全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(8): 1416−1424 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2011CB100200)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张文会, E-mail: whzhang@lcu.edu.cn, Tel: 13563589359; 李学勇, E-mail: xueyong.li@caas.net.cn,
Tel: 010-82107409
第一作者联系方式: E-mail: houleiat1987@163.com, Tel: 13717947829
Received(收稿日期): 2012-02-02; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-06-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120604.0959.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01416
两个新水稻 Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定
侯 雷 1,2 袁守江 3 尹 亮 3 赵金凤 2 万国峰 1 张文会 1,* 李学勇 2,*
1 聊城大学生命科学学院, 山东聊城 252059; 2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北
京 100081; 3 山东省水稻研究所, 山东济南 250100
摘 要: 通过 EMS 诱变日本晴获得了 s2-9 和 s1-146a 两个矮秆突变体, 其植株矮小, 成熟期株高分别为日本晴的
26.3%和 19.2%; 苗期叶片较宽, 叶色深绿; 穗型仍为散穗但穗长变短, 粒型未发生改变。对水稻胚乳的 α-淀粉酶诱
导实验表明, 这 2 个矮秆突变体与 GA 的信号传导途径无关, 外源活性 GA3对水稻幼苗株高的促进实验显示它们应
与赤霉素的生物合成有关。利用突变体与籼稻品种 Dular 分别杂交构建了 F2群体, 精细定位表明这 2 个突变体的表
型与水稻 Dwarf18 (D18)基因紧密连锁。序列分析发现这 2 个矮秆突变体的 D18 基因均发生了突变, 在 s2-9 突变体
中 D18基因的内含子 3 拼接点发生单碱基突变, s1-146a中 D18基因编码区的单碱基突变导致提前终止密码子的出
现。RT-PCR结果显示, 在 s1-146a中 D18基因表达明显增强, 但在 s2-9中未检测到 D18基因的表达。
关键词: 水稻; 矮秆突变体; Dwarf18; 赤霉素; 精细定位
Phenotypic Analysis and Molecular Characterization of Two Allelic Mutants of
the Dwarf18 Gene in Rice
HOU Lei1,2, YUAN Shou-Jiang3, YIN Liang3, ZHAO Jin-Feng2, WAN Guo-Feng1, ZHANG Wen-Hui1,*, and
LI Xue-Yong2,*
1 School of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252059, China; 2 National Key Facility for Crop Gene Resource and Genetic Improvement,
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3 Shandong Rice Research Institute, Jinan 250100, China
Abstract: We identified two strong dwarf mutants from Nipponbare by EMS mutagenesis, designated as s2-9 and s1-146a. The
plant height of these two mutants was 26.3% and 19.2% of that of Nipponbare at the mature stage. They also had wider and dark
green leaf at seedling stage. The GA3 treatment of seedling and α-amylase activity analysis in endosperm showed that the mutated
gene was involved in GA biosynthesis. Fine mapping showed that the mutant phenotype was tightly linked with the D18 locus.
There was a single nucleotide substitution at the 3-splicing site between the first intron and the 2nd exon in s2-9, whereas there
was a single nucleotide substitution in the 2nd exon in s1-146a, which caused a premature stop codon. Semi quantitative RT-PCR
revealed that transcript of the D18 gene was up-regulated in s1-146a as compared to WT, but was not detected in s2-9.
