全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(6): 1060−1068 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31271655, 31071366), 浙江省重大科技专项(2010C12003)和浙江省自然科学基金项目(LY12C13005)
资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 程方民, E-mail: chengfm@zju.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: yangweili96@163.com
Received(收稿日期): 2012-12-04; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期):
URL:
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01060
高温胁迫对水稻光合 PSII系统伤害及其与叶绿体 D1蛋白间关系
杨卫丽 1 黄福灯 2 曹珍珍 1 雷炳婷 1 胡东维 1 程方民 1,*
1 浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310058; 2 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所, 浙江杭州 310031
摘 要: 以水稻结实期的人工控温试验测定不同温度处理下水稻旗叶光合速率、叶绿素荧光参数的动态变化, 并结
合 Western印迹与胶体金标记技术对叶肉细胞类囊体膜中 D1蛋白的表达检测与活性定位, 探讨了高温胁迫对 D1 蛋
白存在形态与活性分布的影响, 以及 D1蛋白表达与叶片光合速率、PSII 荧光参数的联系。结果表明, 高温处理下叶
片净光合速率下降、PSII 潜在活性(Fv/Fo)和 PSII 光能转化效率(Fv/Fm)降低, 且随着高温胁迫时间的持续和叶片功能
的衰退, 类囊体膜结构损伤越严重, 光能转化效率越低; 在 D1 蛋白的两类存在形态中, 非磷酸化 D1 蛋白和磷酸化
D1蛋白在高温胁迫下的表达量均有所下降, 但前者下降更明显; 高温处理下控制 D1蛋白表达的叶绿体 psbA基因在
转录水平呈下调表达, 使D1蛋白合成及周转过程受到抑制, 进而类囊体膜 PSII反应中心的功能受损与叶绿体光合效
率下降, 揭示高温胁迫对叶片 PSII系统的伤害受 D1 蛋白磷酸化过程和 psbA基因表达变化的共同作用, 进而影响不
同水稻品种在高温胁迫下的光合速率和耐热性。
关键词: 水稻; 高温胁迫; PSII光合系统; D1蛋白; 蛋白印迹; 免疫定位
Effects of High Temperature Stress on PSII Function and Its Relation to D1
Protein in Chloroplast Thylakoid in Rice Flag Leaves
YANG Wei-Li1, HUANG Fu-Deng2, CAO Zhen-Zhen1, LEI Bing-Ting1, HU Dong-Wei1, and CHENG
Fang-Min1,*
1 College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2 Institute of Crop and Nucleus Technology, Zhejiang
Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310031, China
Abstract: On the basis of the artificial controlled temperature treatments in growth chambers, influences of high temperature
stress at rice filling stage on the expression and distribution of D1 protein in leaf chloroplast thylakoid, as well as their relations to
the decline of leaf photosynthetic rate and the damage of PSII membrane system were investigated by detecting the temporal pat-
tern of leaf photosynthetic rate and chlorophyll fluorescence parameters, with SDS-PAGE electrophoresis, western-blotting and
immunogold labeling methods. The results showed that rice flag leaves exposed high temperature generally had lower net
photosynthetic rate (Pn), PSII potential efficiency(Fv/Fo) and solar energy transmitting efficiency(Fv/Fm) compared with those
