全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(2): 219−227 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由作物种质资源保护项目(NB04-07), 国家科技基础条件平台建设项目(2004-06DKA), 国家“十一五”科技支撑计划(2006BAD02B08),
农业科研专项资金(nykyzx07-017)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 程须珍, E-mail: Chengxz@caas.net.cn; Tel: 010-62189159
第一作者联系方式: E-mail: xuning2008@163.com
Received(收稿日期): 2008-05-08; Accepted(接受日期): 2008-10-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00219
用于中国小豆种质资源遗传多样性分析 SSR分子标记筛选及应用
徐 宁 程须珍* 王丽侠 王素华 刘长友 孙 蕾 梅 丽
中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
摘 要: 以 375份小豆核心种质为试验材料, 利用从小豆及其近缘种 SSR引物中筛选出的 13对引物进行遗传多样性
分析。检测结果显示, 小豆种质资源具有丰富的遗传多样性, 共检测到 133个等位变异, 每对 SSR引物检测到等位变
异 4~19 个, 平均 10.23 个, 国内各省多态信息含量(PIC)平均为 0.561, 多态位点比例(PP)平均为 93.523%。聚类结果
表明, 小豆资源遗传关系与生态分区间有明显的联系, 且东北地区资源与中南部资源遗传关系较近。湖北、安徽、陕
西 3省资源的 PIC较高, 且基本位于主坐标三维图的中心区域, 推断湖北、安徽和陕西是中国栽培小豆的起源地或多
样性中心。该结果有助于更好地对小豆种质资源进行收集、保护和利用。
关键词: 小豆; SSR; 遗传多样性
Screening and Application of SSR Molecular Markers for Genetic Diversity
Analysis of Chinese Adzuki Bean Germplasm Resources
XU Ning, CHENG Xu-Zhen*, WANG Li-Xia, WANG Su-Hua, LIU Chang-You, SUN Lei, and MEI Li
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Adzuki bean [Vigna angularis (Willd) Ohwi & Ohashi] is a major food legume in China, with special functions in peo-
ple’ life and agricultural production. In order to evaluate the genetic diversity of adzuki bean germplasm and provide information
for gene mining and plant breeding, a total of 375 accessions of adzuki bean core collection were analyzed with 13 pairs of mi-
crosatellite (SSR) markers screened from SSR primers of adzuki bean and its relatives. A wide genetic variation was observed in
all collections. Four to nineteen alleles per SSR primer pair were detected with an average of 10.23 alleles. The mean of poly-
morphism information content (PIC) and the percentage of polymorphic loci (PP) for the collections in China were 0.561 and
93.523%, respectively. The dendrogram by UPGMA cluster analysis among populations showed that there were correlations be-
tween the groups clustered and their putative geographic origins, and the collections from northeast had a closer genetic relation-
ship with that from middle-south region of China. SSR data showed that PIC in Hubei, Shannxi, and Anhui provinces was the first
three high, which almost located in the central part of the three dimensions of PCO (principal coordinate analysis). We concluded
that Hubei, Shannxi, and Anhui provinces were the origin or diversity center of cultivated adzuki bean in China. The results could
be available for collection, conservation, and utilization of adzuki bean germplasm resources.
Keywords: Adzuki bean (Vigna angularis); SSR; Genetic diversity
小豆[Vigna angularis (Willd) Ohwi & Ohashi]是
我国主要食用豆类作物, 在农业生产和人民生活中
具有独特的作用。中国是小豆的起源国, 资源拥有
量居世界第一位[1], 东北、华北、黄河中下游和长江
中下游地区种植面积最大, 但长期以来小豆一直被
看作是“小作物”, 基础性研究相对比较薄弱。近年来,
应用 DNA分子标记评价小豆种质资源遗传多样性
的工作也已逐步开展, 但广泛使用的分子标记多为
RAPD[2-6]和 AFLP[7-12]。SSR分子标记具有揭示遗传
变异多、共显性、结果稳定、操作简单等优点, 已
成为重要的研究工具。2004年, Wang等[13]用微卫星
富集法开发了 8对小豆 SSR引物, 用其分析了含 20
份材料的群体 , 其中 3份出现杂合带 , 并指出在此
群体中栽培种的基因已向野生种转移。此后一直没
220 作 物 学 报 第 35卷