Keywords: Rice; Dwarf mutant; Dwarf18; GA; Fine mapping
赤霉素(GA)是一类大的四环双萜类化合物家族,
作为植物激素, 在高等植物的多个生长发育阶段中
具有十分重要的作用 , 如促进种子萌发、茎的伸
长、开花的诱导、种子和果实的生长等[1]。研究表
明 GA 主要通过两种机制影响植株茎的伸长, 进而
对植物株高产生影响。Bleecker等[2]的研究发现 GA
能激活第一节间居间分生组织的细胞分裂, 缩短细
胞分裂周期, 从而增加节间细胞数目; 还有研究显
示 GA通过诱导伸展蛋白(Expansin)的产生或活性增
加[3-4]、提高木葡聚糖转葡糖苷酶(XET)的活性[5-6]和
促进微管与细胞长轴呈垂直排列[7]等 3 种方式对植
物细胞的伸长起促进作用。通过对水稻、玉米、豌
豆和拟南芥等[8-12]的研究, 已经鉴定了许多 GA响应
的矮化突变体。例如: 玉米 d1和豌豆 le突变体可以
第 8期 侯 雷等: 两个新水稻 Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定 1417
在外源活性 GA1 处理时恢复野生型表型 , 但给予
GA1的合成前体 GA20时则不能恢复表型; 突变体植
株能够大量积累 GA20 并以较低的效率将其转化成
GA1。研究表明, 玉米 D1 基因和豌豆 LE 基因编码
催化该合成过程的 GA 3β-羟化酶[13-15]。
在水稻中, d18突变体已被证明是对 GA响应的
矮化突变体[8]。已经鉴定了几个等位突变体[8,16], 其
中 d18-AD 和 d18h 为强等位突变, 表型为植株严重
矮化; d18-dy 和 d18k 为弱等位突变, 表型为植株半
矮化。截至目前, 只有 d18-dy 被深入地进行了生理
生化方面的研究。d18-dy 的矮化表型可以通过施加
外源的 GA1 得到恢复, 但施加 GA20 则不能恢复表
型。幼苗期的 d18-dy 突变体体内缺乏 GA1, 但大量
积累GA1的合成前体GA20[17]。d18-dy突变体体内的
GA20到 GA1的转化效率明显低于野生型植株, 这表
明 D18基因是一个编码 GA 3β-羟化酶的基因[18]。
研究表明, 在水稻体内存在 2种 GA 3β-羟化酶
基因, 其中, OsGA3ox1位于第 5染色体, OsGA3ox2位
于第 1号染色体, 与 D18基因等位[17,19-20]。
为了研究 D18基因的功能以及各结构域对其功
能的影响, 我们鉴定了 2 个严重矮化的 D18 强等位
突变体 , 并对其表型分析及分子鉴定。在突变体
s2-9 中 , 拼接点的突变导致了其矮化表型 , 这在
D18等位突变体中尚未见报道。
1 材料与方法
1.1 实验材料获得与群体构建
从化学诱变剂甲基磺酸乙酯(ethyl methylsulfonate,
EMS)诱变日本晴的 M2代中获得了 s2-9 和 s1-146a
两个矮秆突变体。与籼稻品种 Dular 杂交, 获得 F2
代群体中的矮化个体作为基因定位群体。
1.2 性状调查
在水稻抽穗期考察 s2-9 和 s1-146a 矮秆突变体
和野生型(日本晴)的多项重要形态指标, 包括株高、
穗型、粒型、穗长、粒数、粒长、粒宽、节间长度等。
1.3 GA处理水稻幼苗
参考王慧等[21]的方法, 选取籽粒饱满、大小一
致的种子, 用 0.1% HgCl2溶液消毒 5 min, 用蒸馏水
洗涤 3 次, 将种子置于剪掉底部的 96 孔 PCR 板上,
分成 6组, 每组 10粒。将 PCR板置于大培养皿中, 室
温浸种 24 h, 并于 37℃培养箱催芽 1 d, 观察发芽情
况及培养皿中水分多少并适当补充水分。发芽后于
28℃光照培养箱内水培, 1 周后, 分别加入 5、10、
20、30和 40 mg L−1的外源赤霉素(GA3)溶液 400 mL,
以等量蒸馏水为对照, 7 d后测量株高。3次重复实
验, 对试验数据进行方差分析, 比较各组处理间株
高的差异显著性。
1.4 α-淀粉酶活性测定
采用 Lanahan 等[22]的碘熏蒸法测定水稻籽粒糊
粉层的 α-淀粉酶活性。配制 0.2%马铃薯淀粉(SIGMA,
S4251-100)溶液(含 2%琼脂、10 mmol L−1 NaAc和 2
mmol L−1 CaCl2, pH 5.3)。高压灭菌, 冷却后于无菌
条件下每升马铃薯淀粉溶液加入 1 mL 氨苄青霉素
(50 mg mL−1), 分装为 2瓶, 一瓶加入 GA3使终浓度
为 1 µmol L−1, 另一瓶不加 GA3作为对照, 然后用其
制备固体淀粉培养平板。将水稻种子去壳后用 30%
的次氯酸钠表面灭菌 30 min, 再用蒸馏水清洗 6次,
