATGA Real-time PCR
60
SiActin-F GGCAAACAGGGAGAAGATGA 谷子内参基因
SiActin-R GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG Internal control gene in Setaria italica
60
F: 正向引物; R: 反向引物。F and R represent forward and reverse primers, respectively.

2.2 谷子 NPC家族基因进化树分析
为了分析谷子NPC家族基因的进化关系 , 选择
单子叶植物水稻和高粱, 双子叶植物拟南芥、大豆和
苜蓿以及苔藓类植物小立碗藓(Physcomitrella patens)
和石松门类植物江南卷柏(Selaginella moellendorffii),
将其NPC类蛋白序列与谷子的NPC类蛋白序列进行
多重序列比对, 构建系统发育树(图2)。结果表明植物
NPC类蛋白家族被分为4个亚族 , 分别被命名为
Subfamily1、Subfamily2、Subfamily3和Subfamily4。
在4个亚族中均有单子叶植物和双子叶植物的NPC类
蛋白, 并趋向于形成独立的分支, 每个亚族至少含每
个物种的一个NPC基因, 说明NPC家族基因在单子叶
和双子叶植物分化之前就已经存在。苔藓和江南卷柏
的基因只存在于亚族1中, 并且更趋向于彼此独立,
说明NPC基因家族的祖先可能来自亚族1, 而且苔藓
和江南卷柏的NPC蛋白来源于不同的祖先。谷子NPC
基因家族的5个成员在4个亚族中都有分布。SiNPC4
与AtNPC4蛋白序列的相似度最高, 达57.83%。

表 2 谷子 NPC家族基因的基本信息
Table 2 Genes information of NPC family in foxtail millet
基因名称
Gene name
基因座位号
Gene ID
氨基酸
Amino acid
分子量
Molecular
mass (kD)
等电点
pI
基因长度
Genes length
(bp)
外显子数目
Exon count
染色体定位
Chromosome
location
信号肽长度
Signalpeptide
length
SiNPC1 Si035032m 546 61.00 6.90 3152 3 9 1-30
SiNPC2 Si001000m 525 58.66 6.29 4959 4 5 1-36
SiNPC3 Si035206m 518 57.16 5.56 1629 1 9 NO
SiNPC4 Si026237m 512 56.77 5.91 2877 3 8 NO
SiNPC5 Si005131m 535 58.38 7.22 1818 2 5 1-21

2.3 SiNPC4 蛋白亚细胞定位以及组织特异性表
达分析
构建了35S::SiNPC4-GFP 载体 , 将其转化到
谷子叶片的原生质体中 , 在共聚焦显微镜下观
察 SiNPC4-GFP 融合蛋白亚细胞定位情况表明 ,
对照 GFP蛋白在整个细胞中都可以表达 (图3-A),
SiNPC4-GFP 融合蛋白定位在细胞质、细胞膜和
细胞核中 (图 3 - B )。 q RT- P C R 分析结果显示
SiNPC4主要在根部表达 , 而在茎和叶中表达量
很低 (图3-C), 表明 SiNPC4可能主要在根部发挥
功能。
2.4 SiNPC4在不同处理条件下的表达分析
利用 qRT-PCR 分别检测 SiNPC4 在各处理下的
表达情况 (图 4), 在 PEG 和 MeJA 处理条件下 ,
SiNPC4 的表达量随着处理时间的延长而持续增加,
均在 24 h达到最大, 分别为 0 h的 8.8倍和 13.3倍;
与此相反, 经低温处理后 SiNPC4 的表达量随着处
理时间的延长逐渐降低, 24 h 的表达量是处理开始
时的 0.28 倍; 在 NaCl、ABA、BL 和 GA 处理条件
下, SiNPC4 的表达呈现相似的变化趋势, 即在处理
第 7期 胡利芹等: 谷子非特异性磷脂酶 C基因 SiNPC4的克隆及功能分析 1021


1 h时表达量最高, 随后下降, 在 NaCl处理 24 h时,
表达量又有所上升, ABA处理 24 h的表达量低于 0 h;
黑暗处理 48 h后, SiNPC4的表达量明显上升, 达到
处理开始时的 30倍。