under normal temperature, with more severe damage and remarkable function dropping in chloroplast thylakoid due to prolonging
stress times and accelerating leaves senescence.The amount of D1 protein in rice leaves under high temperature stress decreased
significantly. In the two types of D1 protein, the amount of non-phosphorylated D1 protein was more sensitive to high temperature
stress than the phosphorylated D1 protein.The RNA transcription of psbA gene in chloroplast, controlling D1 protein synthesis,
was down-regulated by high temperature stress, inhabiting mRNA transcription and protein translation in D1 protein synthesis,
thereby causing the functional damage of PSII reaction centre in thylakoid and dropping leaf photosynthetic rate under high tem-
perature stress. It could be suggested that the functional damage of PSII reaction centre under high temperature stress be caused by
the combined action of D1 protein hosphorylation and psbA gene expression, resulting in the decrease of photosynthetic rate and
high temperature tolerance in two rice genotypes.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); High temperature stress; Photosynthetic system II; D1 protein; Western-blotting; Immunogold
labeling location
第 6期 杨卫丽等: 高温胁迫对水稻光合 PSII系统伤害及其与叶绿体 D1蛋白间关系 1061


随温室效应日益加剧, 全球气候变暖, 高温热
害已成为水稻实现高产、稳产和优质的一个重要制
约因素[1-2]。大量研究表明, 高温胁迫对水稻产量和
品质的影响, 与水稻植株的库、源、流诸器官及其
多种生理生化变化均存在一定联系[3-5]。其中, 光合
生理是水稻对高温胁迫响应较敏感的一个环节, 高
温胁迫导致水稻功能叶的光合效率降低、同化产物
供应不足 , 是引起水稻在高温胁迫下籽粒充实不
良、垩白度上升和千粒重下降等现象的重要原因之
一[6-7]。因此开展高温胁迫对水稻光合作用伤害的生
理生态特征及其光合机能对高温胁迫的适应机制研
究, 对于通过品种选育与栽培调控等农艺措施, 提
高水稻对高温逆境的适应性、减轻高温热害对水稻
生产的不利影响有着重要意义。
植物光合作用的能量转化过程主要是在叶绿体
的类囊体膜上完成的, 类囊体膜的稳定性与植物在
逆境条件下的光合效率存在密切联系[6,8]。此外, 类
囊体膜具有高温逆境信号的放大作用, 类囊体膜的
稳定性与植物承受高温伤害的表现有关[9]。许多研
究表明, 干旱、高温等逆境对植物光合机能破坏的
关键部位是位于叶绿体类囊体膜上的 PSII 反应
中心 , 其对光合作用的完成起着尤为重要的作
用[7,10-11]。持续高温胁迫不仅会导致叶绿素荧光参数
初始荧光(Fo)降低 , 而且会引起 PSII 的潜在活性
(Fv/Fo)和 PSII 的光能转化效率(Fv/Fm)明显下降[10,12];
高温胁迫下水稻叶片光合速率下降的同时, 叶片的
MDA含量和膜透性也会上升和增加[13-14]。另据报道,
植物叶绿体的 PSII是一种由多蛋白亚基构成的复合
体, 在构成 PSII的 30多种蛋白质中, D1蛋白是构成
PSII 的最基本框架, 而各种与原初电荷分离及电子
传递有关的辅助因子都有序地结合在这个框架
上[15-17]。但是对于高温胁迫下水稻光合机能下降与
PSII反应中心D1蛋白之间的关系, 国内外目前尚存
在较大争议。为此, 本文以水稻灌浆结实期的温度
处理试验为基础, 对不同温度处理下水稻旗叶叶肉
细胞叶绿体中的 D1蛋白变化及其与光合速率、叶绿
素荧光参数间的关系进行了分析 , 旨在揭示高温
胁迫对水稻叶片光合机能的伤害及其与 D1 蛋白
合成周转过程间的生理联系。
1 材料与方法
1.1 材料种植与温度处理
2011 年和 2012 年在浙江大学紫金港校区种植
早籼品种嘉 935和嘉 353。2个品种的株高、生育期
和株型等农艺性状均基本相仿, 但耐热性和籽粒品
质特性有明显差别。4月 26日播种, 湿润育秧, 5月
26 日单本插栽至大田, 田间常规水作管理、及时防
治病虫杂草。待水稻在田间生长至孕穗期, 将稻株
移到盆钵中(每盆 2株)继续生长, 并在抽穗期选择生
