全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(8): 1397−1406 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30771313)和国家科技支撑计划项目(2008BAD97B02)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 王慧, E-mail: wanghui@scau.edu.cn; 陈志强, E-mail: chenlin@scau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: guo.tao@vip.163.com, Tel: 020-38604903 **同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-01-06; Accepted(接受日期): 2012-04-16; Published online(网络出版日期): 2012-06-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120604.1004.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01397
水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆基因 hw-1(t)的图位克隆
郭 涛** 黄永相** 黄 宣 刘永柱 张建国 陈志强* 王 慧*
华南农业大学 / 国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东广州 510642
摘 要: 通过增加作图群体的样本量, 将控制水稻白化转绿和多分蘖矮秆的基因 hw-1(t)定位在第 4 染色体长臂 2 个
InDel标记 HW36和 HW7之间 24.9 kb的物理距离内, 该区域含有 5个阅读框架。测序及酶切分析表明, 突变体 hfa-1
仅在 LOC_Os04g57320产生一个碱基(G→A)的突变, 导致翻译提取终止, 推断 LOC_Os04g57320为 hw-1(t)。BLAST
分析发现 hw-1(t)在水稻基因组中为单拷贝, 与拟南芥 AtIM和番茄 SlPTOX基因同源性较高, 但在转录子和蛋白质结
构上存在一定差异; 基因表达分析显示 hw-1(t)属组成型表达基因, 表达不受光照影响。
关键词: 水稻; 白化转绿; 多分蘖矮秆; hw-1(t); 克隆
Map-Based Cloning of a Green-Revertible Albino and High-Tillering Dwarf
Gene hw-1(t) in Rice
GUO Tao**, HUANG Yong-Xiang**, HUANG Xuan, LIU Yong-Zhu, ZHANG Jian-Guo, CHEN Zhi-Qiang*,
and WANG Hui*
South China Agricultural University / National Engineering Research Center of Plant Space Breeding, Guangzhou 510642, China
Abstract: In this study, the green-revertible albino and high-tillering dwarf gene hw-1(t) was fine mapped with a 24.9 kb physical
distance between two InDel markers, HW36 and HW7 on chromosome 5, where five open reading frames were predicted. Se-
quencing and restriction enzyme digestion analysis revealed hfa-1 mutant carried a single nucleotide substitution (G→A) in the
putative gene LOC_Os4g57320, which resulted in a premature stop codon. Therefore, we deduced that LOC_Os4g57320 is
hw-1(t). BLAST analysis indicated that hw-1(t) exits as a single copy in rice genome. Sequence alignment revealed that hw-1(t)
was highly homologous to AtIM and SlPTOX, except for some variation on transcript and protein structure. Gene expression
analysis indicated hw-1(t) was constitutive gene, which did not be affected by light.
Keywords: Rice (Oryza sativa L.); Green-revertible albino; High-tillering dwarf; hw-1(t); Cloning
叶色突变是一种常见的表型变异, 突变基因通
过直接或间接影响光合色素的合成和降解, 最终影
响植物的光合作用。叶色突变的分子机制较为复杂,
主要有以下几种观点: (1)叶绿素合成和降解途径中
相关基因的突变[1-2]; (2)血红素→光敏色素生色团生
物途径中基因突变[3]; (3)编码叶绿体蛋白的基因突
变[4]; (4)与光合系统无直接关系的基因突变[5]。目前,
高等植物的叶色突变机制研究多见于拟南芥, 而水
稻则明显滞后。对叶色突变基因的克隆和功能验证
是阐明叶色突变分子机制的重要途径。目前已报道
的水稻叶色突变基因超过 80个, 但仅有少数被克隆
(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/top/top.jsp)。
已克隆的水稻叶色突变基因多数与叶绿素合
成、降解和叶绿体发育相关。例如 OsYGL1 编码的
叶绿素合成酶催化叶绿素 a 的羧化反应, 该基因的
突变导致突变体内四吡咯中间产物含量骤增、叶绿
体发育迟滞[6]。NYC1 被定位于水稻第 1染色体, 编
码叶绿体短链脱氢/还原酶, 在水稻叶片衰老过程中
对类囊体膜的降解起重要调控作用[6-8]。此外, 也有
少数水稻叶色突变基因是通过影响类胡萝卜素合成
而间接影响叶绿素的合成和降解。如类胡萝卜素合
成相关酶基因 PDS、ZDS、CRTISO 和 β-LCY 突变
1398 作 物 学 报 第 38卷