图 1 谷子 NPC家族基因和蛋白结构分析
Fig. 1 Genes and proteins structure analysis of NPC family in foxtail millet
A: 谷子 NPC家族基因结构分析, 红色方框、黑线条、黑色方框分别代表外显子、内含子、5和 3端非翻译区; B: 谷子 NPC蛋白质
结构, 蓝色方框、紫色线条、棕色方框和棕色三角形分别代表信号肽、磷脂酶结构域、保守域和保守基序, 保守基序分别是
ENRSFD×××G、T×PNR、DE××G××DHV和 G×RVP×××××P。
A: genes structure analysis of NPC family in foxtail millet. Red boxes and black lines represent exon, intron, respectively, while black boxes
represent the un-translated region(UTR) both at 5 and 3 terminal; B: protein structure of NPC family in foxtail millet. Blue box, purple line,
brown box and brown triangle represent signal peptides, phosphoesterase domains, conversed regions and motifs, and motifs are consisted of
ENRSFD×××G, T×PNR, DE××G××DHV, and G×RVP×××××P, respectively.

图 2 谷子与水稻、高粱、拟南芥、大豆、苜蓿、小立碗藓、江南卷柏 NPC蛋白进化树分析结果
Fig. 2 Phylogenetic analysis of NPCs protein from Seteria italica (Si), Oryza sativa (Os), Sorghum bicolor (Sb), Arabidopsis thaliana
(At), Glycine max (Gm), Medicago truncatula (Mt), Physcomitrella patens (Pp), and Selaginella moellendorfii Hieron (Sm)
所示物种的 NPC蛋白质序列从数据库 Phytozome v10.0.4中获得。
The NPCs protein sequences in those plants were obtained from the database Phytozome v10.0.4.
1022 作 物 学 报 第 41卷



图 3 SiNPC4蛋白亚细胞定位与在不同组织的表达情况
Fig. 3 Subcellular localization and the tissue specific expression analysis of SiNPC4
A: 对照 GFP; B: 融合蛋白 SiNPC4-GFP; C: SiNPC4在根、茎、叶中的表达情况。
A: control GFP; B: fusion protein SiNPC4-GFP; C: tissue specific expression of SiNPC4 in foxtail millet.

图 4 不同处理条件下 SiNPC4表达分析
Fig. 4 Expression profile of SiNPC4 under different treatment conditions

2.5 谷子 SiNPC4基因功能验证
为鉴定 SiNPC4 基因的功能 , 构建 pBI121-
35S::SiNPC4过表达载体, 遗传转化拟南芥获得 2个
纯合株系。正常生长条件下, 转基因株系苗期根系
长度较 WT 短, 根系表面积较小, 而地上部生长与
WT 一致(图 6-A), 表明该基因对根系的生长具有抑
制作用。
2.5.1 转基因拟南芥植株在 ABA处理下的表型
分析转 SiNPC4 基因拟南芥在种子萌发期和幼
苗期对 ABA的反应(图 5)表明, 在不含 ABA的培养
基中, 转基因株系 OE3、OE4 和 WT 的萌发率基本
一致, 在 3 d内均达到了 100% (图 5-A, 5-D)。在 2
μmol L–1和 4 μmol L–1 ABA处理下, OE3和 OE4的
萌发速率显著高于 WT, 到处理第 6天时, OE3、OE4
和WT的萌发率都达到 100% (图 5-B, C, E, F)。此外,
将在正常培养基上生长 3 d、长势一致的 OE3、OE4
和 WT幼苗分别移至 MS、含 25 μmol L–1和 35 μmol
L–1 ABA的 MS培养基中培养 7 d (图 6-A, B, C), 结
果发现, 在MS条件下, OE3和 OE4幼苗的主根长分
别是 WT的 77.4%和 76.1%, 显著短于 WT (图 6-A,
F); 在 25 μmol L–1 ABA处理下, 与 MS相比, WT根
长明显缩短, 减少了 24.8%, OE3和 OE4的根长分别
缩短了 20.0%和 22.1% (图 6-B, F); 在 35 μmol L–1
ABA处理下, WT与 OE3和 OE4的根长差异不显著,
第 7期 胡利芹等: 谷子非特异性磷脂酶 C基因 SiNPC4的克隆及功能分析 1023