彻底去除次氯酸钠。将种子横切, 去掉有胚的一半,
将另一半垂直放在淀粉平板上, 用封口膜密封培养
皿 , 30℃黑暗条件下培养 4 d。用碘 (上海沪试 ,
10011517)蒸汽熏蒸培养皿, 使淀粉平板染色。由于
淀粉酶能分解淀粉, 使分泌淀粉酶的种子周围无色
透明, 不能分泌淀粉酶的种子周围仍为蓝紫色。
1.5 群体 DNA提取及检测
采用 CTAB法提取水稻全基因组 DNA[23], 并经
1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 含量。筛选含量较一
致的 10株 F2代突变个体的 DNA等量混合成池, 用
于连锁标记的筛选。
1.6 基因定位
使用本实验室根据籼、粳稻序列之间的插入或
缺失差异设计的 170 个 InDel 标记进行基因的初步
定位。通过比对日本晴、Dular、F1 代、F2 代 DNA
混池之间的标记多态性确定可能与目的基因连锁的
InDel 标记(表 1)。再用 64 株 F2代单株验证这些标
记是否确实与目的基因连锁, 将目的基因定位在一
个较大的区间内。使用的 PCR 扩增体系为 10×PCR
Reaction buffer 1 µL, 引物(4 µmol L−1) 1 µL, 模板
DNA 1 µL, dNTP (2.5 mmol L−1) 0.1 µL, TIANGEN
Taq DNA聚合酶(5 U µL−1) 0.1 µL, 补超纯水至 10
µL。PCR 扩增条件为 94℃预变性 5 min, 94℃变性
30 s, 57℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 循环数为 35,
72℃延伸 5 min。8%聚丙烯酰胺凝胶电泳 200 V 1.5 h,
硝酸银染色后照相分析。
1.7 基因精细定位
利用本实验室已测序的籼稻品种 Dular 全基因
组序列(待发表)与 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.
1418 作 物 学 报 第 38卷
表 1 本研究所用的引物
Table 1 Primers used in this study
引物
Primer
正向序列
Forward sequence(5−3)
反向序列
Reverse sequence(5−3)
C1-1 AGGGGAAGAAAAACCTGACC CCGCGTGCAGATAAAGTACA
R1-1 GTTCATGGACCTCATGGTAA CTCTGTTAGGTCCTGTGTG
C1-H4 CCTCTTCACCTGCACTAAAG CGTGTCGTAAGAACTGGAAC
C1-H16 CAGAAGTTCAGAGGAAGTCT GAGCAGAGTAAATTCCTGCG
C1-H20 ATGACGGGCAGAGACGAGCA TCTCATTCCAACAGCCTCTC
C1-H5 CATGAAGCATCCATGAGAGT GGGACTGGGATTTGTTGAAG
R1-2 CTTACCTGGGATAGCAACTC CTATCGACTAGTCTATGTG
S1-3-1 CTGGCAAAAATCTGCATTGA AACGGGATCTAAGCCAAGGT
D18S1 GTGGCTGCATGTGAGAATGT AAGGTGAAGAAGCCCGAGTC
D18S2 CATCTCCTCCTTCTTCTCCA CTCTTCTCTCTTGCTTGAAG
D18 RT-PCR GTGTGTTGCTCTCTGGTCAT GATCGAGGTAGCTAGTAGCT
ACTIN1 RT-PCR TCCATCTTGGCATCTCTCAG GGTACCCTCATCAGGCATCT
gov/)上提供的粳稻品种日本晴基因组序列比对, 选
取在已定位区间内插入或缺失 20~30 bp范围内的多
态性区域, 设计扩增片段长度为 200 bp左右的 InDel
标记引物(表 1)。扩大基因定位群体, 进一步缩小定
位区间。
1.8 候选基因分析
通过 Rice Genome Annotation Project (水稻基因
组注释系统)网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)确
定与目的基因紧密连锁的标记在水稻基因组上的位
置 , 查阅位于基因精细定位区间内的所有编码框
(ORF), 并分析可能的候选基因。
1.9 基因序列分析
使用高保真酶 PrimeSTAR (TaKaRa)扩增候选基
因DNA片段, 将扩增产物直接送上海英骏生物技术
有限公司北京测序部测序。使用 DNAStar软件比对
分析测序结果。
1.10 RNA的提取及半定量检测