有关于小豆 SSR研究的报道。
传统基因组 SSR引物的开发费时、费力、成本
高, 而近缘种引物也是 SSR 引物来源之一[14], 野生
大豆成功借用栽培大豆的 SSR 引物[15], 普通菜豆的
SSR 引物用于豇豆属物种间遗传变异的研究[16]。本
研究对文献中查到的小豆及其近缘种绿豆、豇豆和
普通菜豆 SSR引物进行筛选, 旨在填补国内 SSR分
子标记在小豆种质资源上应用的空白, 并从分子水
平上评价我国小豆资源的遗传多样性, 为有效利用
小豆种质资源及深入探讨栽培小豆在我国的传播提
供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
375份小豆核心种质[17], 含国内 366份, 即黑龙
江 15 份、吉林 20 份、辽宁 12 份、内蒙古 10 份、
河北 31份、北京 30份、天津 6份、山东 17份、河
南 19 份、江苏 10 份、山西 70 份、陕西 30 份、甘
肃 4 份、宁夏 2 份、安徽 22 份、湖北 38 份、湖南
7份、四川 4份、贵州 7份、云南 4份、广东 2份、
广西 3份、海南 1份、台湾 2份; 国外 9份, 包括澳
大利亚 1 份、朝鲜 1 份、日本 7 份。均由国家作物
种质库提供种子。
1.2 基因组 DNA制备
将试验种子浸泡 10~12 h后, 播种于营养钵, 置
20℃~25℃温室, 出苗 10 d后, 从每份材料的 5株幼
苗上采收刚要展开的嫩叶 0.3 g左右, 在液氮中研磨
成细粉; 依照 Mimura 等[5]的方法稍作修改后, 提取
基因组总 DNA, 放入−20℃冰箱备用。
1.3 SSR分析
供筛选 SSR引物 106对(表 1), 由北京赛百盛基
因技术公司合成。PCR 扩增体系 20 μL, 含 10 ng
μL−1 DNA模板 3 μL, 10×buffer 2 μL, 25 mmol L−1
MgCl2 1.2 μL, 2.5 mmol L−1 dNTPs 0.4 μL, 2 μmol
L−1正、反 SSR引物各 0.75 μL, 2.5 U μL−1 Taq DNA
聚合酶 0.24 μL, ddH2O 11.66 μL。反应程序为 95℃
模板预变性 3 min; 95℃变性 30 s, 47℃~68℃温度梯
度退火 45 s, 72℃延伸 45 s, 35个循环, 最后 72℃延
伸 5 min。扩增产物经用 6%聚丙烯酰胺变性凝胶, 在
60 W恒功率下电泳, 根据不同引物扩增产物的大小
确定适当的电泳时间。银染法[18-19]染色后读带, 照
相。

表 1 试验供筛选的 SSR引物
Table 1 Primers of SSR used in study
引物种类
Primer
分类
Class
引物数目
No. of primers
引物来源
Source of primers
小豆 SSR Azuki bean SSR 豇豆属 Vigna 8 Wang等[13]
绿豆 SSR Mungbean SSR 豇豆属 Vigna 41 Gwag等
[20], Kumar等[21], 澳大利亚刘春吉
博士实验室及泰国 Peerasak实验室
豇豆 SSR Cowpea SSR 豇豆属 Vigna 27 Li等[22]
普通菜豆 SSR Common bean SSR 菜豆属 Phaseolus 30 Zhang[23]

