全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(7): 1202−1208 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30471190 和 30671429), 重庆市自然科学基金项目(9266), 高校博士点基金项目(20050625003), 西南大学科研
基金项目(SWU208044)资助。
*
通讯作者(Corresponding authors): 王小佳, E-mail: wxj@swu.edu.cn; 朱利泉, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn, Tel: 023-68250794, Fax: 023-68251914
第一作者联系方式: E-mail: niuy2001134@163.com; Tel: 023-68250731(4); Fax: 023-68250733
Received(收稿日期): 2008-12-05; Accepted(接受日期): 2009-03-16.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01202
甘蓝自交不亲和信号传导元件 ARC1的体外表达及其与 SRK相互作
用验证
牛 义 1 王志敏 1 高启国 1 宋 明 1 王小佳 1,* 朱利泉 2,*
1 西南大学重庆市蔬菜学重点实验室; 2 西南大学植物生理生物化学实验室, 重庆 400716
摘 要: 在甘蓝自交不亲和信号传导中 ARC1 和上游因子 SRK 之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,
以甘蓝 E1 为材料, 采用 RT-PCR 技术扩增 ARC1 的编码序列, 构建 ARC1 原核表达质粒 pET43.1a-ARC1, 转化宿主
菌大肠杆菌 BL21, 通过 SDS-PAGE 检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及 pET43.1a-ARC1 融合蛋白序列中的
6×His标签与 Ni+结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法, 并用该方法对 ARC1与 SRK的相互作用进行
了检测。结果表明, 在体外 ARC1能与 SRK相互作用并形成复合体, 这为深入分析 ARC1与 SRK相互作用机理以及
探讨 ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。
关键词: 甘蓝; 信号传导; S-位点受体激酶(SRK); 臂重复蛋白 1 (ARC1)
Expression of ARC1 in Vitro and Test of Interaction between ARC1 and SRK
from Brassica oleracea L. in Signal Transduction Pathway of Self-Incompati-
bility
NIU Yi1, WANG Zhi-Min1, GAO Qi-Guo1, SONG Ming1, WANG Xiao-Jia1,*, and ZHU Li-Quan2,*
1 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing, Southwest University, 2 Plant Physiology and Biochemistry Laboratory of Southwest University,
Chongqing 400716, China
Abstract: Self-incompatibility (SI) is a widespread mechanism in flowering plants that prevents inbreeding and promotes out-
crossing. Self-pollen recognition relies on the products of genes located at the S (self-incompatibility) locus. Significant progress
has been made in understanding molecular interactions allowing stigmatic cells to recognize and reject self-pollen in Brassica
during the past decades. Thus, the male and female determinants responsible for the self-incompatibility (SI) response have been
identified. The structural features of these molecules strongly suggest that SI response is triggered by a ligand-receptor interaction.
ARC1 is an Arm Repeat Containing and also a downstream gene of SRK. ARC1 interacts with SRK probably in signal transduc-
tion pathway of self-incompatibility. In this study, with an aim to testify the interaction, the coding sequences of ARC1 were am-
plified from stigma mRNA of Brassica oleracea L., and inserted into the expression vector pET43.1a to construct the recombinant
plasma pET43.1a-ARC1, transformed E. coli (BL21) and detected expression of the recombinant protein via SDS-PAGE. Using
Co-Immunoprecipitation theory and characteristic of 6×His Tag combined with Ni+ in pET43.1a-ARC1, a new method was put
forward for testing the interaction between proteins. Through the method the interaction between ARC1 and SRK was analyzed,
showing that ARC1 and SRK could act with each other to combine and form a complex. This research provides theoretical and
technical bases for further analyzing the mechanism of interaction between ARC1 and SRK, for probing into interaction between
ARC1 and downstream targets.