培养日本晴、s2-9和 s1-146a至二叶苗期, 使用
RNA 提取试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)提
取幼苗 RNA, 反转录获得 cDNA, 以 cDNA 为模板
扩增内参基因 Actin1, 循环数为 25, 调节模板 cDNA
添加量使 Actin1 扩增量趋于一致 , 使用该模板
cDNA 添加量同时扩增日本晴、s2-9 和 s1-146a 的
D18基因。PCR体系为 2×LA GC buffer 5 µL, 引物
(10 µmol L−1) 0.5 µL, 模板 cDNA(日本晴: 0.5 µL,
s2-9: 0.5 µL, s1-146a: 0.3 µL), dNTP (2.5 mmol L−1) 1
µL, LA DNA聚合酶(5 U µL−1) 0.1 µL, 补超纯水至
10 µL。PCR扩增条件为 94℃预变性 1 min, 94℃变
性 30 s, 57℃退火 30 s, 72℃延伸 90 s, 循环数为 38,
72℃延伸 10 min。
2 结果与分析
2.1 田间性状调查分析
突变体 s2-9 和 s1-146a 分别与籼稻品种 Dular
杂交然后自交配制 F2群体。随机调查 200株 F2个体
的株高表型, 经过 χ2检测正常与矮化植株的分离比
均接近 3∶1 (表 2), 表明这 2个矮秆突变体的矮化性
状均受单基因控制, 并且矮化为隐性突变。
表 2 F2群体矮化与正常植株的分离情况
Table 2 Segregation of dwarf and normal plants in the F2
populations
杂交组合
Cross combination
正常植株
Normal
矮化植株
Dwarf
总数
Total
χ2
(3:1)
s2-9/Dular 154 46 200 0.22
s1-146a/Dular 151 49 200 0.12
成熟期 s2-9 和 s1-146a 的株高与野生型相比显
著矮化(图 1-A), 分别只有野生型株高的 26.3%和
19.2% (表 3)。成熟期 s2-9和 s1-146a与野生型的穗
型均为散穗(图 1-A, B), 但穗长仅为野生型的 38.3%
和 30.8%, 每穗籽粒数显著减少(表 3)。突变体的粒
型没有变化(图 1-C), 粒长、粒宽和籽粒长宽比与野
生型差异不显著(表 3)。
2.2 s2-9和 s1-146a的节间变化
水稻株高主要受到两方面的影响: 节间长度与
节间数目, 二者亦可同时影响株高。Takeda[24]的矮
秆突变体节间伸长模型将水稻矮秆突变体划分为 5
第 8期 侯 雷等: 两个新水稻 Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定 1419
图 1 野生型、s2-9和 s1-146a株型、穗型和粒型对比
Fig. 1 Phenotypes of plant, panicle, and grain of WT, s2-9, and s1-146a
A: 成熟期株型; B:穗型; C:粒型。
A: phenotype of plant at maturity stage; B: phenotype of panicle; C: phenotype of grain.
表 3 野生型、s2-9和 s1-146a的主要农艺性状特征值
Table 3 Agronomic traits of WT, s2-9, and s1-146a (value = mean ± SE, n = 50)
性状 Trait 野生型 Wild type s2-9 s1-146a
株高 Plant height (cm) 101.30±3.86 26.67±1.61** 19.45±1.98*
穗长 Panicle length (cm) 23.50±0.91 9.02±0.32** 7.25±0.28**
每穗粒数 Grains per panicle 119.60±4.76 29.40±2.68** 25.90±2.57*
粒长 Grain length (mm) 7.43±0.25 7.03±0.25 6.76±0.32
粒宽 Grain width (mm) 3.43±0.10 3.38±0.12 3.34±0.10
粒长宽比 Length/width ratio of grains 2.16±0.10 2.08±0.11 2.03±0.11
*和**分别表示野生型与突变体相比在 P<0.05和 P<0.01水平上差异显著。
*, ** Significantly different at P<0.05 and P<0.01, respectively.