会导致类胡萝卜素含量降低, 破坏光合系统, 降低
叶绿素含量, 导致幼苗白化[9]。
本课题组通过空间诱变获得白化转绿和多分蘖
矮秆突变体 hfa-1。前期研究表明[10], hfa-1在三叶期
之前完全白化, 随后转绿, 白化转绿表型受生长发
育和温度调控。亚细胞结构观察发现 hfa-1叶绿体发
育异常抑制叶绿素合成, 造成光合效率降低, 产生
白化表型。hfa-1的多分蘖表型是由于高节位分蘖芽
激活所致, 初步鉴定与苗期叶片 IAA (吲哚乙酸)含
量无关。hfa-1 的矮生性则由节间长度缩短所致, 与
苗期 GA (赤霉素)的合成和信号传导无关。遗传分析
表明 hfa-1的白化转绿、多分蘖矮秆表型受单隐性核
基因 hw-1(t)控制。利用 hfa-1 与粳稻品种 02428 杂
交获得的 F2群体将 hw-1(t)定位在水稻第 4染色体长
臂上 2个 InDel标记 HW27和 HW7间 46.9 kb的物
理距离内。本研究拟通过增加作图群体缩小定位区
间, 并对定位区间内的 ORF测序, 确认 hw-1(t)的候
选基因, 最后通过序列比对和基因表达分析, 探讨
候选基因潜在的功能。
1 材料与方法
1.1 水稻材料
利用水稻叶片白化转绿突变体 hfa-1 与水稻品
种 02428配制正反交组合, 从其 F2群体(共约 12 000
株)中选取 3 317 个隐性白化转绿单株用于突变基因
hw-1(t)的精细定位。
以突变体 hfa-1 及野生型 Francis 为材料对定位
区间基因组测序, 突变位点酶切分析所用品种为珍
汕 97A、龙特浦 A、培矮 64S、明恢 63、恢 213、航
恢 7号、特籼占、华航油占、矮脚南特、粳籼 89、
02428、丽江新团黑谷、台中 65和日本晴。
基因表达分析材料为: (1)突变体 hfa-1和野生型
Francis的根、茎、叶、穗(孕穗期); (2)光照(65 µmol
m−2 s−1 )和黑暗处理下突变体和野生型的叶片(3周秧
龄); (3)不同时期(二叶期、三叶期和四叶期)突变体
和野生型的叶片。
1.2 DNA提取及 PCR检测
采用 CTAB法提取水稻基因组 DNA[11]。PCR扩
增体系含 2×PCR Reaction Mix 10 µL (含 100 mmol
L−1 KCl、20 mmol L−1 Tris-HCl、3 mmol L−1 MgCl2、
400 mmol L−1 dNTP), Taq DNA聚合酶(5 U µL−1) 0.2
µL, 引物(10 µmol L−1)各 1 µL, 模板 DNA 1 µL, 超
纯水补至 20 µL。反应条件为 94℃预变性 5 min; 94℃
变性 30 s, 55℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s, 35个循环;
72℃延伸 7 min。扩增产物经 8.0%非变性聚丙烯酰
胺凝胶电泳(电泳缓冲液 1×TBE, 电压 75 V, 时间
2.5 h), 0.1% AgNO3染色, BIORAD凝胶成像系统观
察、照相、读带。
1.3 RNA提取及反转录
使用 TRIZOL-Reagent (Invitrogen, US)提取水稻
RNA, 方法参见说明书, 称取 50~100 mg 新鲜植物
组织, 加液氮研磨至粉末状, 转移到 1.5 mL 离心管
中, 加入 1 mL TRIZOL-Reagent, 振荡混匀。15~30℃
温育 5 min, 每 1 mL Trizol加入 0.2 mL氯仿, 振荡
15 s后(用手摇)静置 2~3 min。4℃, 12 000×g离心 15
min, 将上层水相(约 0.6 mL)移至新的 1.5 mL离心管
中, 加入 0.6 mL 异丙醇, 室温放置 10 min。4℃,
12 000×g离心 10 min, 弃上清。加入 1 mL 70%乙醇
洗涤, 振荡样品, 然后 4℃, 7 500×g离心 5 min。去
上清液, 空气干燥 RNA样品 5~10 min。加入 20 μL
DEPC水溶解, 于−80℃保存备用。电泳检测总 RNA
质量, 用 Nanodrop ND-1000 (Thermo, US)微量核酸
蛋白检测仪检测 RNA浓度与纯度。
使用 ReverTra Ace-α-reverse 反转录试剂盒
(TOYOBO, 上海)反转录 mRNA, 在 0.2 mL 离心管
中加入 1 μL 10 pmol L−1 Oligo dT20, 1 μg总 RNA,
DEPC补足 11 μL, 65℃水浴 5 min。立即置冰上冷却
后加入 4 μL 5×RT buffer, 2 μL 8 mmol L−1 dNTP
Mixture, 1 μL 10 U RNase Inhibitor, 1 μL ReverTra
Ace, 轻轻混匀后 42℃温育 20 min。99℃温育 5 min
灭活反转录酶, 冰上冷却 5 min, 瞬时离心。
1.4 连锁分析
利用 MAPMAKER作图软件构建目标基因区域
的连锁图。通过Gramene数据库(http://www.gramene.
org/)查找与突变基因紧密连锁的标记在日本晴基因
组上的位置, 构建覆盖目的基因的物理图谱。用禾本
科基因组自动注释系统 MSU (http://rice.plantbiology.
msu.edu/)预测候选区域的基因组序列可能的编码区
(ORF)。
1.5 定位区间内基因的扩增和测序
通过 Gramene 网站获得定位区间序列, 设计引
物扩增区间内各 ORF及上下游 500 bp序列(表 1)。
针对扩增片段长度大的特点, 采用适合长片段扩增
的 KOD Fx Taq酶(TOYOBO, 上海), 详细操作按照
说明书进行。
由深圳华大基因生物技术有限公司测定 PCR产
物序列。利用正反向引物双向测序, 采用 DNAstar
软件的 SeqMan模块拼接出完整序列。
第 8期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆基因 hw-1(t)的图位克隆 1399