1.4 数据统计分析
在电泳图谱上, 清晰的条带记为“1”, 同一位置
上无条带记为“0”。SSR标记多态性指标以多态信息
含量(polymorphism information content, PIC)表示:
21 ijPIC f= −∑ [24],
式中, fij表示第 i个位点上, 第 j个等位基因的频率。
用 POPGENE Version 1.31 软件[25]计算平均等位变
异数目(NA)、有效等位变异数(NE)、实际观察杂合
度(HO)、多态位点比例(PP)、香农指数(SI)、基因流
(Nm)和遗传一致度 (GI)。根据遗传一致度 , 利用
NTSYS Version 2.10[26]软件中的 SHAN 程序和
UPGMA 方法进行聚类分析, 利用 EIGEN 程序进行
主坐标分析。
2 结果与分析
2.1 各种引物扩增情况
用 106 对 SSR 引物对 12 份表型性状差异较大
的材料进行扩增能力和扩增多态性筛选 , 8 对小豆
SSR 引物中的 7 对能够获得扩增产物并且显示出多
态性, 有效扩增率和多态性比率均为 87.5%。在 41
对绿豆 SSR引物中, 能够获得扩增产物的引物有 35
对, 具有多态性的引物有 4对。在 27对豇豆 SSR引
物中, 能够获得扩增产物的有 20 对, 具有多态性的
引物有 1对。在 30对普通菜豆 SSR引物中, 能够获
得扩增产物的引物有 19 对, 具有多态性的引物有 1
对(表 2)。
第 2期 徐 宁等: 用于中国小豆种质资源遗传多样性分析 SSR分子标记筛选及应用 221


表 2 各种引物扩增情况
Table 2 Amplification for different primer pairs
有扩增产物 Product 引物种类
Type of primers
引物数目
No. of primers 单态
Monomorphic
多态
Polymorphic
无扩增产物
No product
有效扩增率
Effective amplification
(%)
多态性比率
Polymorphism
(%)
小豆 SSR Azuki bean SSR 8 0 7 1 87.5 87.5
绿豆 SSR Mungbean SSR 41 31 4 6 85.4 9.8
豇豆 SSR Cowpea SSR 27 19 1 7 74.1 3.7
普通菜豆 SSR Common bean SSR 30 18 1 11 63.3 3.3

2.2 多态性引物分析
利用筛选得到的 SSR 引物(表 3)分析 375 份小豆
资源, 共检测到 133 个等位变异, 每对 SSR 引物等位
变异数为 4~19个, 平均为 10.23个。其中小豆引物 X3
的等位变异数最多, 为 19 个, 其次是 L52(18 个)、
X6(17个)、X2(16个), 普通菜豆引物C2最少, 为 4个。
不同 SSR 引物所揭示的参试材料多态信息含量(PIC)
介于 0.147~0.913之间, 平均为 0.678。PIC高于 0.800
的位点数有 6个, 占 46.2%, 小于 0.400的有 2个位点,
即 L62、J13, 这两个位点的等位变异数也较少。小豆、
绿豆、豇豆、普通菜豆 4种类型的 SSR引物检测到的
平均等位变异数目分别为 12.86、8.50、5.00、4.00, 所
揭示参试材料的平均 PIC分别为 0.773、0.662、0.147、
0.603(表 4)。部分扩增产物的电泳扫描照片见图 1。

图 1 引物 X5扩增结果
Fig. 1 PCR products amplificated with primer X5
M: pBR322 DNA/Msp I分子量标准; 1~67: 部分供试材料编号。
M: pBR322 DNA/Msp I markers; 1–67: No. of part adzuki bean collections used.

表 3 多态性引物
Table 3 Description of the polymorphic primers
多态性引物编号
Code of polymorphic primers
引物序列
Primer sequence(5′–3′)
退火温度
Annealing temp.
( )℃
目标片段长
Fragment size
(bp)
X1 F:GTGCAGCCACTACATGAATG; R:GAAGTTGACACTCATCCACC 62.3 110–123
X2 F:AGGCGAGGTTTCGTTTCAAG; R:GCCCATATTTTTACGCCCAC 58 90–123
X3 F:CCCGATGAACGCTAATGCTG; R:CGCCAAAGGAAACGCAGAAC 58 123–217
X4 F:CATCTTCCTCACCTGCATTC; R:TTTGGTGAAGATGACAGCCC 60 110–147
X5 F:TCAGCAATCACTCATGTGGG; R:TGGGACAAACCTCATGGTTG 56 123–201
X6 F:GATTGCTTTTAGCAGAGGGC; R:GAAGAAACCCATCTCGATCC 60 147–201
X8 F:AGGATTGTGGTTGGTGCATG; R:ACTATTTCCAACCTGCTGGG 65 123–180
L1 F:GCGAAGTGATCTTATCTGCT; R:GTCAAATCTGAACCATAAA 48 242–309
L52 F:GAGGCCAATCCCATAACTTT; R: AGCACCACATCAGAGATTCC 58 123–190
L62 F:ACCTGCAAGTTGGCAAGA; R:TATGTGCACGCATGGAAG 56 100–123
L63 F:TCCCTTGTGGGAGATCCT; R:CTTTGCCACACTCCTTGC 56 242–309
J13 F:GTCCAAAGCAAATGAGTCAA; R:TGAATGACAATGAGGGTGC 60 190–238
C2 F:TGCACAACACACATTTAGTGAC; R:CCTACCAAGATTGATTTATGGG 48 123–147