与 MS相比, WT根长缩短了 47.2%, 而 OE3和 OE4
的根长分别缩短 31.3%、31.7%, 说明 OE3、OE4根
长缩短比例较 WT小(图 6-C, F)。WT、OE3和 OE4
根系表面积与根长变化趋势一致, 随着 ABA浓度升
高表面积逐渐减少, 但是在 35 μmol L–1 ABA处理下,
OE3、OE4的根长与 WT相当, 而根系表面积却大于
WT (图 6-G)。上述结果显示, 随着 ABA处理浓度的
增加, 转 SiNPC4 基因拟南芥萌发速率和苗期根系
伸长生长速率受抑制程度较 WT 弱, 表明其对 ABA
的敏感性降低。
2.5.2 转基因拟南芥植株在 BL处理后表型分析
BL 在植物根系生长发育过程中具有重要的调
控作用。用 0.01 μmol L–1和 1.00 μmol L–1 BL处理
WT、OE3和 OE4后, 如图 6-D、6-E所示, WT的主
根随着 BL含量的增加, 生长明显受到抑制, 在 0.01
μmol L–1和 1.00 μmol L–1 BL处理下, 主根长分别比
正常生长条件下缩短了 14.8%和 32.6%; 而 OE3 和
OE4 的主根长略有降低 , 但是不明显 , 且在 1.00
μmol L–1 BL处理下, OE3和 OE4的主根长仅比正常
生长时分别缩短了 11.7%和 11.6%, 缩短量显著低于
WT (图 6-H)。WT 的根系表面积随着 BL 浓度的增
加而减少, 相反, OE3和 OE4的根系表面积随着 BL
浓度的增加而增加, 在 1.00 μmol L–1 BL 处理下,
OE3和 OE4主根长与 WT的相当, 而根系表面积分
别比 WT高 21.0%、26.7%, 说明处理条件下过表达
株系的根系比 WT 发达(图 6-I)。上述结果表明转
SiNPC4基因株系对 BL的敏感性相对低于 WT。
2.5.3 转基因拟南芥植株的抗逆性分析 基于
SiNPC4基因表达受PEG和NaCl诱导上调的特性, 为
了验证SiNPC4能否提高植株的抗逆性, 对WT、OE3
和OE4分别在PEG和NaCl胁迫条件下的表型进行分
析 , 结果表明过表达植株与WT在此两种胁迫下长
势差异不明显(数据未显示), 即过表达株系未增强
植株对PEG和NaCl胁迫的抗性。

图 5 35S::SiNPC4过表达拟南芥种子在不同 ABA浓度处理下的萌发率
Fig. 5 Seed germination rates of 35S::SiNPC4 transgenic lines under treatments with different concentrations of ABA
A和 D: 种子在无 ABA处理条件下的萌发率; B和 E: 种子在 2 μmol L–1 ABA处理条件下的萌发率; C和 F: 种子在 4 μmol L–1 ABA处
理条件下的萌发率。
A and D: seed germination rates under condition without ABA; B and E: seed germination rates under condition with 2 μmol L–1 ABA; C and
F: seed germination rates under condition with 4 μmol L–1 ABA.
1024 作 物 学 报 第 41卷



图 6 不同浓度 ABA和 BL处理下 35S::SiNPC4过表达拟南芥苗期表型分析
Fig. 6 Phenotype analysis of 35S::SiNPC4 transgenic lines during seedling stage under ABA and BL treatments
A: 对照; B和 C: ABA处理, 浓度分别为 25 μmol L–1和 35 μmol L–1; D和 E: BL处理, 浓度分别为 0.01 μmol L–1和 1.00 μmol L–1; F和
G: 分别是 ABA处理下的主根长和根表面积; H和 I: 分别是在 BL处理下的主根长和根表面积。采用单因素方差分析法对数据进行统
计分析, F-I 柱上不同的小写字母代表柱值在 0.05水平上差异显著。
A: control ; B and C: treatment with 25 and 35 μmol L–1 ABA, respectively; D and E: treatment with 0.01 and 1.00 μmol L–1 BL, respectively;
F and G: primary root length and root surface area under ABA treatment, respectively; H and I: primary root length and root surface area
under BL treatment, respectively. Data statically analysis was made by the means of one-way ANOVA. Bars marked with different lower-case
letters from F to I are significantly different at the 0.05 probability level.