长发育正常, 且长势长相基本一致的稻株, 将其放
入不同温度处理的 CONVIRON S10H型人工气候箱
中, 每品种、每温度处理各 8个盆钵, 处理期间不定
期补水, 以保持 5~8 cm左右的浅水层, 直至处理结
束。期间, 按一定的时间间隔取样, 取不同处理的旗
叶样品保存于−80℃冰箱中 , 以用于类囊体膜提取
和 D1 蛋白检测及相关基因表达等实验分析; 与此
同时 , 采用活体法测定光合速率和叶绿素荧光参
数。
在水稻的灌浆结实期进行温度处理, 设高温和
常温两个处理。其日均温度分别为 33℃ (日最高温
度 38℃/日最低温度 28℃)和 23℃ (日最高温度 26℃
/日最低温度 20℃), 温度日变化模拟自然气候特征,
以 24 h为 1个循环, 设定程序自动控制[18]。除温度
因素外, 两台气候箱中的其他气候因子均保持完全
一致。光照时间为 8:00—18:00, 光照强度为 130~170
J m−2 s−1, 相对湿度为 75%~80%, 风速 0.5 m s−1。两
年试验的温度处理设计、取样间隔和取样方法等完
全相同, 但 2012年对叶片光合速率和叶绿素荧光等
指标的测定(尤其不同处理时间的动态变化趋势)更
全面、更系统, 因此本文仅对 2012年的试验结果加
以分析。其中, 嘉935在高温处理下的结实率和千粒
重分别为 17.6%和 21.8 g, 在室温处理下的结实率和
千粒重分别为 70.7%和 23.1 g; 嘉 353在高温处理下
的结实率和千粒重分别为 23.2%和 19.6 g, 在室温处
理下的结实率和千粒重分别为 74.5%和 22.7 g。
1.2 光合速率和叶绿素荧光参数的测定
用 LI-6400便携式光合作用测量仪和 IMAGING-
PAM 调制叶绿素荧光仪(Walz 公司, 德国)进行活体
测定。从水稻抽穗后开始, 每隔 5 d对抽穗时所标记
稻穗相对应的旗叶进行测定, 直到水稻在蜡熟后期
(抽穗后第 26 天左右)移出人工气候箱为止, 共测定
5 次。其中, 净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾
速率(Tr)等参数由 LI-6400 光合仪自动给出, Fo、Fm
和 Fv /Fm等参数 IMAGING-PAM叶绿素荧光仪读得
(叶片暗适应 15~20 min后测量)。按仪器使用说明书
操作, 每次取 6张叶片作为重复, 取 4张叶片的平均
1062 作 物 学 报 第 39卷

值(剔除 6次重复测定结果中的最大值和最小值)。
1.3 类囊体膜色素蛋白复合体的 SDS-PAGE 电
泳和 D1蛋白的Western印迹
1.3.1 类囊体膜的制备 参考 Bredenkarap 等[15]
的方法略作改进。称取 1.0 g叶样, 洗净、除去中脉
后 , 放入预冷的研钵 , 加液氮研磨至粉末 , 再加入
冰冷的提取液[含 25 mmol L−1 Tricine-NaOH (pH
7.8), 0.33 mmol L−1 sorbitol, 10 mmol L−1 NaCl, 5
mmol L−1 MgC12, 0.1% (W/V) BSA牛血清蛋白和 2%
(W/V) polyvinyl pyrrolidone(PVP)]继续研磨至匀浆,
过滤去除粗粒沉淀后 , 经 4℃下分步离心(900×g~
10 000×g)得叶绿体类囊体膜沉淀。将叶绿体类囊体
膜悬浮于低渗透性溶液 [25 mmol L−1 Tricine-NaOH
(pH 7.8), 10 mmol L−1 NaOH, 5 mmol L−1 MgC12,
10% glycerol]中−80℃保存, 并检测类囊体悬浮液的
叶绿素浓度。
1.3.2 类囊体膜色素蛋白复合体的 SDS电泳 参
照 Laemmli [19]方法略加改动。取离心好的类囊体膜
100 µL 加等体积的样品缓冲液 [25 mmol L−1
Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 10% glycerol, 5%
2-mercaptoethamol, 0.1% bromophenol blue]于离心
管中, 使混合液中的叶绿素浓度为 1 mg mL−1, 将混
合液在 50℃加热 30 min并在 10 000×g下离心 5 min,
用上清液上样电泳。电泳的浓缩胶浓度 4%, 分离胶
浓度为 12%, 凝胶缓冲液中含有 0.4% SDS。用微量
加样器取样品 35 μL分别加入样品孔中, 90 V稳压电
泳, 电泳结束后用考马斯亮蓝 R-250 染色或转移至
硝酸纤维素膜上进行免疫检测反应。
1.3.3 D1 蛋白的 Western 印迹检测 参照
Yamashita 等[20]报道的方法。在上述 SDS-电泳结束
后 , 凝胶不经染色而直接转移至硝酸纤维素膜上 ,
用脱脂奶粉覆盖, 与一抗温育, 再与磷酸酯酶偶联
的二抗温育后, 加酶底物显色。所用一抗是 Agrisera
公司的叶绿体 Dl 蛋白多克隆抗体(产品号 AS01-016),
二抗是 Sigma公司的辣根过氧化物酶(HRP)兔抗体。
1.4 D1蛋白的免疫胶体金标记与细胞化学观察
参照张其芳等 [21]的方法低温包埋样品。将嘉
353在不同温度处理下旗叶的叶片切成约 2 mm的小
段, 利用 2%甲醛和 1%戊二醛的磷酸缓冲液固定后,
经不同浓度的乙醇梯度脱水, 用 Lowicryl K4M树脂
低温渗透包埋, 将聚合后的样品切成超薄切片, 并
收集在镍网上; 在 28℃条件下采用液滴悬浮的方法
进行标记反应, 采用直径 10 nm的胶体金及 Protein
A 胶体金探针。标记好的样品经醋酸双氧铀和柠檬