222 作 物 学 报 第 35卷


表 4 SSR标记的等位变异数目和多态信息含量
Table 4 Number of alleles and polymorphism information content for SSR markers
多态性引物编号
Code of polymorphic primers
等位变异数目
No. of alleles
多态信息含量
Polymorphism information content
X1 9 0.725
X2 15 0.878
X3 19 0.830
X4 12 0.805
X5 11 0.842
X6 17 0.901
X8 7 0.433
L1 6 0.776
L52 18 0.913
L62 5 0.343
L63 5 0.615
J13 5 0.147
C2 4 0.603
平均数 Mean 10.23 0.678

2.3 不同省域小豆种质资源遗传多样性比较
以每一个资源量不低于 4份的省份为一个群体,
依据 SSR 鉴定数据, 计算各群体小豆种质资源各项
遗传多样性参数(表 5)。湖北、陕西、安徽、河北、
北京是小豆遗传多样性较丰富地区, 其中湖北无论
是等位变异数(6.615)、多态信息含量(0.687), 还是香
农指数(1.460)在调查省份中都最大, 是小豆种质资
源最丰富的省份, 陕西次之, 安徽 PIC居第 3位, 这

表 5 13对 SSR引物在 20个小豆群体中检测到的遗传多样性参数
Table 5 Estimates of genetic parameters for 20 populations of Adzuki bean based on 13 SSR primers
组群
Population
份数
Number
平均等位
变异数
NA
有效等位
变异数
NE
实际观察
杂合度
HO
多态信
息含量
PIC
多态位
点数
NP
多态位点
比例
PP(%)
香农指数
SI
中国黑龙江 Heilongjiang, China 15 4.154 2.665 0.015 0.511 13.0 100.000 0.984
中国吉林 Jilin, China 20 4.769 3.101 0.042 0.568 12.0 92.310 1.120
中国辽宁 Liaoning, China 12 4.385 3.278 0.062 0.570 12.0 92.310 1.120
中国内蒙古 Inner Mongolia, China 10 3.923 2.775 0.046 0.558 12.0 92.310 1.029
中国北京 Beijing, China 30 5.692 3.480 0.062 0.609 12.0 92.310 1.247
中国天津 Tianjin, China 6 3.000 2.383 0.067 0.493 10.0 76.920 0.812
中国河北 Hebei, China 31 6.308 3.728 0.052 0.601 13.0 100.000 1.283
中国山东 Shandong, China 17 4.923 3.157 0.023 0.550 13.0 100.000 1.106
中国河南 Henan, China 19 5.077 3.049 0.037 0.592 13.0 100.000 1.179
中国山西 Shanxi, China 70 6.154 2.911 0.047 0.560 13.0 100.000 1.157
中国甘肃 Gansu, China 4 2.462 2.051 0.039 0.460 11.0 84.620 0.698
中国陕西 Shaanxi, China 30 6.462 4.025 0.038 0.640 13.0 100.000 1.358
中国江苏 Jiangsu, China 10 4.154 2.780 0.055 0.560 12.0 92.310 1.061
中国安徽 Anhui, China 22 5.385 3.714 0.034 0.621 13.0 100.000 1.257
中国湖北 Hubei, China 38 6.615 4.310 0.077 0.687 13.0 100.000 1.460
中国湖南 Hunan, China 7 3.308 2.655 0.055 0.522 11.0 84.620 0.944
中国四川 Sichuan, China 4 2.385 2.022 0.019 0.436 10.0 76.920 0.649
中国贵州 Guizhou, China 7 3.615 2.933 0.033 0.567 12.0 92.310 1.039
中国云南 Yunnan, China 4 2.846 2.453 0.019 0.552 13.0 100.000 0.892
平均 Mean 4.506 3.025 0.043 0.561 12.2 93.523 1.073
日本 Japan 7 3.154 2.546 0.022 0.562 13.0 100.000 0.952
NA: the number of alleles per locus; NE: the effective number of alleles per locus; HO: average observed heterozygosity; PIC: Poly-
morphism information content; NP: the number of polymorphic loci; PP: proportion of polymorphic loci; SI: Shannon’s index.
第 2期 徐 宁等: 用于中国小豆种质资源遗传多样性分析 SSR分子标记筛选及应用 223