种类型, 分别为 dn、dm、d6、nl和 sh (图 2-C): 正
常水稻植株的类型为 N; dn 类型为各个节间比例与
N型相同; dm类型为第二节间严重缩短; d6类型为
第一节间正常, 其他节间均严重缩短; nl类型为第一
节间缩短, 其他节间正常; sh 类型为第一节间严重
缩短, 其他节间正常。图 2-A 和 B 显示, s2-9 和
s1-146a矮秆突变体的节间比例相似, 第二、三、四
节间均比野生型显著缩短, 属于 d6类型。
2.3 幼苗株高对 GA处理的响应
外源活性 GA3处理后, 野生型和 2 个突变体幼
苗株高相对于未加 GA3 的对照均显著增高。外源
GA3浓度较低时(5 mg L−1)突变体株高已接近但仍未
超过野生型(图 3-A, B); 较高浓度 GA3处理时, 2个
突变体株高均显著增加, s2-9 株高甚至超过了野生
型; 当GA3浓度为 20 mg L−1时幼苗株高增长幅度最
大(图 3-C)。属于 GA钝感型的 d1突变体(本实验室
尚未发表)对 GA3的响应则明显弱于野生型、s2-9和
s1-146a, 株高在各个处理浓度下变化不明显 (图
3-C)。Miyako 等[25]的研究表明 D1 蛋白与 GA 的信
号传导途径相关, 由于 s2-9和 s1-146a突变体对 GA
的响应与 d1突变体不同, 应与 GA的信号传导途径
无关, 可能参与 GA的生物合成。
2.4 s2-9和 s1-146a的矮化表型与 GA的合成有关
为了进一步证明 s2-9 和 s1-146a 的突变基因参
与 GA 的生物合成途径而非信号传导途径, 本研究
做了 GA3对 α-淀粉酶的诱导实验(图 4)。结果显示,
在GA3处理下, s2-9和 s1-146a的响应与野生型相同,
均能诱导 α-淀粉酶的表达。说明 s2-9 和 s1-146a 对
GA 响应不受影响, s2-9 和 s1-146a 的矮化表型应该
与 GA的合成有关。
2.5 s1-146a突变基因定位及物理图谱构建
使用本实验室发展完善的均匀分布于水稻染色
体上且在粳稻日本晴和籼稻 Dular 之间存在多态性
的 InDel定位标记, 在第 1染色体上共筛选出了 4个
可能与导致 s1-146a 矮化的突变基因连锁的 InDel
标记(C1-1, R1-1, R1-2和 S1-3-1)(表 1)。然后用这 4
个标记检测 64株 F2代群体中的矮化突变单株, 得到
这些标记与突变基因之间的遗传距离分别为 6.32
cM (C1-1)、5.14 cM (R1-1)、7.65 cM (R1-2)和 18.3
cM (S1-3-1)。分析发现导致 s1-146a矮化的突变基因
位于 R1-1和 R1-2之间, 2个标记之间的物理距离为
2.6 Mb (图 5-A)。
1420 作 物 学 报 第 38卷
图 2 野生型、s2-9和 s1-146a节间伸长模式
Fig. 2 The internodes elongation mode of WT, s2-9, and s1-146a
A: 野生型、s2-9和 s1-146a的节间形态; B: 野生型、s2-9和 s1-146a的相对节间伸长长度; C: 矮秆突变体节间伸长模型。
A: Phenotypic exhibition of internodes of WT, s2-9, and s1-146a; B: Relative length of internodes of WT, s2-9, and s1-146a; C: Internodes
elongation patterns of various rice dwarf mutants and wide type.
将定位群体扩大到 1 258 株 F2代矮化单株, 使
用标记 R1-1 和 R1-2 检测。在 R1-1 标记处共发生
43个重组事件, 在 R1-2处共发生 65个重组事件。
根据粳稻品种日本晴和籼稻品种 Dular 基因组
序列之间的差异, 在 R1-1至 R1-2的区间内设计了 4
对 InDel标记, 使用这些标记检测在 R1-1和 R1-2处
发生的 108个重组事件, 在 C1-H4、C1-H5、C1-H16
和 C1-20 (表 1)处的重组事件分别为 7、9、4和 6。
根据该检测结果最终将导致 s1-146a 矮化的突变基
因精细定位在 C1-16和 C1-20之间的区域内。C1-16
位于 BAC克隆 AC105319上, C1-20位于 BAC克隆
AC137928上, 2个标记之间的物理距离为 53 kb (图
5-B)。
s2-9的基因以同上方法也被定位在这一区间内。
2.6 s1-146a基因精细定位区域内候选基因分析
使用 Rice Genome Annotation Project (水稻基因
组注释系统)网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)预
测该定位区间内的基因, 共得到 3 个开放读码框(图
5-C和表 4)。其中 LOC_Os01g08220编码 GA 3β-双
加氧酶, 该酶能够催化 GA 生物合成中的多个生化
反应, 如催化 GA20合成 GA1、催化 GA5合成 GA3、
催化 GA44合成 GA38和催化 GA9合成 GA4, 在水稻
GA的生物合成中具有重要作用, 在水稻 d18突变体
中缺失该氧化酶活性时表现出矮化性状[14]。鉴于此,
将 LOC_Os01g08220 (D18)确定为候选基因。
2.7 候选基因序列分析
使用引物设计软件 Primer PREMIER 对候选基
因 D18 的基因组 DNA 序列设计测序引物(表 1), 扩
第 8期 侯 雷等: 两个新水稻 Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定 1421
图 3 s2-9和 s1-146a幼苗对 GA3处理的响应
Fig. 3 Seedling height of s2-9 and s1-146a with GA3 treatments
A: 未处理; B: GA3 (5 mg L−1)处理; C: 不同浓度 GA处理下的苗高。
A: without GA3 treatment; B: with GA3 (5 mg L−1) treatment;
C: seedling height with different GA3 concentration.