Keywords: Brassica oleracea L; Signal transduction; S-locus receptor kinase (SRK); Arm repeat containing 1 (ARC1)
自交不亲和性(self-incompatibility, SI)在显花植
物中广泛存在, 是植物防止近亲繁殖、促进物种分
化的重要机制。它涉及从授粉到受精过程中发生的
花粉和雌蕊之间的相互作用[1]。芸薹属植物的 SI 属
于孢子体型自交不亲和, 这类 SI 在遗传上由一个复
等位 S基因座所控制[2-3]。截止目前已分离到 3类与
第 7期 牛 义等: 甘蓝自交不亲和信号传导元件 ARC1的体外表达及其与 SRK相互作用验证 1203


该位点连锁的基因, 分别编码 SLG (S-locus glycopro-
tein, S位点糖蛋白)[4-7]、SPll (S-locus protein 11, S位
点蛋白 11) /SCR (S-locus cystein-rich protein。S位点
富半胱氨酸蛋白)[8-11]和 SRK (S-locus receptor kinase,
S位点受体激酶)[12-15]。SRK位于柱头表面乳突细胞
的原生质膜上 [16-17], 是一种多态性的跨膜蛋白, 主
要由胞外结构域、跨膜结构域和激酶结构域 3 部分
组成。胞外结构域与 SLG 有很高的同源性, 是花粉
配体结合位点 , 决定自交不亲和性特异识别反应 ,
而激酶结构域具有丝氨酸 /苏氨酸 (Ser/Thr)激酶活
性[13-14,18]。现已证实 SRK是甘蓝等芸薹属作物柱头
识别自花花粉、启动自交不亲和信号传导和最终导
致自花花粉萌发受阻的核心关键酶[19-22]。
研究证明, 臂重复蛋白 ARCl (arm repeat-con-
taining 1)仅在雌蕊柱头中特异表达, 而且与植物自
交不亲和反应的时间相偶联 [23-26]。Gu等 [23]和
Mazzurco等[25]利用酵母双杂交系统检测到 ARC1与
SRK 存在相互作用, 但是这种相互作用能否在体外
得到验证以及所形成的复合体又与下游何种底物相
互作用？复合体的稳定性受哪些化学因子调控？这
些调控对自交不亲和性状会产生何种影响及在生产
上有何用途？为了探索这些问题 , 必须首先鉴定
ARC1 与 SRK 之间的相互作用, 建立相互作用化控
试剂的筛选平台, 从而为下一步筛选 ARC1 的下游
因子创造条件。本文在 SRK激酶结构域编码序列[27]
(记为 SRKE1)的基础上, 扩增了ARC1的编码序列(记
为 B. oleracea E1 ARC1), 构建了 ARC1原核表达质
粒 pET43.1a-ARC1, 对两者相互作用进行了体外验
证, 以期为上述问题的深入研究提供新内容。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝 E1 品种为西南大学园艺园林学院十字花
科研究所选育的高度自交不亲和材料。3 月底收集
甘蓝 E1开花前 1~2 d花蕾, 剥去萼片取其柱头, 用
于提取柱头总 RNA。表达载体 pET-43.1a、大肠杆
菌 BL21为本实验室保存; UNIO-10 Trizol Total RNA
Preparation Kit购自上海生工; PrimeSTAR HS DNA
Polymerase、EcoR I、Kpn I为 MBI产品; MagneHis
Protein Purification System购自 Promega公司。
1.2 ARC1基因的克隆
根据 Gu 等[23]报道油菜 ARC1 基因的 cDNA 序
列(NCBI 登录号为 AF024625)设计合成一对特异引
物 P1和 P2, 扩增 ARC1基因的编码序列。P1为 5′-GA
ATTCATGGCCACTGATTCAGCAATGTTC-3′, 5′为
EcoR I酶切位点; P2为 5′-GGTACCTTATCTCTGTG
TGTTCTGGTCG-3′, 5′为 Kpn I酶切位点。
1.3 表达质粒的构建与鉴定
收集甘蓝开花前 1~2 d柱头, 提取柱头总 RNA。
以总 RNA为模板、Oligo(dT)18为引物, 反转录合成
cDNA 第一条链。分别以 cDNA 第一条链及基因组
DNA 为模版, 用 P1 和 P2 引物扩增 ARC1 序列, 连
接到 pMD18-T载体上, 经 EcoR I和 Kpn I双酶切后
将 ARC1 编码序列定向插入载体 pET43.1a, 送大连
宝生物工程有限公司进行测序。将重组质粒转化大
肠杆菌X1-blue, 提取质粒经 EcoR I和 Kpn I双酶切,
鉴定构建的质粒, 命名为 pET43.1a-ARC1。直接采
用高启国等构建的质粒 pET43.1a-SRKE1。
1.4 重组蛋白的诱导表达
用质粒 pET43.1a-ARC1 转化宿主菌 BL21。挑
取单菌落, 接种于 1 mL含有 50 μg mL−1氨苄青霉素
的 LB液体培养基, 37℃振荡培养过夜。次日, 过夜
培养物按 1∶100扩大培养, 当OD600在 0.8~1.0时加
入 IPTG。设 IPTG浓度为 0.5、1.0和 1.5 mmol L−1, 诱
导温度为 28℃、32℃和 37 , ℃ 按两因素交叉分组设
计, 共得到 9个组合(表 1), 225×g培养 4 h, 诱导完成
后收集细胞用于电泳检测表达情况和重组蛋白纯化。

表 1 pET43.1a-ARC1诱导条件的优化
Table 1 Optimization of pET43.1a-ARC1 inducing condition
编号
No.