3 讨论
非特异性磷脂酶 C 是一类在植物中新发现的磷
脂酶, 其水解产物之一二酰甘油(DAG)是胞内重要
的第二信使[1,6]。DAG 激酶(DGK)可磷酸化 DAG 产
生磷脂酸(PA)信号 [20-21], 在植物响应生物和非生物
胁迫及激素信号转导途径时具有重要的作用。谷子

具有耐旱、耐瘠薄的特性, 该作物中抗逆相关基因
的研究还很少, 克隆该家族基因并解析其功能对谷
子抗逆分子机制的研究具有重要意义。目前, 仅在
拟南芥和水稻中分别鉴定出 6个[6]和 5个[8]该类基因
成员, 本研究利用生物信息学方法在谷子基因组中
筛选出 5个 NPC类基因, 系统进化分析表明该基因
第 7期 胡利芹等: 谷子非特异性磷脂酶 C基因 SiNPC4的克隆及功能分析 1025


家族起源于单、双子叶植物分化之前, 且在单、双
子叶植物分化后独立进化。从基因结构方面看, 这 5
个基因含有 0~3个内含子(图 1-A), 水稻的NPC类基
因同样也含有 0~3个内含子[8], 然而, 拟南芥的NPC
基因家族根据内含子数目被分为两组, 分别含有 2
个和 4个内含子[10], 说明谷子与水稻 NPC基因家族
具有类似的基因结构, 而不同于拟南芥, 这一现象
可能与单、双子叶植物的分化相关。在蛋白质序列
和结构方面, 谷子(图 1-B)、水稻[8]、拟南芥[22]氨基
酸序列长度无明显差别, 且均含有保守的磷脂酶结
构域以及 4个保守的基序, 表明 NPC类蛋白结构在
不同物种间是保守的。
本研究发现 SiNPC4 基因的启动子含有 DRE、
LTRE、MYB、MYC、WRKY 等非生物胁迫相关的
顺式作用元件, 以及 ABRE、ARF等响应 ABA、BL
等植物激素的顺式作用元件 , 其中 , ARF 经
Nemhauser等[23]研究是应答 BL的元件。表达谱分析
表明在 PEG、高盐、低温和黑暗等胁迫条件下 ,
SiNPC4有不同程度的响应, 说明该基因在逆境胁迫
应答中起重要作用; 在外源激素 ABA、BL、GA 和
MeJA 处理下, 该基因也表现出不同的表达模式(图
4), 表明该基因在各种激素信号传导途径中也发挥
不同的作用。
表达谱分析结果证明 SiNPC4主要在根部表达。
同时, 在正常条件下, SiNPC4 过表达植株的根系与
WT相比生长受到抑制, 表明 SiNPC4基因可能参与
植物根系生长发育的调控。BL对主根生长的促进或
抑制作用依赖于其含量的变化 [24]。本研究在外施
0.01~1.00 μmol L–1 BL时, WT主根长表现出对 BL
敏感的特性, 该结果与 Mussig 等[24]、Bao 等[25]和
Wimalasekera等[10]的研究结果一致, 而 SiNPC4过表
达植株主根长对 BL的敏感性相对于WT降低, 这一
表型与 SiNPC4 同源的拟南芥基因 Atnpc4 突变体对
BL 处理的表型一致[10], 说明 SiNPC4 和 AtNPC4 在
BL 信号途径中发挥的作用一致, 即负调控 BL 信号
途径。另一方面, Belkhadir 等[26]研究证明 AtNPC4
在 BL受体和受 BL调控的转录因子之间建立了桥梁,
Nakamura等[27]研究发现 BL可以诱导 IAA5、IAA19
和DR5的表达, Bao等[25]研究证明 BL通过增加生长
素向根尖的运输促进侧根生长发育。本研究中过表
达植株的根系表面积比相应 BL 浓度处理下 WT 的
根系表面积大, 推测 SiNPC4在 BL诱导下促进了侧
根的生长, 而 SiNPC4 在根生长发育方面的作用机