酸铅双染色后 , 在 JEM-1200EX 透射电镜下观察
拍照。
1.5 基因表达的 PCR检测
采用冻融法提取和纯化不同温度处理下的叶片
样品总 RNA, 经变性甲醛琼脂糖凝胶电泳和
NanoDrop 2000 微量分光光度计检测 RNA 质量后,
利用 TaKaRa 公司的 RNA 反转录试剂盒, 用 20 μL
反应体系将样品 RNA反转录成 cDNA。在反转录前
用 DNaseI对总 RNA进行消化处理, 以消除 DNA的
污染。
利用 Primer Premier 5.0软件设计水稻 psbA基因
(GenBank 登录号为 DQ789329)的 PCR 特异扩增引
物。所用的上游引物是 5-ATCTGTAGTTGATAGCC
AAGGTCG-3, 下游引物是 5-TAGGTCTAGAGGG
AAGTTGTGAGC-3, 扩增产物的片段大小为 118
bp。采用 10 μL的反应体系进行 PCR, 以 actin基因
为内标。PCR循环条件为 95℃预变性 3 min; 95℃变
性 30 s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 33轮循环后转
为 72℃下 10 min, PCR扩增产物经 100 V电压下琼
脂糖凝胶电泳, 最后利用凝胶成像系统观察拍照。
2 结果与分析
2.1 高温胁迫对水稻旗叶光合速率和叶绿素荧
光参数的影响
由图 1 可见, 高温胁迫下叶肉细胞的叶绿体浓
度和旗叶光合速率呈下降趋势, 尤其是高温处理持
续 15 d之后, 旗叶中的叶绿素浓度和光合速率的下
降幅度较大, 表明高温胁迫在降低叶片光合同化物
生产能力的同时 , 也间接加快了叶片的衰老进程 ;
进一步比较可知(表 1), 高温胁迫引起净光合速率降
低的同时, 叶肉细胞的叶绿体浓度、叶片的蒸腾速
率和气孔导度呈现不同程度的下降, 而胞间 CO2 浓
度有所上升(嘉 935未达统计显著水平)。此外, 高温
胁迫下气孔导度和胞间 CO2浓度的下降或上升幅度
也没有其对净光合速率的影响明显。这一现象说明,
高温胁迫下水稻叶片的净光合速率下降, 不仅与气
孔因素有关, 而且可能还受叶肉细胞内部有关酶活
力和光合组分变化等非气孔因素的制约。
光合能力强弱与光合器官 PSII活性及电子传递
有关[6]。旗叶的 Fo (初始荧光)值在高温胁迫下呈较
明显的上升趋势, 而 Fm (最大荧光)值则有所下降,
尤其是在高温处理 15 d以后, 不同温度处理间的差
异均较明显扩大(图 2-A和 B)。鉴于 Fo是 PSII反应
第 6期 杨卫丽等: 高温胁迫对水稻光合 PSII系统伤害及其与叶绿体 D1蛋白间关系 1063



图 1 不同温度处理下叶绿素与净光合速率的动态变化
Fig. 1 Dynamic changes of chlorophyll content and net photosynthetic rate in flag leaves under different temperature treatments
J935NT表示嘉 935的室温处理, J935HT表示嘉 935的高温处理; J353NT表示嘉 353的室温处理, J353HT表示嘉 353的高温处理。
J935NT and J935HT mean normal temperature (NT) and high temperature (HT) treatments for Jia 935, and J353NT and J353HT mean normal
temperature (NT) and high temperature (HT) treatments for Jia 353, respectively.

表 1 温度处理对水稻开花后第 15天旗叶光合性能的影响
Table 1 Effect of temperature treatments on photosynthetic characteristics of flag leaves at 15 d after flowering
品种
Variety
温度处理
Temp. treatment
叶绿素浓度
Chl (mg L−1)
净光合速率 Pn
(μmol m−2 s−1)
气孔导度 Gs
(mmol m−2 s−1)
胞间 CO2浓度
Ci (μmol mol−1)
蒸腾速率 Tr
(mmol m−2 s−1)
常温 NT 21.14±0.88 14.46±1.71 0.68±0.23 566.10±16.08 8.42±1.56
高温 HT 18.02±1.72 10.59±1.98 0.40±0.21 579.25±17.91 6.13±1.28
嘉 935
Jia 935
差值 Difference 3.12** 3.87** 0.28 −13.15 2.29**
常温 NT 24.62±1.80 13.75±1.42 0.57±0.18 573.72±21.36 9.45±1.28
高温 HT 17.98±1.65 10.84±0.91 0.32±0.11 624.16±13.35 5.96±1.77
嘉 353
Jia 353
差值 Difference 6.64** 2.91** 0.25* −50.44** 3.49**
*和**表示同一品种的不同温度处理间差异达到 0.05和 0.01统计显著水平。
* and ** represent significant difference at 0.05 and 0.01 probability levels, respectively. NT: normal temperature; HT: high temperature.