表 1 用于扩增定位区间内 ORF及侧翼序列的引物
Table 1 Primers used to amplify the ORF and flanking sequences within the positioning range
基因
Gene
引物
Primer
正向引物
Forward primer (5′–3′)
反向引物
Reverse primer (5′–3′)
扩增子长度
Amplicon size (bp)
LOC_Os04g57290 H290 CCTACTTACCAAACTACATGCG TGTGGGTTACTTAAATCATC 2 678
LOC_Os04g57300 H300 ACACCGCCCTAGACAAACCTCCGAG GGATGGCTTGACTGAACTGTGAAC 3 363
LOC_Os04g57310 H310 TGGGAGAAACTCAAGAGAAACTGGCG CAGCAAGAGTCCCATGTTCTAGGAG 4 617
LOC_Os04g57320 H320 ACCGTGCGTTCCACTCTTCTCTGGT TGCAAGATGTGAGCAACGGAGCATC 3 319
LOC_Os04g57330 H330 CGATATACGGGCAGTGCAGTAAGAAT CTGGGTTTTGCTGTCTTGGGCTGTT 3 611

1.6 酶切分析
根据由突变而产生的 Bfa I 酶切位点在基因
LOC_Os04g57320的位置, 通过设计引物 H320-3 (F:
5′-GCAACACCTTCTGGACGTCG-3′, R: 5′-CTGAC
TCCTGCGGATCGAAC-3′)对突变体 hfa-1 和野生型
相应基因组区段进行扩增。采用琼脂糖凝胶 DNA纯
化试剂盒(TIANGEN, Beijing, China)处理扩增产物。
用 Bfa I 限制性内切酶(BIOLAB, 美国)酶切回收的
DNA 片段, 随后通过琼脂糖凝胶电泳检测。酶切反
应体系为 10 μL DNA, 2 μL NEB buffer, 0.5 μL Bfa I
酶和 7.5 μL ddH2O; 反应条件为 37℃温育 1.5 h。
1.7 hw-1(t)基因的编码区序列比对分析
通过 Gramene 数据库(http://www.gramene.org/)
下载 LOC_Os04g57320的 cDNA序列, 设计引物 HD7
(F:5′-TCTACATGTGCTAATGTCGG-3′, R: 5′-GCA
GTGCTATGATCAAGT-3′)并从突变体 hfa-1 和野生
型的 cDNA 中扩增 LOC_Os04g57320 基因, PCR 产
物直接测序, 采用 DNAstar软件比对分析序列。
采取 ClustalX软件进行多序列比对, 以 TreeView
软件显示比对结果, MEGA软件绘制进化树[12]。
2 结果与分析
2.1 hw-1(t)的精细定位及物理图谱构建
前期利用(hfa-1×02428)F2群体的 1 882个单株将
hw-1(t)定位在水稻第 4 染色体长臂上 2 个 InDel 标
记 HW27和 HW7间 46.9 kb的物理距离内[10]。为了
进一步缩小定位区间, 增加 1 435个白化转绿隐性单
株, 利用多态性 Indel标记检测发现 hw-1(t)位于标记
HW36和 HW7之间, 两标记的重组交换单株数分别
为 6株和 4株, 相应遗传距离为 0.08 cM和 0.05 cM
(图 1-A)。
根据定位结果, 结合水稻第 4 染色体的序列信
息, 构建覆盖 hw-1(t)基因的物理图谱(图 1-B), 8 个与
hw-1(t)座位紧密连锁的多态性标记锚定在 AL606646、
AL606619和 AL606652三个克隆上, 其中与 hw-1(t)
两侧距离最近的标记 HW36 和 HW7 分别锚定在克



图 1 利用(hfa-1×02428) F2作图群体定位 hw-1(t)基因
Fig. 1 Mapping of hw-1(t) gene using the F2 (hfa-1×02428) population
A: hw-1(t)被精细定位在第 4染色体 InDel标记 HW36和 HW7区间内; B: 通过 GRAMENE数据库预测 24.9 kb区间内有 5个候选基因
(http://www.gramene.org/)。
A: Gene hw-1(t) was fine mapped to the interval between InDel markers HW36 and HW7 in chromosome 4. B: In the 24.9 kb region, five
putative genes were annotated in GRAMENE database (http://www.gramene.org/).
1400 作 物 学 报 第 38卷