与形态数据分析结果相一致(数据未发表)。虽然山西
小豆资源量大, 但遗传多样性并不是最高, 再一次
从分子水平上证明了资源份数多, 遗传多样性不一
定最大的论断。有效等位变异数(NE)与等位变异的
频率有关, 与平均等位变异数(NA)相比, 山西、北
京、河南、吉林、黑龙江、江苏等省份的有效等位
变异数较小, 说明这些省份极端频率的等位变异相
对较多。观察杂合度 HO 反映杂合位点在基因组中
所占的比例, 国内 19个省份实际观察杂合度平均为
0.043, 变化范围为 0~0.077, 说明尽管异交率很低,
小豆在天然条件下的杂交也是存在的。多态位点比
例是反映遗传多态的重要指标之一, 国内 19个省份
多态位点比例平均为 93.523%, 最高为 100%, 最低
为 76.920%, 有 15个省份多态位点比例大于 90%,
表明中国各省小豆的遗传多态性普遍较高。日本小
豆资源等位变异数(3.154)小于中国的平均值(4.506),
多态信息含量(0.562)与中国平均值(0.561)持平, 香
农指数(0.952)小于中国的平均值(1.073)。另外, 广西
的 3 份参试材料在每个位点都有自己独特的相同等
位变异类型。
2.4 聚类分析
20 个群体间的遗传一致度和基因流如表 6, 根据
遗传一致度运行 NTSYS(2.10)软件进行聚类(图 2), 可
分为 6 个组。中国东北三省、中国内蒙古与日本资源
聚为一组; 陕西、湖北、江苏、湖南和四川资源聚为
一组; 北京、山西、河北和天津资源聚为一组; 山东、
河南、甘肃和安徽资源聚为一组, 但没有将河南和甘
肃资源区分开来; 贵州和云南分别各为一组。可见, 对
群体的聚类结果与小豆生态分区有一定的关系。另外,
还可以看出东北地区资源首先与中南部资源聚在一起,
然后才与北方剩余各省资源聚到一起, 表明东北地区
小豆资源与中南部资源的遗传关系较近。

图 2 小豆种质资源 20个群体的聚类分析图
Fig. 2 Dendrogram of 20 populations of Adzuki bean germplasm resources based on genetic identity