中心处于完全开放状态时的荧光产量, 主要反映叶
绿体类囊体膜结构的受损伤程度, 而 Fm是 PSII反应
中心处于完全关闭状态时的荧光产量 , 主要反映
PSII 的电子传递情况, 因此上述现象说明, 高温处
理造成了 PSII反应中心和类囊体膜结构的损伤、最
大光化学效率和电子传递效率的降低, 且随着高温
胁迫时间的持续和叶片功能的衰退, 类囊体膜结构
受到的损伤越严重, 电子传递效率也会越低。供试
两品种相比, 嘉 353 在高温胁迫处理下的 Fo下降和
Fm上升幅度要比嘉 935更明显。
Fv/Fm (可变荧光与最大荧光的比值)可反映 PSII
反应中心的光能转化效率, 是叶绿素荧光参数之中
常被用来表示环境胁迫程度的一个“探针”指标[7]。由
图 2-C可见, 水稻抽穗开花后, 其旗叶的 Fv/Fm值大
致呈下降趋势, 而高温胁迫明显加剧 Fv/Fm 值在籽
粒灌浆过程中的下降程度。结合高温胁迫下 Fo值(图
2-A)同时也出现的下降现象, 说明高温胁迫引起了
PSII 潜在活性中心受损、光合作用的原初反应受到
抑制, 进而影响到光合电子传递效率。
2.2 高温胁迫对叶绿体 PSII反应中心 D1蛋白的
影响
SDS-PAGE检测结果表明(图 3), 不同温度处理
下叶肉细胞中的类囊体膜蛋白组分的条带差异不大,
尤其是高温处理第 5 天, 很难分辨出其与低温处理
样品间的差别(图 3-A)。但在高温处理第 15 天和第
25 天时, 尽管也未发现特异蛋白条带出现或消失这
一现象(即不同温度处理下的特异蛋白条带均基本
完整), 但部分蛋白条带(如 46 kD、32 kD等)组分的
显色深浅不一, 高温胁迫下这些蛋白组分条带明显
变浅, 可较清晰地辨别出不同温度处理间的差异(图
3-B和 C)。
进一步对类囊体膜蛋白组分的 Western-blotting
检测结果表明(图 4-上图), 上述 SDS-PAGE中 32 kD
左右处的蛋白条带可与 D1 蛋白的特异性抗体相结
合, 并通过酶标二抗反应显色, 证实不同温度处理
下类囊体膜蛋白电泳中 32 kD左右处的蛋白条带变
化与 PSII 的 D1 蛋白有关。此外, 由图 4 可见, D1
蛋白中的非磷酸 D1蛋白和磷酸化 D1蛋白在高温胁
1064 作 物 学 报 第 39卷



图 2 不同温度处理下叶绿素荧光参数(Fo、Fm和 Fv /Fm)的
动态变化
Fig. 2 Temporal pattern of chlorophyll fluorescence
parameters (Fo, Fm and Fv /Fm) in flag leaves under different
temperature treatments
J935NT表示嘉 935的室温处理, J935HT表示嘉 935的
高温处理; J353NT表示嘉 353的室温处理,
J353HT表示嘉 353的高温处理。
J935NT and J935HT mean normal temperature (NT)
and high temperature (HT) treatments for Jia 935, and J353NT
and J353HT mean normal temperature (NT) and high temperature
(HT) treatments for Jia353, respectively.


图 3 不同温度处理下叶肉细胞的类囊体膜蛋白组分的
SDS-PAGE电泳谱
Fig. 3 SDS-PAGE electrophoretogram of thylakoid mem-
branes protein in rice leaves under different temperature
treatments
M为 marker。A、B、C分别是水稻抽穗开花后的第 5天、
第 15天和第 25天样品。1, 5, 9为嘉 935的常温处理;
2, 6, 10为嘉 935的高温处理; 3, 7, 11为嘉 353的常温处理;
4, 8, 12为嘉 353的高温处理。
M is marker; A, B and C show the samples for 5th day, 15th day and
25th day after different temperature treatments, respectively.