隆AL606619的 48.2 kb和 73.1 kb处, 最终将 hw-1(t)
座位界定在 HW36和 HW7之间 24.9 kb的物理距离
内, 对应于日本晴第 4染色体序列(5′–3′) 33 924 678~
33 949 569 bp区间。
2.2 定位区域的基因功能注释
利用禾本科植物基因组自动注释系统注释定位
区间的基因组序列 , 随后通过数据库(http://www.
jcvi.org/, http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/和 http://
wolfpsort.org/)对候选基因的编码产物进行亚细胞定
位。结果显示(表 2), 定位区间内包含 5 个 ORF, 其
中 3个为假定表达蛋白(putative, expressed protein),
分别为磷脂酰肌醇羟基激酶(LOC_Os04g57300)、硫
醇/二硫化物氧化还原酶(DCC)(LOC_Os04g57310)、
IM蛋白(LOC_Os04g57320), 其余 2个为含 F-box结构
域的表达蛋白(LOC_Os04g 57290)和功能未知的表
达蛋白(LOC_Os04g57330)。除 LOC_Os04g57330
的编码产物位于线粒体, 其他 4个位于叶绿体。已知
磷脂酰肌醇羟基激酶为胞间信号传递酶, 通过磷酸
肌醇磷酸化调控逆境胁迫相关转录因子, 在植物细
胞渗透胁迫等逆境信号转导中起作用[13-14]。DCC则
可催化被运输到细胞质的蛋白形成二硫键, 其蛋白
功能主要与还原性活性氧的消除以及氧化伤害蛋白
的再生有关[15]。F-box 蛋白属于 SCF 泛素连接酶复
合体中的识别底物组分 , 在细胞时相转换、信号
传导和发育等生理过程中具有多种功能[16-18]; 另外,
IM 蛋白在拟南芥中作为辅助因子在光电子传递链
上参与类胡萝卜素的脱氢反应, IM突变导致类胡萝
卜素的生物合成受阻, 造成叶绿素光氧化, 叶片产生
绿白嵌合表型[19-20]。
2.3 候选基因的筛选
针对 hw-1(t)定位区域内的 5个基因设计 5对引
物进行扩增(表 1)。测序结果表明, 除 LOC_Os04g
57320外, 其余 4个基因及其侧翼序列在野生型和突
变体间无任何差异。突变体在 LOC_Os04g57320 上
发生单碱基替换突变(G→A)。表型正常品种(日本
晴、02428 和广陆矮)中相应突变位点的测序表明,
三者与野生型 Francis 无任何差异 , 初步确定
LOC_Os04g57320为 hw-1(t)的候选基因。
突变体 hfa-1在LOC_Os04g57320基因上发生的
G→A替换恰好产生一个 Bfa I酶切位点。针对该酶
切位点设计 1对 PCR引物 H320-3, 随后在突变体、
野生型和多个表型正常水稻品种中扩增和酶切。酶
切电泳结果如图 2所示, hfa-1出现 2条带, 而野生型
Francis 和其他表型正常品种均为一条带, 说明只有
hfa-1在该位点发生突变(图 2)。
2.4 候选基因 cDNA序列分析
根据水稻基因组信息, LOC_Os04g57320 由 9 个
外显子和 8个内含子组成, 其中转录子全长 1 684 bp,

表 2 定位区间基因功能注释
Table 2 Gene annotated in mapping region
编号
No.
基因
Gene
特性
Description
蛋白亚细胞定位预测
Protein subcellular localization prediction
1 LOC_Os04g57290 OsFBX153-F-box domain containing protein, expressed Chlo: 12.0, Extr: 1.0
2 LOC_Os04g57300 Phosphatidylinositol 3- and 4-kinase family protein, putative, expressed
Chlo: 6.0, Nucl: 2.0, Mito: 2.0,
Cyto: 1.0, Plas: 1.0, Vacu: 1.0
3 LOC_Os04g57310 Take care, hiol-disulphide oxidoreductase DCC, putative, expressed Chlo: 13.0
4 LOC_Os04g57320 Immutans protein, putative, expressed Chlo: 11.0, Cyto: 1.0, Mito: 1.0
5 LOC_Os04g57330 Expressed protein Mito: 11.0, Chlo: 2.0



图 2 Bfa I在不同水稻品种的 LOC_Os04g57320位点上的酶切结果
Fig. 2 Restriction enzyme digestion in LOC_Os04g57320 locus by Bfa I among different rice varieties
M: DM09-50 bp ladder DNA marker; 1: Francis; 2: hfa-1; 3: 珍汕 97A; 4: 龙特浦 A; 5: 培矮 64S; 6: 明恢 63; 7: 恢 213; 8: 航恢 7号;
9: 特籼占; 10: 华航油占; 11: 矮脚南特; 12: 粳籼 89; 13: 02428; 14: 丽江新团黑谷; 15: 台中 65, 16: 日本晴。
M: DM09-50 bp ladder DNA marker; 1: Francis; 2: hfa-1; 3: Zhenshan A; 4: Longtepu A; 5: Pei’ai 64S; 6: Minghui 63; 7: Hui 213; 8: Hanghui 7;
9: Texianzhan; 10: Huanhangyouzhan; 11: Aijiaonante; 12: Jingxian 89; 13: 02428; 14: Lijiangxintuanheigu; 15: Taizhong 65; 16: Nipponbare.
第 8期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆基因 hw-1(t)的图位克隆 1401