制还有待进一步研究。Peters等[7]的研究结果显示过
表达拟南芥 AtNPC4基因对 ABA的敏感性增强, 该
基因水解膜磷脂的产物 DAG经磷酸化产生 PA信号
并正向调控 ABA信号。而本研究中 SiNPC4转基因
拟南芥对外源 ABA 的敏感性降低, 推测 SiNPC4 在
谷子中是 ABA信号途径的负调控因子。这一结果与
BL 处理结果不同, SiNPC4 与拟南芥中的同源基因
AtNPC4 在 ABA 信号途径中的作用方式完全不同,
SiNPC4 可能作为负调控因子参与植物对 ABA 的响
应。这一差异可能与单子叶植物和双子叶植物的分
化相关, 或者与谷子和拟南芥对于植物逆境反应的
差异相关, SiNPC4在谷子中的具体调控机制还需要
多方面的实验加以分析。SiNPC4受 PGE和 NaCl胁
迫诱导表达上调, 但本研究发现过表达拟南芥植株
在 PGE和高盐胁迫条件下与 WT长势表现一致, 并
没有提高转基因植株的抗逆性, 推测该基因在 PEG
和 NaCl 胁迫响应中的功能可能需要其他调控因子
的协同作用, 或者在不同的生长发育阶段对胁迫的
响应程度不同。
4 结论
从谷子中克隆了一个属于 NPC 家族的基因
SiNPC4。SiNPC4蛋白被定位在细胞质、细胞膜和细
胞核。该基因主要在根部表达 , 并受多种处理如
PEG、NaCl、低温、黑暗、ABA、BL、GA、MeJA
等的诱导表达。过表达该基因拟南芥植株对 ABA和
BL的敏感性降低, 推测该基因可能作为负调控因子
参与植物对 ABA 和 BL 激素的响应过程。在 PEG
和 NaCl处理下, 过表达植株与野生型植株长势没有
明显差异。该基因在谷子中的作用机制与其拟南芥
同源基因 AtNPC4的作用方式显著不同。
References
[1] Wang X M. Plant phospholipases. Plant Mol Biol, 2001, 52:
211–31
[2] Li M, Hong Y, Wang X. Phospholipase D- and phosphatidic
acid-mediated signaling in plants. Biochim Biophys Acta, 2009,
1791: 927–935
[3] Xue H W, Chen X, Mei Y. Function and regulation of phosphol-
ipid signalling in plants. Biochem J, 2009, 421: 145–156
[4] Munnik T, Vermeer J E M. Osmotic stress-induced phosphoinosi-
tide and inositol phosphate signalling in plants. Plant Cell Envi-
ron, 2010, 33: 655–669
[5] Kenji Y, Toshiaki M, Toshiyuki T. Purification and characteriza-
tion of membrane-bound inositol phospholipid-specific phos-
pholipase C. Plant Physiol, 1993, 102: 165–172
[6] Nakamura Y, Awai K, Masuda T, Yoshioka Y, Takamiya K I, Ohta
1026 作 物 学 报 第 41卷