有限的基因流是促进居群发生基因分化的主要
原因[27], 由表 6 可以看出各省间基因流的变化范围
为 0.756(甘肃与云南间)~9.225(北京与河北间), 其
中西南地区及甘肃省与其他各省资源间的基因流都
偏小, 平均都在 2.0以下, 而陕西、湖北、北京、河
北、安徽资源与其他各省资源间的基因流都较高 ,
平均在 3.1 以上。各省份间遗传一致度的变化范围
为 0.4055(甘肃与云南间)~0.9356(北京与河北间)。还
可以看出, 主产区内省份间基因流、遗传一致度普
遍较高, 这可能与省份间相互引种有关。另外, 中国
陕西与日本资源间基因流、遗传一致度最高, 东北
与陕西资源间, 华北、黄河中下游地区与安徽资源
间基因流和遗传一致度都普遍较高。
2.5 主坐标分析
根据遗传一致度, 作主坐标分析图(图 3)。从图
中可以看出 20个参试群体可以分成 4个部分, 中国
黑龙江、中国吉林、中国辽宁、中国内蒙古和日本
5个群体聚在一起, 组成第 1部分; 北京、天津、河
表6 20个群体间的基因流(Nm)(上三角)和Nei’s遗传一致度(GI)(下三角)
Table 6 Gene flow(Nm) (above diagonal) and Nei’s genetic identity(GI) (below diagonal) among 20 populations
群体
Population
黑龙江
Heilong
jiang,
China
吉林
Jilin,
China
辽宁
Liaoning,
China
内蒙古
Inner
Mongolia,
China
北京
Beijing,
China
天津
Tianjin,
China
河北
Hebei,
China
山东
Shandong,
China
河南
Henan,
China
山西
Shanxi,
China
甘肃
Gansu,
China
陕西
Shaanxi,
China
江苏
Jiangsu,
China
安徽
Anhui,
China
湖北
Hubei,
China
湖南
Hunan,
China
四川
Sichuan,
China
贵州
Guizhou,
China
云南
Yunnan,
China
日本
Japan
Heilongjiang,
China
3.520 2.587 2.656 2.469 1.061 2.093 1.549 2.017 2.503 1.166 2.793 1.840 1.948 3.190 1.423 1.116 1.606 1.263 2.397
Jilin, China 0.859 3.068 2.954 2.809 1.527 2.371 1.976 2.847 2.898 1.588 3.737 2.172 3.209 3.869 2.009 1.323 2.003 1.177 2.594
Liaoning, China 0.799 0.813 3.123 3.878 1.730 3.748 2.052 2.221 2.377 1.412 3.079 2.246 2.815 3.837 1.918 1.492 1.925 1.420 2.280
Inner Mongolia,
China 0.814 0.819 0.831 4.420 1.588 5.436 2.351 3.783 5.131 1.482 4.170 2.343 2.918 3.775 2.038 1.303 2.346 1.167 2.374
Beijing, China 0.772 0.780 0.839 0.873 4.600 9.225 3.547 5.766 7.007 1.816 4.638 2.684 4.888 4.313 1.876 1.358 2.205 1.455 2.428
Tianjin, China 0.678 0.683 0.740 0.728 0.920 3.271 2.069 2.513 2.785 1.219 2.309 1.390 2.553 1.921 1.144 0.933 1.065 0.916 1.357
Hebei, China 0.731 0.740 0.838 0.903 0.936 0.864 4.178 5.321 7.042 1.882 4.682 2.430 4.190 4.133 2.086 1.314 2.141 1.459 2.077
Shandong,
China 0.664 0.715 0.717 0.773 0.831 0.790 0.864 5.430 3.924 1.597 5.307 2.036 3.663 3.306 1.951 1.094 1.728 1.441 1.630
Henan, China 0.728 0.793 0.722 0.857 0.893 0.825 0.885 0.904 7.906 2.087 5.890 2.455 4.890 3.776 1.948 1.232 2.162 1.405 1.928
Shanxi, China 0.770 0.791 0.729 0.884 0.914 0.837 0.917 0.855 0.931 1.672 5.846 2.149 3.730 3.237 1.864 1.157 2.090 1.350 2.211
Gansu, China 0.621 0.7120 0.677 0.717 0.744 0.711 0.759 0.731 0.797 0.743 1.660 1.161 1.736 1.687 0.909 0.788 1.173 0.756 1.018
Shaanxi, China 0.791 0.832 0.782 0.862 0.847 0.795 0.854 0.891 0.893 0.890 0.711 4.303 4.926 7.134 3.008 1.691 2.583 2.019 3.239
Jiangsu, China 0.721 0.741 0.753 0.780 0.770 0.685 0.751 0.735 0.768 0.715 0.626 0.867 2.961 4.582 1.714 1.775 2.200 1.342 2.179
Anhui, China 0.708 0.811 0.775 0.800 0.864 0.826 0.844 0.842 0.875 0.828 0.734 0.859 0.805 4.993 2.472 1.398 2.450 1.441 2.180
Hubei, China 0.811 0.826 0.816 0.831 0.818 0.720 0.817 0.797 0.804 0.774 0.684 0.889 0.867 0.849 2.798 1.774 3.104 2.075 2.763
Hunan, China 0.648 0.726 0.722 0.750 0.677 0.624 0.699 0.731 0.705 0.663 0.541 0.810 0.702 0.764 0.774 1.003 1.457 1.297 1.670
Sichuan, China 0.654 0.673 0.719 0.703 0.662 0.627 0.642 0.624 0.643 0.595 0.575 0.745 0.789 0.688 0.740 0.622 1.106 0.953 1.375
Guizhou, China 0.663 0.703 0.686 0.772 0.691 0.557 0.682 0.664 0.713 0.684 0.623 0.722 0.757 0.729 0.760 0.637 0.630 1.061 1.917
Yunnan, China 0.557 0.454 0.569 0.500 0.496 0.483 0.542 0.562 0.542 0.499 0.406 0.632 0.572 0.513 0.626 0.592 0.579 0.445 1.104
Japan 0.792 0.779 0.748 0.780 0.743 0.662 0.688 0.654 0.688 0.716 0.549 0.809 0.759 0.718 0.745 0.690 0.712 0.709 0.480