内含子全长 1 429 bp。为进一步确认 LOC_Os04g57320
是 hw-1(t)的候选基因, 以突变体 hfa-1 及野生型的
cDNA 为模板, 设计引物 HD7 对 LOC_Os04g57320
进行扩增和测序。结果显示, 在突变体的 cDNA 中
同样检测到突变碱基。突变体在 LOC_Os04g57320
的+257 bp处(从起始密码子开始算起)发生 1个碱基
突变 (G→A), 形成终止密码子 (TAG), 导致蛋白质
翻译提前终止(图 3)。这样一个残缺的多肽链 , 理
论上不具备正常功能。综合上述结果 , 可推断
hfa-1 的突变表型是由于 LOC_Os04g57320的碱基突
变造成, LOC_Os04g57320为白化转绿和多分蘖矮秆
基因 hw-1(t)。



图 3 LOC_Os04g57320的 cDNA及蛋白序列
Fig. 3 cDNA and protein sequence of LOC_Os04g57320
方框示 hfa-1突变位点。Box shows the mutant positin of hfa-1.
1402 作 物 学 报 第 38卷

2.5 hw-1(t)基因的系统进化分析
hw-1(t)编码框全长 1 011 bp, 编码 336个氨基
酸。通过 BLAST比对发现小麦及拟南芥等双子叶植
物均存在与 hw-1(t)高度同源的基因, 且均含有一个
保守交替氧化酶 AOX 结构域。将 hw-1(t)与小麦、
拟南芥及其他生物的同源基因一起构建系统进化树
(图 4), 结果表明 hw-1(t)与同为禾本科植物小麦的
TaAOX 亲缘关系最近, 其次为双子叶植物、裸子植
物和葫芦藓科植物。说明 hw-1(t)的同源性与物种的
亲缘关系相关, hw-1(t)序列在亲缘关系近的物种中
的相似度比其他物种高。
根据 hw-1(t)基因的氨基酸序列, 通过 GenBank
比对 , 发现已知功能的拟南芥 AtIM[19-20]和番茄
SlPTOX 基因[21-22]与 hw-1(t)高度同源, 氨基酸序列
相似性分别为 83%和 81% (图 5)。三者的编码产物
除 6个双铁原子结合基元(motif)外, 还含有 2个跨膜
区域。已有研究证明此类氨基酸序列结构是线粒体
内膜交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)所具有的典
型特征[23-24], 因而推断 hw-1(t)与拟南芥 AtIM和番茄
SlPTOX同为 AOX的同源基因。
进一步分析 3个基因的蛋白结构(图 6)发现, 与
拟南芥 AtIM 和番茄 SlPTOX 一致, hw-1(t)编码蛋白
也存在 2 个氨基酸低复杂区 LC1、LC2 和 2 个跨膜
区 T1、T2, 但 LC2的位置与前两者差异较大, 位于
跨膜区 T2 内。另外, 酪氨酸激酶磷酸化位点 TKP1
在细胞内的信号转导中起关键作用, 而 hw-1(t)编码
蛋白缺少 TKP1, 仅在 C末端存在 TKP2。
2.6 hw-1(t)基因在水稻基因组中的同源性分析
已知拟南芥 AtIM、番茄 SlPTOX 在各自物种基
因组中均为单拷贝基因, 不存在旁系同源基因[20,24]。
通过 BLAST比对, 在水稻基因组其他位点未发现与
hw-1(t)基因高度相似的序列。但发现第 3 染色体长
臂存在一个同源性相对较高的基因 LOC_Os03g63010
(同源性=36%)(图7)。水稻基因组自动注释系统 Rice-
GAAS 推测该基因编码水稻质粒末端氧化酶 , 即
OsPTOX。
进一步比较两者的转录子序列结构发现, OsP-
TOX 参与编码蛋白的外显子仅 3 个, 编码 154 个氨
基酸, 长度不足 hw-1(t)的一半(336个氨基酸)(图 8)。
OsPTOX 的前 2个外显子序列与 hw-1(t)前 3个外显
子序列基本一致 , 导致两者氨基酸同源性相对较
高。除了外显子和编码氨基酸比 hw-1(t)少外 ,
OsPTOX的编码蛋白不含 AOX结构域和 6个双铁原
子结合基元, 表明两者在功能上存在很大差别, 同
时也说明 hw-1(t)是单拷贝基因, 在水稻中不存在旁
系同源基因。



图 4 hw-1(t)的系统进化分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of hw-1(t)
第 8期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆基因 hw-1(t)的图位克隆 1403




图 5 水稻 hw-1(t)与拟南芥、番茄的同源基因氨基酸序列比对
Fig. 5 Comparison of the deduced amino acid sequences of Arabidopsis AtIM, tomato SlPTOX, and rice hw-1(t)
GenBank序列登陆号为 AAC3554.3 (AtIM)和 AAG02286.1 (SlPTOX)。相同氨基酸用同一底色表示, 三角符号代表双铁原子中心, T1、
T2表示保守跨膜结构域。
GenBank accession numbers: AAC3554.3 (AtIM), AAG02286.1 (SlPTOX). Amino acids identical in all sequences are filled with the same
ground color. Coupled diiron centers are indicated with triangles. T1 and T2 are conserved transmembrane domains.