1, 5, 9 are for J935-normal temperature at different sampling stage;
2, 6, 10 for J935-high temperature, and 3, 7, 11 are for J353-normal
temperature, and 4, 8, 12 are for J353-high
temperature, respectively.


图 4 不同温度处理下 PSII的 D1蛋白 Western-blotting(上)与
psbA基因表达(下)
Fig. 4 Western-blotting of D1 protein (upper panel) and ex-
pression of psbA gene (lower panel) in PSII in rice leaves under
different temperature treatments
抽穗开花后第 15天的旗叶样品; 图中缩写符号同图 1。
The samples are obtained from for rice flag leaves at 15th days after
flowering. Abbreviations are the same as given in Fig. 1.

迫处理下的表达量均有所下降, 但前者下降更明显,
说明前者更敏感, 后者在高温胁迫下比前者相对较
稳定。
PSII 的光化学反应中心 D1 蛋白是由叶绿体
psbA基因编码, psbA基因的 mRNA翻译是 D1蛋白
合成的关键调控步骤[22]。利用不同温度处理下第 15
天旗叶鲜样品, 提取其 mRNA 后, 对 psbA 基因在
RNA 水平上表达情况的检测结果表明, 高温胁迫下
psbA 基因呈下调表达, 且与常温处理的差异较明显
(图 4-下图)。这说明高温处理对 PSII光合性能和 D1
蛋白的调控效应, 在 psbA基因的转录水平上已得到
表现, 而 psbA 基因在高温胁迫下的 RNA 表达量降
低, 会对后续的 D1 蛋白合成和翻译效率产生抑制
第 6期 杨卫丽等: 高温胁迫对水稻光合 PSII系统伤害及其与叶绿体 D1蛋白间关系 1065


作用。供试两品种相比, 嘉 353 在高温处理下叶片
中 psbA基因的下调表达幅度大于嘉 935。
2.3 温度胁迫对叶绿体 D1蛋白活性分布的影响
利用免疫胶体金标记 , 对不同温度处理下 D1
蛋白在类囊体膜等细胞器上的活性分布观测表明 ,
在叶肉细胞的叶绿体中, D1蛋白主要存在于类囊体
膜片层的堆叠区域, 而在其片层之间的连接部分则
很少出现(图 5-A~D)。除叶绿体外, 在叶肉细胞的其
他细胞器(细胞核、线粒体、细胞壁等)上均无胶体金
颗粒出现(图 5-E和 F), 这说明 D1蛋白的胶体金标记
是特异性的, D1蛋白只在叶绿体中表达, 且其活性主
要分布于叶绿体类囊体膜片层结构的堆叠区域。
不同温度处理间的叶绿体超微结构差异不明显,
甚至在高温处理持续 15 d后, 几乎都难以较清晰地
分辨出两者间在叶绿体形态、叶绿体数量及其类囊
体片层结构等方面的明显差别(图略), 但高温胁迫
下 D1 蛋白的胶体金颗粒密度比其常温处理有较明
显的降低, 胶体金颗粒数量也表现出较大程度的下
降现象(图 5-G和H), 说明高温胁迫会引起类囊体堆
叠区域的 D1 蛋白受到损伤, 进而导致其 PSII 的功
能下降, 这也与本文叶绿素荧光参数和蛋白杂交等
环节的研究结果相印证。


图 5 高温胁迫处理下叶绿体的超微结构与类囊体 D1蛋白分布的免疫胶体金标记
Fig. 5 Chloroplast ultrastructure and immunogold labeling of PSII D1 protein in rice leaves under high temperature stress
CW: 细胞壁; Nu: 细胞核: Ch: 叶绿体; M: 线粒体; S: 淀粉粒;图中白箭头示 D1蛋白的胶体金标记部位。
CW: cell wall; Nu: nucleus; Ch: chloroplast; M: mitochonrion; S: starch granule. White arrows indicate the immunogold labeling locations.