第 2期 徐 宁等: 用于中国小豆种质资源遗传多样性分析 SSR分子标记筛选及应用 225


北和山西 4 个群体组成第 2 部分; 第 3 部分包括安
徽、河南、山东和甘肃 4 个群体; 第四部分包括陕
西、湖北、湖南、江苏、四川、贵州和云南 6 个群
体, 其中湖北、湖南、江苏、四川距离较近, 陕西、
贵州、云南较分散。可见, 主坐标分析图与聚类图
的大体趋势是相一致的。另外, 可以看出湖北、陕
西、安徽 3省基本位居三维图的中心区域, 说明这 3
个省份与分成的 4个部分遗传关系相对接近, 但湖
北倾向于南方各省, 陕西倾向于东北地区, 安徽倾
向于黄河中下游和华北地区。

图 3 20个群体小豆种质资源主坐标分析三维图
Fig. 3 Three dimensions of PCO for Adzuki bean germplasm resources from 20 populations

3 讨论
SSR 标记的引物有 4 种来源[28], 即相关文献、
近缘种的引物、基因组文库和数据库。对于有研究
基础的作物, 随着基因组研究的深入和 SSR 标记的
广泛应用, 现有的 SSR 标记已不能满足高密度遗传
图谱构建等研究的需要, 通常采用数据库搜寻法从
EST序列中获得 SSR标记, 如小麦[29]。由于对小豆
研究比较薄弱, 所以采用简单易行的前两种方法获
得 SSR 引物, 这两种方法较适用于研究相对落后的
小宗作物, 如绿豆[30]。本研究从小豆及其近缘种绿
豆、豇豆、普通菜豆 SSR 标记中共筛选出 13 对具
有多态性 SSR 引物, 其中小豆引物 7 对、绿豆引物
4对、豇豆引物 1对、普通菜豆引物 1对, 有效扩增
率为小豆(87.5%)＞绿豆(85.4%)＞豇豆(74.1%)＞普
通菜豆(63.3%), 其 SSR引物检测到的平均等位变异
数目分别为 12.86、8.50、5.00、4.00, 所揭示参试资
源的多态信息含量 PIC分别为 0.773、0.662、0.147、
0.603。这从另一方面反映了 4种作物亲缘关系的远
近, 小豆、绿豆、豇豆同属于豇豆属(Vigna), 普通菜
豆属于菜豆属(Phaseolus), 而小豆、绿豆又同属于亚
洲豇豆亚属(Ceratotropis), 说明在筛选物种的 SSR
标记时 , 亲缘关系越近 , 有效扩增率越高 , 筛选出
具有多态性引物的机率也越大。
本研究中每对 SSR引物检测到的等位变异数为
4~19个, 平均为 10.23个, 明显高于豇豆属其他作
物。徐雁鸿等[31]用 SSR分子标记分析豇豆种质资源
遗传多样性时每对 SSR引物检测到 2~7个等位位点,
平均为 3.69 个; 刘长友等[30]在筛选用于绿豆种质资
源遗传多样性分析的 SSR及 STS引物时每对引物从
192份材料中检测到 2~11个等位变异。说明小豆种
质资源遗传变异丰富。王述民等[2]利用 RAPD 标记
评价小豆种质遗传多样性时, 得出的平均香农指数
为 0.692, 明显低于本研究的结果 1.073(表 5), 说明
SSR能检测到更丰富的遗传变异。
对 20个群体聚类结果表明, 小豆资源遗传关系
与生态分区间有明显的联系, 即在自身进化传播过
程中, 在某一生态环境下, 小豆经过长期人工选择
和改良后, 在遗传结构上发生了能够区别于其他生
态区资源的变异。没有将河南和甘肃资源区分开来
的可能原因是甘肃参试资源少或所用标记数目有
限。我国小豆的主产区分布在东北、华北、黄河中
下游和长江中下游地区, 群体聚类结果与该主产区
的分布大体一致。
226 作 物 学 报 第 35卷