H. A novel phosphatidylcholine-hydrolyzing phospholipase C
induced by phosphate starvation in Arabidopsis. J Biol Chem,
2004, 280: 7469–7476
[7] Peters C, Li M, Narasimhan R, Roth M, Welti R, Wang X. Non-
specific phospholipase C NPC4 promotes responses to abscisic
acid and tolerance to hyperosmotic stress in Arabidopsis. Plant
Cell, 2010, 22: 2642–2659
[8] Singh A, Kanwar P, Pandey A, Tyagi A K, Sopory S K, Kapoor S,
Pandey G K. Comprehensive genomic analysis and expression
profiling of phospholipase C gene family during abiotic stresses
and development in rice. PLoS One, 2013, 8: e62494
[9] Kocourkova D, Krckova Z, Pejchar P, Veselkova S, Valentova O,
Wimalasekera R, Scherer G F, Martinec J. The phosphatidylcho-
line-hydrolysing phospholipase C NPC4 plays a role in response
of Arabidopsis roots to salt stress. J Exp Bot, 2011, 62:
3753–3763
[10] Wimalasekera R, Pejchar P, Holk A, Martinec J, Scherer G F.
Plant phosphatidylcholine-hydrolyzing phospholipases C NPC3
and NPC4 with roles in root development and brassinolide sig-
naling in Arabidopsis thaliana. Mol Plant, 2010, 3: 610–625
[11] Peters C, Kim S C, Devaiah S, Li M, Wang X. Non-specific
phospholipase C5 and diacylglycerol promote lateral root deve-
lopment under mild salt stress in Arabidopsis. Plant Cell Environ,
2014, 37: 2002–2013
[12] Gaude N, Nakamura Y, Scheible W R, Ohta H, Dormann P.
Phospholipase C5 (NPC5) is involved in galactolipid accumula-
tion during phosphate limitation in leaves of Arabidopsis. Plant J,
2008, 56: 28–39
[13] Doust A N, Kellogg E A, Devos K M, Bennetzen J L. Foxtail
millet: a sequence-driven grass model system. Plant Physiol,
2009, 149: 137–141
[14] Bennetzen J L, Schmutz J, Wang H, Percifield R, Hawkins J,
Pontaroli A C, Estep M, Feng L, Vaughn J N, Grimwood J, Jen-
kins J, Barry K, Lindquist E, Hellsten U, Deshpande S, Wang X,
Wu X, Mitros T, Triplett J, Yang X, Ye C Y, Mauro-Herrera M,
Wang L, Li P, Sharma M, Sharma R, Ronald P C, Panaud O,
Kellogg E A, Brutnell T P, Doust A N, Tuskan G A, Rokhsar D,
Devos K M. Reference genome sequence of the model plant Se-
taria. Nat Biotechnol, 2012, 30: 555–561
[15] Zhang G, Liu X, Quan Z, Cheng S, Xu X, Pan S, Xie M, Zeng P,
Yue Z, Wang W, Tao Y, Bian C, Han C, Xia Q, Peng X, Cao R,
Yang X, Zhan D, Hu J, Zhang Y, Li H, Li H, Li N, Wang J, Wang
C, Wang R, Guo T, Cai Y, Liu C, Xiang H, Shi Q, Huang P, Chen
Q, Li Y, Wang J, Zhao Z, Wang J. Genome sequence of foxtail
millet (Setaria italica) provides insights into grass evolution and
biofuel potential. Nat Biotechnol, 2012, 30: 549–554
[16] 霍冬英, 郑炜君, 李盼松, 徐兆师, 周永斌, 陈明, 马有志, 闵
东红, 张小红. 谷子 F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应.
作物学报, 2014, 40: 1585–1594
Huo D Y, Zheng W J, Li P S, Xu Z S, Zhou Y B, Chen M, Ma Y
Z, Min D H, Zhang X H. Identification, classification, and
drought response of F-box gene family in foxtail millet. Acta
Agron Sin, 2014, 40: 1585–1594 (in Chinese with English ab-
stract)
[17] 闵东红, 薛飞洋, 马亚男, 陈明, 徐兆师, 李连城, 刁现民, 贾
冠清, 马有志. 谷子 PP2C 基因家族的特性. 作物学报, 2013,
39: 2135–2144
Min D H, Xue F Y, Ma Y N, Chen M, Xu Z S, Li L C, Diao X M,
Jia G Q, Ma Y Z. Characteristics of PP2C gene family in foxtail
millet (Setaria italica). Acta Agron Sin, 2013, 39: 2135–2144 (in
Chinese with English abstract)
[18] Yoo S D, Cho Y H, Sheen J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a
versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat
Protoc, 2007, 2: 1565–1572
[19] Clough S J, F. Bent A. Floral dip_ a simplified method for Agro-
bacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J, 1998, 16: 735–743
[20] Hartog M, Verhoef N, Munnik T. Nod factor and elicitors activate
different phospholipid signaling pathways in suspension-cultured
alfalfa cells. Plant Physiol, 2003, 132: 311–317
[21] Zonia L, Munnik T. Osmotically induced cell swelling versus cell
shrinking elicits specific changes in phospholipid signals in to-
bacco pollen tubes1. Plant Physiol, 2004, 134: 813–823
[22] Pokotylo I, Pejchar P, Potocky M, Kocourkova D, Krckova Z,
Ruelland E, Kravets V, Martinec J. The plant non-specific phos-
pholipase C gene family. Novel competitors in lipid signalling.
Prog Lipid Res, 2013, 52: 62–79
[23] Nemhauser J L, Mockler T C, Chory J. Interdependency of
brassinosteroid and auxin signaling in Arabidopsis. PLoS Biol,
2004, 2: e258
[24] Mussig C, Shin G H, Altmann T. Brassinosteroids promote root
growth in Arabidopsis. Plant Physiol, 2003, 133: 1261–1271
[25] Bao F, Shen J J, Brady S R, Muday G K, Asami T, Yang Z B.
Brassinosteroids interact with auxin to promote lateral root de-
velopment in Arabidopsis. Plant Physiol, 2004, 134:
1624–1631
[26] Belkhadir Y, Chory J. Brassinosteroid signaling: a paradigm for
steroid hormone signaling from the cell surface. Science, 2006,
314: 1410–1411
[27] Nakamura A, Higuchi K, Goda H, Fujiwara M T, Sawa S, Ko-
shiba T, Shimada Y, Yoshida S. Brassinolide induces IAA5, IAA19,
and DR5, a synthetic auxin response element in Arabidopsis, im-
plying a crosstalk point of brassinosteroid and auxin signaling.
Plant Physiol, 2003, 133: 1843–1853