3 讨论
关于高温胁迫对植物叶片光合速率和叶绿素荧
光参数影响的研究, 国内外已有大量文献报道。比
较接近的观点是, 高温胁迫会导致叶片光合速率下
降、叶绿素含量降低、叶绿素荧光参数的 Fo升高, 但
Fv/Fm和 Fv/Fo等值下降[12,14,23]。此外, 高温逆境对光
合机构产生破坏的关键部位是叶绿体 PSII反应中心
的观点, 现已越来越多地为大多数研究者接受[7,11]。
但针对高温胁迫条件下植物光合速率下降与 PSII活
性受损及有关叶绿素荧光参数之间的关系 , 有关
研究结论则不尽相同。其中, Tamasaki等[10]认为, 高
温处理下作物的叶片光合速率下降与其叶绿素荧光
参数 Fv/Fm 值降低呈正相关, 与叶绿素荧光参数 Fo
等呈显著负相关。在高温胁迫下 , 作物叶片中
Chl-Pro“结合度”松弛, 致使自由基对叶绿素的氧化
胁迫更为容易, 从而诱发膜脂过氧化使叶片光合机
构受损伤, 最终导致叶绿素含量的下降和光合速率
下降, 而叶绿素荧光参数 Fo值在高温胁迫下的增加,
表明 PSII 反应中心已发生了不易逆转的破坏。但
Kornyeyev等[24]则认为, 叶绿素荧光参数 Fv/Fm的轻
度降低对光合速率没有影响, 只有其大幅度降低(降
低 40%~60%)后才引起光合速率的降低。Zhao 等[25]
认为 , 高温胁迫下作物光合速率下降与叶绿素荧
1066 作 物 学 报 第 39卷

光参数之间的关系 , 与高温胁迫的程度和胁迫持
续时间等因素有关。高温胁迫处理下植物净光合
速率下降的最初主要原因是气孔因素 , 光合速率
下降与 Fo和 Fv/Fm等叶绿素荧光参数间的关系可能
不密切 , 但随胁迫时间的延长 , 非气孔因素逐渐
成为主导因素 , 此时两者间存在着密切的联系 [14]。
本研究表明, 不同温度处理下水稻旗叶叶片在籽粒
灌浆过程中的光合速率、叶绿素含量和 Fv/Fm 等均
呈下降趋势, 高温胁迫与常温处理间的差别主要表
现在这种下降的速率和幅度上, 尤其是高温处理持
续 15 d后的差别较明显, 这表明高温胁迫在降低叶
片光合同化物生产能力的同时, 也间接加快了叶片
的衰老进程。另据张桂莲等[26]报道, 高温胁迫会导
致水稻叶片的净光合速率和气孔导度下降 , 胞间
CO2浓度上升。但本研究表明, 在叶片净光合速率呈
显著下降的同时, 气孔导度和胞间 CO2 浓度的不同
温度处理间差异并不完全显著(表 1), 说明在本文高
温胁迫处理下的相应水稻灌浆时期, 非气孔因素对
叶片净光合速率的抑制起着更重要作用, 叶片 PSII
光合机构受到的损伤也可能更加明显。
在植物光合系统中, Dl 蛋白的正常周转是维持
PSII 反应中心结构所需的[17]。在没有其他胁迫因素
存在的正常条件下, 高等植物体内 D1 蛋白的合成
和降解处于动态平衡之中, 其总量不会明显减少或
增加, 但在逆境胁迫条件下, Dl 蛋白的降解速度会
超过合成速度, 导致 PSII反应中心遭受损伤和破坏,
其损伤速率直接与逆境胁迫的持续时间和胁迫程度
有关[17,27]。据本文对叶肉细胞类囊体膜蛋白组分的
SDS-PAGE 结果, 不同温度处理下类囊体膜蛋白的
特异条带基本完整, 但持续高温胁迫会导致类囊体
膜蛋白组分出现不同程度降解(图 3)。进一步对类囊
体膜 Dl 蛋白的 Western-blotting 检测与免疫胶体金
标记结果显示, 高温胁迫下非磷酸化 D1 蛋白和磷
酸化 D1 蛋白含量均有所下降(图 4)、类囊体堆叠区
域的 D1 蛋白免疫胶体金密度降低(图 5), 但在 D1
蛋白的两类不同存在形态中, 非磷酸化 D1 蛋白在
高温胁迫下的下降程度比磷酸化 D1 蛋白更明显(图
4)。由于 Dl蛋白在逆境胁迫下的磷酸化可避免遭受
损伤的 D1 蛋白被蛋白酶所识别, 延缓 Dl 蛋白的降
解和稳定 PSII 反应中心[24,28], 因此在考虑高温胁迫
影响Dl蛋白正常周转和 PSII功能受损的同时, 蛋白
质磷酸化对高温胁迫下 Dl 蛋白降解过程的缓解效
应也不应被忽视。此外, psbA基因的 mRNA转录是