图 6 hw-1(t)与 AtIM、SlPTOX的蛋白质结构比较
Fig. 6 Comparison of the protein structure of hw-1(t), AtIM, and SlPTOX
LC1、LC2代表低复杂区; T1、T2代表保守转膜结构域; TKP1、TKP2代表酪氨酸激酶磷酸化位点; 双箭头线代表 AOX结构域。
LC1 and LC2 designate low complex sequences; T1 and T2 designate conserved transmembrane domains; TKP1 and TKP2 designate tyrosine
kinase phosphorylation sites. The double-headed arrow designates the AOX domain.

2.7 hw-1(t)基因的表达模式分析
通过半定量 RT-PCR 检测 hw-1(t)基因在孕穗期
根、茎、叶、穗中的表达情况(图 9-A), 结果显示
hw-1(t) mRNA在突变体与野生型的各器官中均稳定
转录, 但其表达水平在叶中较高而在根中较低, 具
有组成型表达特征。
在光、暗处理下秧苗(3 周秧龄)叶片中 hw-1(t)
基因的表达水平均没有差异(图 9-B)。然而在同一处
理下, 突变体中 hw-1(t)基因的表达水平均低于野生
型。选取二叶期、三叶期和四叶期叶片进行 hw-1(t)
基因表达分析(图 9-C), 发现 3个时期野生型的表达
量基本一致, 而突变体的表达水平均低于野生型。
上述结果表明 hw-1(t)基因的表达不受光照调控, 但
终止密码子提前出现可能对 hw-1(t) mRNA 的稳定
性产生影响。
3 讨论
前期研究表明 hw-1 ( t)定位区间内的 LOC_
Os04g57320基因与拟南芥叶色花斑基因 AtIM同源, 推
测 LOC_Os04g57320 为 hw-1(t)的候选基因[10]。本研究
1404 作 物 学 报 第 38卷



图 7 hw-1(t)与 OsPTOX氨基酸序列比对
Fig. 7 Comparison of the deduced amino acid sequences of hw-1(t) and OsPTOX
两序列间相同氨基酸用黑底表示, 保守氨基酸用灰底表示。
Amino acids identical in two sequences are boxed in black, while conserved amino acids are boxed in grey.



图 8 hw-1(t)与 OsPTOX的转录子结构比较
Fig. 8 Comparison of transcript structures of hw-1(t) and OsPTOX
黑色方框为编码区, 白色方框为非翻译区, 黑色直线为内含子, 数字代表核苷酸序列长度(bp)。
Black boxes are CDS, white boxes are UTR, black lines are introns, number designates the length (bp) of nucleotide sequence.

通过进一步精细定位、区间内各预测基因 cDNA测序
以及候选基因同源分析, 逐步确认 LOC_Os04g57320
为白化转绿和多分蘖矮秆基因 hw-1(t)。
拟南芥 IMMUTANS(AtIM)基因突变引起的叶片
花斑是目前研究最为深入的一类植物叶色突变, 突
变表型首先在子叶发育时期出现, 其叶片嵌合部分
的形成易受外界光照和温度影响, 强光及高温促进
白斑的产生[25]。与拟南芥相似, im (AtIM基因突变)
在番茄中的同源基因 SlPTOX 突变会导致部分叶片
白化, 并造成果实缺乏类胡萝卜素[22]。AtIM 基因不
仅参与光合色素的生物合成, 而且在叶绿体呼吸、
胁迫响应等质体代谢中起着举足轻重的作用。拟南
芥中融合 AtIM 启动子的 GUS 报告基因表达显示该
基因为组成型表达基因, 其表达不仅局限于绿色部
分 , 在非绿色部位 (如根部 )也存在持续表达。
Northern杂交结果表明拟南芥 AtIM的转录水平并不
总与类胡萝卜素累积水平一致, 部分组织 AtIM表达
水平较高但其类胡萝卜素含量反而降低, 这意味着
AtIM 蛋白除了参与类胡萝卜素脱氢反应外, 还有其
他功能[26]。同样, 类似现象也存在于番茄中。尽管番
茄成熟果实的 SlPTOX mRNA和类胡萝卜素的积累成
正比[21-22], 但 SlPTOX mRNA同时也在多个器官如新
生叶、花、茎和根部大量积累[22]。此外, 电镜观察显
示拟南芥 im和番茄 gh突变体(SlPTOX基因突变)的
叶绿体、淀粉体(根)、白色体(黑暗生长的幼苗)和色
素母细胞(果实)均被破坏, 推测 AtIM (SlPTOX)活性
第 8期 郭 涛等: 水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆基因 hw-1(t)的图位克隆 1405