图 4 α-淀粉酶诱导响应实验
Fig. 4 GA induction of α-amylase in s2-9, s1-146a, and WT
GA3+: 添加了 GA3 (1 µmol L−1); GA3− : 未添加 GA3。
GA3+: with GA3 (1 µmol L−1) treatment; GA3−: without GA3
treatment.
增目的片段 S1和 S2并测序。使用 DNAStar软件将
测序结果与从 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
查到的D18 (GenBank登录号为AB056519)的基因序
列比对分析, 发现 s2-9 和 s1-146a 突变体的 D18 基
因均发生了突变: s2-9的D18基因内含子的 3拼接位
点发生单碱基突变, 由 AG变为 AA, 导致其第 1 个
图 5 s1-146a突变基因的精细定位
Fig. 5 Fine mapping of s1-146a mutated gene
表 4 定位区间内基因功能注释
Table 4 Genes annotated in mapping region
编号 No. 基因座位 Locus ID 基因功能注释 Gene function annotation 位置 Location
1 LOC_Os01g08190 Transcriptional corepressor LEUNIG, putative, expressed Chr.1: 3 975 902–3 984 922
2 LOC_Os01g08200 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14, putative, expressed Chr.1: 3 986 612–3 995 398
3 LOC_Os01g08220 Gibberellin 3-beta-dioxygenase 2-2, putative, expressed Chr.1: 4 003 659–4 004 946
1422 作 物 学 报 第 38卷
和第 2个外显子在转录后无法正常拼接; s1-146a的
D18 基因编码区第 633 个碱基由 G 变成了 A, 导致
其第 211位密码子由编码色氨酸的 TGG变为终止密
码子 TGA, 使蛋白质的合成提前终止(图 6)。
图 6 D18基因结构和突变位点
Fig. 6 Gene structure and mutation sites in D18
2.8 D18基因在 s2-9和 s1-146a突变体中的表达
对 s2-9 和 s1-146a 突变体的 D18 基因半定量
RT-PCR检测, 以 Actin1为内参(表 1)。在 s2-9中未
检测到 D18 基因的表达。可能是由于 s2-9 的 D18
基因拼接位点的突变使其无法正常完成拼接, 或使
其稳定性降低, 合成后很快被降解。在 s1-146a 中
D18 基因表达量明显高于野生型, 可能是 GA 合成
途径中下游基因的反馈调节造成的(图 7)。
图 7 半定量 RT-PCR检测 D18在野生型和突变体中的表达量
Fig. 7 Semi-quantitative reverse transcription (RT)-PCR
analysis of D18 in WT and mutants
3 讨论
赤霉素在植物的生长发育过程中具有十分重要
的调节作用[1]。根据矮化植株对赤霉素响应的不同,
可将其划分为赤霉素缺陷型和赤霉素钝感型。赤霉
素缺陷型矮化突变体是指活性赤霉素的生物合成途
径被抑制或阻断, 造成植物体内源活性赤霉素缺乏
或含量较低, 这类突变体在施加外源赤霉素后可恢
复野生型表型; 赤霉素钝感型矮化突变体, 其内源
活性赤霉素水平变化不大, 有时甚至比野生型的还
高, 这种矮化表型的突变体在外施活性赤霉素后不
能恢复野生表型[26]。本研究对 s2-9 和 s1-146a 的外
源赤霉素处理发现, 处理一段时间后, 二者株高均
明显增高, 并与野生型高度相当。而同时期处理的
属于赤霉素钝感型的 d1 突变体株高变化则不明显,
这些现象均表明 s2-9 和 s1-146a 突变体均属于赤霉