D1蛋白合成的关键调控步骤[22]。在本文结果中, 高
温胁迫在引起磷酸化 D1蛋白和非磷酸化 D1蛋白不
同程度降低的同时, psbA基因的 mRNA表达量也明
显降低(图 4-下图), 说明高温处理对 D1蛋白合成或
周转过程的影响, 在 psbA基因的转录水平上已得到
表现, 而 psbA 基因在高温胁迫下的下调表达, 会导
致 D1 蛋白合成的转录过程和转录后的周转效率受
到抑制, 使 D1 蛋白的净损失不能得到及时“弥补”,
这可能是高温胁迫导致光合系统的结构与功能受
损、PSII光能转换效率降低的另一个重要原因。
PSII 是位于类囊体膜上的蛋白复合体, 而作为
构成 PSII 反应中心最基本框架的 D1 蛋白, 不仅能
为各种辅助因子提供结合位点, 维持 PSII 反应中心
构象的稳定, 而且还与原初电荷分离与传递有关[15],
因此Dl蛋白的破坏, 不仅会导致 PSII反应中心结构
的变化 , 而且会导致其电子传递效率的受阻或降
低[24]。多年来, 对于作物受到逆境胁迫后 PSII 反应
中心活性下调的原因, 国内外一直存在较大争议。
Rintamaki等[28-29]认为, 叶绿素荧光参数Fo值在逆境
胁迫下的增加是光合机构破坏引起的; 而 Anderson
等[30]则认为, PSII 反应中心活性在逆境胁迫下的下
调表现, 主要是与耗散过剩的光能、保护光合机构
免遭破坏有关。本文结果表明, 高温胁迫下叶绿素
荧光参数的 Fo值上升、Fm和 Fv/Fm值下降, 净光合
速率也明显降低, 揭示高温胁迫下 PSII 反应中心的
活性和功能均下降, 这与前人研究结果一致。对高
温胁迫处理 15 d叶片类囊体膜 Dl蛋白的Western印
迹与胶体金标记进一步表明, 高温胁迫所引起的叶
片净光合速率、叶绿素荧光参数 Fo上升和光合机能
下降, 与类囊体膜结构受到损伤有关, 且这种损伤
与 D1蛋白在高温胁迫下的降解、蛋白磷酸化和转录
调控等过程存在较密切联系。但由于人工气候箱的
空间限制, 本试验未能取得足够样品对不同温度处
理下 D1 蛋白在转录和蛋白翻译水平上的动态变化
进行分析, 因而尚不能完全排除在高温胁迫初期的
非光合机构变化因素对Fo值上升和 PSII活性下降的
影响。值得一提的是, 本研究中嘉 935 在高温胁迫
处理下结实率的下降幅度大于嘉 353, 但后者在高
温胁迫下的叶绿素浓度和叶绿素荧光参数(荧光 Fo、
Fm和 Fv/Fm)的下降或升高幅度却反而大于前者(表 1
和图 2)。与此同时, 嘉 353在高温胁迫下的 psbA基
因表达和非磷酸化D1蛋白的下降(或下调)程度也比
嘉 935明显(图 4), 这与叶绿素荧光参数在不同温度
第 6期 杨卫丽等: 高温胁迫对水稻光合 PSII系统伤害及其与叶绿体 D1蛋白间关系 1067


处理下的变化趋势相吻合, 但与供试品种之间在不
同温度处理下结实率的变化幅度趋势不一致。据此
笔者推测, 不同水稻品种在高温胁迫下的结实率变
化, 可能主要还是取决于其花器官在高温胁迫下的
耐热特性(如花粉育性、花粉开裂和花粉活力等), 而
与其在高温胁迫下的叶片光合机能下降没有必然联
系。
4 结论
高温胁迫下的叶片净光合速率下降与其叶绿素
荧光参数所反映的 PSII 潜在活性(Fv/Fo)和光能转化
效率(Fv/Fm)降低之间存在密切关系, 高温胁迫降低
叶片光合同化物生产能力的同时, 类囊体膜结构也
受到一定程度损伤, 叶片衰老进程加快; 高温胁迫
下非磷酸化 D1蛋白和磷酸化 D1蛋白的表达量均有
所下降, 但前者下降更明显, 以缓解高温胁迫对 D1
蛋白编码基因 psbA 转录表达和蛋白周转过程的抑
制效应; 高温胁迫对 psbA 基因表达和 D1 蛋白磷酸
化过程的调控作用, 与不同水稻品种间的叶片耐热
差异及其 PSII 系统的伤害程度有关; 高温胁迫会引
起类囊体堆叠区域的 D1 蛋白受到损伤, 胶体金标
记的颗粒密度出现较明显下降, 但对叶肉细胞中叶
绿素和线粒体等细胞器的形态结构影响不明显。
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