图 9 hw-1(t)的基因表达
Fig. 9 Expression of hw-1(t) gene
A: hw-1(t)基因在孕穗期根(R)、茎(S)、叶(L)和穗(P)中的表达分
析; B: hw-1(t)基因光照和黑暗处理下的表达(3周龄叶片); C:
hw-1(t)在二叶期(L1)、三叶期(L2)和四叶期(L3)的表达。
A: Expressions of hw-1(t) at booting stage in root (R), leaf sheath
(S), leaf (L), and panicle (P); B: Expressions of hw-1(t) under dark
and light (leaf age of 3 weeks); C: Expressions of hw-1(t) at
two-leaf (L1), three-leaf (L2), and four-leaf (L3) stage.

对维持上述质体正常功能起关键作用[22,26]。种种迹
象表明 hw-1(t)在水稻生长发育中也同样起重要作用,
存在一因多效。首先是除叶片外, hw-1(t)基因也在水
稻其他部位表达, 且在野生型的不同时期叶片中稳
定表达, 说明 hw-1(t)属于组成型基因。其次 hw-1(t)
突变除了影响叶色外, 还对株高、分蘖等其他表型
性状产生严重的影响, 但该影响与在拟南芥和番茄
中不尽相同。最明显的区别在于拟南芥和番茄没有
出现多分枝现象。造成这种差异的原因可能是水稻
作为单子叶植物, 在进化过程中 hw-1(t)基因的功能
逐渐与双子叶植物分道扬镳。这一点可从转录子和
蛋白质结构比较结果略见一斑。综上所述, 除类胡
萝卜素生物合成外, AtIM 及其同源基因在植物的生
长发育中具有更广泛的作用。
近年来越来越多证据表明多分蘖矮秆表型与新
发现的植物激素独脚金内酯有关[27-28]。目前已克隆
的水稻多分蘖矮秆基因几乎都参与独脚金内酯的合
成代谢[29]。AtIM作为调控独脚金内酯合成前体类胡
萝卜素的基因, 或许通过直接影响类胡萝卜素含量
而间接影响水稻独脚金内酯合成。有关突变体 hfa-1
的白化转绿和多分蘖矮秆表型产生的机制已在前期
研究进行详细的推测[10], 后续的研究将通过转基因
功能分析验证 hw-1(t)的功能, 并通过基因表达谱分
析 hw-1(t)对独脚金内酯代谢途径相关基因的影响。
4 结论
LOC_Os04g57320 为白化转绿和多分蘖矮秆基
因 hw-1(t)。hw-1(t)属于组成型表达基因, 除影响叶
色表型外, 还在水稻的生长发育中起广泛作用。
References
[1] Beale S I. Green genes gleaned. Trends Plant Sci, 2005, 10:
301−312
[2] Morita R, Sato Y, Masuda Y, Nishimura M, Kusaba M. Defect in
non-yellow coloring 3, an alpha/beta hydrolase-fold family pro-
tein, causes a stay-green phenotype during leaf senescence in rice.
Plant J, 2009, 59: 940–952
[3] Terry M J, Kendrick R E. Feedback inhibition of chlorophyll
synthesis in the phytochrome chromophore-deficient aurea and
yellow-green-2 mutants of tomato. Plant Physiol, 1999, 119:
143–152
[4] Chen G, Bi Y R, Li N. EGY1 encodes a membrane-associated and
ATP-independent metalloprotease that is required for chloroplast
development. Plant J, 2005, 41: 364–375
[5] Kushnir S, Babiychuk E, Storozhenko S, Davey M W, Papen-
brock J, Rycke R D, Engler G, Stephan U W, Lange H, Kispal G,
Lill R, Van M M. A mutation of the mitochondrial ABC trans-
porter Sta1 leads to dwarfism and chlorosis in the Arabidopsis
mutant starik. Plant Cell, 2001, 13: 89–100
[6] Wu Z, Zhang X, He B, Sheng S, Wang J, Guo X, Su N, Wang L,
Jiang L, Wang C, Zhai H, Wan J. A chlorophyll-deficient rice
mutant with impaired chlorophylide esterification in chlorophyll
biosynthesis. Plant Physiol, 2007, 145: 29–40
[7] Jiang H, Li M, Liang N, Yan H, Wei Y, Xu X, Liu J, Xu Z, Chen
F, Wu G. Molecular cloning and analysis of the stay green gene in
rice. Plant J, 2007, 52: 197–209
[8] Park S Y, Yu J W, Park J S, Li J, Yoo S C, Lee N Y, Lee S K,
Jeong S W, Seo H S, Koh H J, Jeon J S, Park Y I, Paek N C. The
senescence-induced stay green protein regulates chlorophyll deg-
radation. Plant Cell, 2007, 19: 1649–1664
[9] Fang J, Chai C, Qian Q, Li C, Tang J, Sun L, Huang Z, Guo X,
Sun C, Liu M, Zhang Y, Lu Q, Wang Y, Lu C, Han B, Chen F,
Cheng Z, Chu C. Mutations of genes in synthesis of the carote-
noid precursors of ABA lead to preharvest sprouting and
photo-oxidation in rice. Plant J, 2008, 54: 177–189
[10] Guo T(郭涛), Huang X(黄宣), Huang Y-X(黄永相), Liu Y-Z(刘
永柱), Zhang J-G(张建国), Chen Z-Q(陈志强), Wang H(王慧).
Characterizations of a mutant gene hw-1(t) for green-revertible
albino, high tillering and dwarf in rice (Oryza sativa L.). Acta
Agron Sin (作物学报), 2012, 38(1): 23–35 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[11] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA. Nucl Acids Res, 1980, 8: 4321–4325
[12] Kumar S, Tamura K, Jakobsen I B, Nei M. MEGA2: molecular
evolutionary genetics analysis software. Bioinformatics, 2001, 17:
1244–1245
[13] Meijer H J G, Divecha N, van den Ende H, Munnik T. Hyperos-
motic stress induces rapid synthesis of phosphatidyl-D-inositol
3,5-bisphosphate in plant cells. Planta, 1999, 208: 294–298
1406 作 物 学 报 第 38卷