素缺陷型矮化突变(图 3)。α-淀粉酶的诱导实验也表
明 s2-9和 s1-146a属于赤霉素合成缺陷型(图 4)。这
两个实验证明导致 s2-9 和 s1-146a 矮化表型的 D18
突变基因在赤霉素的生物合成过程中具有重要作用。
目前已经鉴定了几个 D18 等位突变体[8,16]。其
中 d18-AD和 d18h为强等位突变体; d18-dy和 d18k
为弱等位突变体。强等位突变会导致植株产生严重
的矮化表型, 弱等位突变则会导致半矮化。本研究
报道的 s2-9和 s1-146a株高分别只有野生型的 26.3%
和 19.2%, 表现出明显的矮化特征(图 1-A)。这表明
导致 s2-9和 s1-146a矮化的 D18等位基因是强等位
突变, 其功能丧失或减弱后对植株株高的影响十分
明显。如图 8 所示 , GA3ox2 蛋白有 DIOX_N 和
2OG-FeII_Oxy 2个功能结构域, 它们与 GA 3β-羟化酶
的催化活性密切相关[20]。强等位突变体 d18-AD [8,16]、
d18h [8,16]、s2-9和 s1-146a 中 D18基因的突变均导
致其功能结构域的破坏或缺失, 使其编码的 GA 3β-
羟化酶完全失去催化活性, 不能催化合成具有生物
活性的 GA, 突变体植株表现出严重矮化表型; 弱等
位突变体 d18-dy 和 d18k 中 D18 基因的突变未影响
到GA 3β-羟化酶功能结构域的完整性, 该酶依然具有
部分的催化活性, 能合成少量的活性 GA, 突变体为
半矮化。
Tomoaki等[16]的研究显示 D18 (OsGA3ox2)在水
稻的营养器官和生殖器官中均表达, 而 OsGA3ox1 只
在水稻的生殖器官中表达。本研究中, s2-9和 s1-146a
的穗型、粒型、育性与野生型相比并无明显变化(图
1-B, C), 分析可能是由于 D18 突变后, 其在水稻的
生殖器官和营养器官中均不能表达有功能的 GA3ox2,
图 8 GA3ox2蛋白结构域与多个 d18等位突变体中的突变位点
Fig. 8 GA3ox2 functional domains and mutation sites in several d18 allelic mutants
第 8期 侯 雷等: 两个新水稻 Dwarf18基因强等位突变体的表型分析及分子鉴定 1423
但 OsGA3ox1 基因在生殖器官中的表达弥补了
GA3ox2 的缺失, 并替代其行使正常的生物代谢功
能, 故 s2-9 和 s1-146a 的穗型、粒型、育性并未受
到 D18 基因突变造成的影响; 但 OsGA3ox1 基因不
在水稻的营养器官中表达, 使 s2-9 和 s1-146a 表现
出严重的矮化性状。
本研究表明, 相对于野生型, s1-146a 突变体中
D18 基因的表达量明显增强, 而在 s2-9 突变体中则
未检测到 D18 基因的表达。D18 基因表达产物
GA3ox2 能够催化合成具有生物活性的 GA1, 当
GA3ox2失去活性或无法合成时, 其催化合成的GA1
必然会减少, 但 GA1 是植物生长发育所必需的, 赤
霉素的信号传导途径势必会对赤霉素合成途径反馈
调节 , 使突变体的 D18 基因表达量增加 , 所以
s1-146a突变体中 D18表达明显强于野生型; s2-9突
变体的 D18 基因的 3拼接点发生碱基突变, 可能影
响 D18 基因 mRNA 前体的剪接, 不能合成完整的
mRNA或 mRNA的稳定性受到影响, 合成后很快被
降解。
真核生物基因的内含子以 5 GT—AG 3为界限,
水稻基因拼接点(GT/AG)的碱基突变鲜有报道 , 在
D18 的等位突变中更是第一次被发现 , 但其对
mRNA影响的机制还有待进一步研究。
4 结论
使用 EMS 诱变获得了 2 个 D18 基因的强等位
突变体, 均表现出严重矮化特征, 但穗型、粒型和结
实性未受影响, 这在已报道的赤霉素相关突变体中
是非常少见的。D18基因与赤霉素的生物合成有关,
主要影响水稻的营养生长。在发生拼接点碱基突变
的 s2-9突变体中未检测到 D18基因的表达, 进一步的
研究可能揭示其对 mRNA拼接或稳定性的影响机制。
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