湖北、陕西、安徽 3省的多态信息含量(PIC)最
高, 且湖北(神农架地区有大量野生小豆存在)资源
与陕西、安徽资源基因交流最频繁(表 6), 笔者推断
这 3个省份是中国栽培小豆的起源地或多样性中心,
与对形态性状分析的结果吻合(未发表), 亦与王述
民[32]初步认为黄河中下游和华中地区是中国小豆起
源地或多样性中心的研究结果相吻合, 且本研究指
出的起源地或多样性中心具体到了 3 个相邻省份。
宗绪晓等[8]认为中国与日本栽培小豆分别来源于不
同的祖先, 同时指出中国与日本栽培小豆间相互渗
透, 但没有揭示二者的关系之谜。本研究进一步证
实了中国与日本栽培小豆间的确有联系, 日本与东
北地区资源聚为一组, 说明中国栽培小豆很可能是
从东北地区传入日本的。日本资源与中国陕西资源
的基因流、遗传一致度都最高(表 6), 东北地区与陕
西资源的基因流、遗传一致度也普遍较高(表 6), 王
述民等[7]利用 AFLP 标记鉴定小豆资源遗传多样性
时将全部 9 份日本资源与 8 份中国陕西资源中的 6
份聚在一组, 并指出日本小豆被归于该组群可能与
该组群的其他种质在最初来源地上相近有关, 由此
推断由中国传入日本的栽培小豆的祖先很可能在中
国陕西。群体聚类结果表明东北地区与中南部资源
遗传关系较近, 而两地区在地里位置上被华北和黄
河中下游地区隔离, 聚类图显示安徽与华北、黄河
中下游地区的资源关系密切。综上所述, 笔者推断
中国栽培小豆从起源地向东北地区传播时陕西可能
是一条重要途经, 而向黄河中下游、华北地区传播
时安徽可能是一条重要途经。西南地区, 尤其是广
西、云南的栽培小豆也可能另有起源地。同时由于
引种等原因还发生着局部地区间基因的交流(表6),
这些还都需要更多 SSR标记和其他方法的进一步验
证。
本研究为我国小豆种质资源的考察收集提供了
重要参考, 建议加强对湖北、陕西、安徽、云南、
广西等省份小豆古老品种、半野生种和野生种的考
察, 发现稀有、珍贵变异类型, 从而在小豆品种改良
和种质创新中合理利用。
4 结论
从小豆近缘种中能够筛选出有效用于小豆遗传
多样性分析的 SSR引物。中国小豆种质资源遗传多
样性比较丰富, 参试省份的聚类结果与中国小豆主
产区的分布大体一致, 东北地区与中南部地区小豆
资源遗传关系较近。初步推断出湖北、陕西、安徽
是中国栽培小豆的起源地或多样性中心。应加强对
上述地区小豆资源的考察、收集, 用于品种改良和
种质创新。
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