[14] Wilson M P, Sun Y, Cao L, Majerus P W. Inositol 1,3,4-
trisphosphate 5/6-kinase is a protein kinase that phosphorylates
the transcription factors c-Jun and ATF-2. J Biol Chem, 2001, 276:
40998–41004
[15] Ginalski K, Kinch L, Rychlewski L, Grishin N V. DCC proteins:
a novel family of thiol-disulfide oxidoreductases. Trends Biochem
Sci, 2004, 29: 339–342
[16] Nelson N, Perzov N, Cohen A, Hagai K, Padler V, Nelson H. The
cellular biology of proton-motive force generation by V-ATPases.
J Exp Biol, 2000, 203: 89–95
[17] Worley C K, Zenser N, Ramos J, Rouse D, Leyser O, Theologis
A, Callis1 J. Degradation of Aux/IAA proteins is essential for
normal auxin signaling. Plant J, 2000, 21: 553–562
[18] Dieterle M, Zhou Y C, Schafer E, Funk M, Kretsch T. EID1, an
F-box protein involved in phytochrome A-specific light signaling.
Genes Dev, 2001, 15: 939–944
[19] Carol P, Stevenson D, Bisanz C, Breitenbach J, Sandmann G,
Mache R, Coupland G, Kuntz M. Mutations in the Arabidopsis
gene immutans cause a variegated phenotype by inactivating a
chloroplast terminal oxidase associated with phytoene desatura-
tion. Plant Cell, 1999, 11: 57–68
[20] Wu D, Wright D A, Wetzel C, Voytas D F, Rodermel S. The
IMMUTANS variegation locus of Arabidopsis defines a mito-
chondrial alternative oxidase homolog that functions during early
chloroplast biogenesis. Plant Cell, 1999, 11: 43–55
[21] Josse E M, Simkin A J, Gaffé J, Labouré A M, Kuntz M, Carol P.
A plastid terminal oxidase associated with carotenoid desa-
turation during chromoplast differentiation. Plant Physiol, 2000,
123: 1427–1436
[22] Barr J, White W S, Chen L, Bae H, Rodermel S. The GHOST
terminal oxidase regulates developmental programming in tomato
fruit. Plant Cell Environ, 2004, 27: 840–852
[23] Fu A, Aluru M, Rodermel S R. Conserved active site sequences
in Arabidopsis plastid terminal oxidase (PTOX): in vitro and in
planta mutagenesis studies. J Biol Chem, 2009, 284: 22625–
22632
[24] Fu A, Park S, Rodermel S. Sequences required for the activity of
PTOX (IMMUTANS), a plastid terminal oxidase: in vitro and in
planta mutagenesis of iron-binding sites and a conserved se-
quence that corresponds to exon 8. J Biol Chem, 2005, 280:
42489–42496
[25] Wetzel C M, Jiang C Z, Meehan L J, Voytas D F, Rodermel S R.
Nuclear-organelle interactions: the immutans variegation mutant
of Arabidopsis is plastid autonomous and impaired in carotenoid
biosynthesis. Plant J, 1994, 6: 161–175
[26] Aluru M, Bae H, Wu D, Rodermel S R. The Arabidopsis immu-
tans mutation affects plastid differentiation and the morphogene-
sis of white and green sectors in variegated plants. Plant Physiol,
2001, 127: 67–77
[27] Beveridge C A, Kyozuka J. New genes in the strigolactone- re-
lated shoot branching pathway. Curr Opin Plant Biol, 2010, 13:
34–39
[28] Domagalska M A, Leyser O. Signal integration in the control of
shoot branching. Nat Rev Mol Cell Biol, 2011, 12: 211–221
[29] Wang Y, Li J. Branching in rice. Curr Opin Plant Biol, 2011, 14:
94–99