IPTG浓度
IPTG concentration
(mmol L−1)
诱导温度
Inducing temperature
( )℃
1 0.5 28
2 1.0 28
3 1.5 28
4 0.5 32
5 1.0 32
6 1.5 32
7 0.5 37
8 1.0 37
9 1.5 37

1.5 ARC1和 SRKE1相互作用的体外验证
参照免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质的原
理[28], 通过体外蛋白质孵育检测两者的相互作用。
ARC1与 SRKE1相互作用的检测程序如下：
(1) 分别取 10 mL pET43.1a-ARC1、pET43.1a-
SRKE1 的表达菌液, 按照纯化试剂盒说明进行纯化
1204 作 物 学 报 第 35卷

(用作对照)。
(2) 取 300 mL pET43.1a-ARC1 表达菌液, 4℃
下 10 000×g离心 10 min收集细胞, 于–80℃冰箱冻
存 1 h 后重悬于 3 mL Binding buffer (20 mmol L−1
Hepes pH 7.4, 1 mmol L−1 EDTA, 5 mmol L−1 MgCl2,
1 mmol L−1 DTT, 0.1% Triton X-100)中, 低温超声破
碎 15 min, 离心收集上清液置冰上备用。
(3) 取 300 mL pET43.1a-SRKE1表达菌液, 4℃下
10 000×g离心 10 min 后收集细胞, 于–80℃冰箱冻
存 1 h 后加 4 mL Binding buffer悬浮细胞, 低温超声
破碎 15 min, 离心收集上清液并分装成 8 管。各管
分别加 40、45、50、55、60、65、70和 75 μL MagneHis
Ni-Particles, 轻轻混匀, 室温孵育 2 min, 用磁力架
回收 Ni-Particles再加 50 μL Binding buffer重悬, 悬
浮液与 300 μL pET43.1a-ARC1上清液混匀, 室温孵
育 2 min, 收集 Ni-Particles, 用结合 /清洗液 (100
mmol L−1 HEPES pH 7.5, 10 mmol L−1 imidazole, 2~8
mmol L−1 guanidine-HCl)洗 3次, 再用 50 μL洗脱缓
冲液(100 mmol L−1 HEPES pH 7.5, 500 mmol L−1
imidazole) 洗脱蛋白, 电泳检测 Ni+ 与 SRKE1 的结
合情况。
(4) 参照第 3 步的结果与方法 , 取 37.5 mL
pET43.1a-SRKE1 表达菌液, 离心收集细胞, 将细胞
破碎后离心收集上清液。取 60 μL MagneHis Ni-
Particles加入上清液中, 轻轻混匀, 室温孵育 2 min,
用磁力架回收 Ni-Particles, 加 50 μL Binding buffer
重悬。
(5) 取第 4 步得到的悬浮液 20 μL 与 300 μL
pET43.1a-ARC1上清液混匀, 室温孵育 2 min, 收集
Ni-Particles, 用结合/清洗液洗 3次, 然后用 50 μL洗
脱缓冲液洗脱蛋白(检测 Ni+是否有剩余作对照)。
(6) 取步骤 4中剩余的 30 μL悬浮液与 300 μL
pET43.1a-ARC1 上清液混匀, 4℃孵育 2 h, 每隔 15
min 混匀一次, 孵育结束后用 150 μL 清洗缓冲液
(20 mmol L−1 Tris-HCl pH 7.5, 10% glycerol, 0.1%
Triton X-100, 150 mmol L−1 NaCl, 1 mmol L−1 sodium
orthovanadate)洗 3 次, 然后用 50 μL 洗脱缓冲液洗
脱蛋白。
(7) 将各蛋白洗脱液加入等体积的 2×上样品缓
冲液 100℃煮沸 5 min, 每样取 40 μL供电泳检测。
2 结果与分析
2.1 ARC1基因 DNA与 cDNA序列的扩增与分析
PCR 产物电泳结果显示扩增片段大小与预计
值一致(图 1 和图 2), 经测序和序列分析表明, 扩增
ARC1基因的编码序列为 1 992 bp, 编码 663个氨基
酸残基, DNA 序列无内含子存在。其同源基因 B.
oleracea kale ARC1 (NCBI登录号为 EU344909)、B.
oleracea ARC1 20010197[26]所编码的氨基酸数目也
为 663个, B. napus ARC1 (NCBI登录号为AF024625)
所编码的氨基酸数目为 661个, 而 A. thaliana ARC1
(NCBI 登录号为 AY150512)基因所编码的氨基酸数
目为 729 个。序列比较显示, 作为芸薹属 4 个基因
B. oleracea E1 ARC1、B. oleracea kale ARC1、B.
oleracea ARC1 20010197、B. napus ARC1的碱基差
异很小, 说明 ARC1基因存在较强的保守性, 而作为
十字花科中不同属的两个基因 B. oleracea E1 ARC1
和 A. thaliana ARC1, 在碱基上却存在相对较大的差
异。利用 Vector NTI 进行氨基酸序列比对显示, B.
oleracea E1 ARC1 基因编码的氨基酸序列与 B. ol-
eracea kale ARC1、B. oleracea ARC1 20010197、B.
napus ARC1、A. thaliana ARC1所编码的氨基酸序列
相似性分别为 97.9%、97.6%、93.2%和 53.2%, 而且
B. oleracea E1 ARC1在理论上的等电点 pI为 6.86,
分子量为 73.5 kD。将 5个氨基酸序列建立进化树后
分析发现(图 3), B. oleracea E1 ARC1与 B. oleracea
kale ARC1、B. oleracea ARC1 20010197的亲缘关系
较近, 而与 B. napus ARC1、A. thaliana ARC1的亲
缘关系较远。在对 B. oleracea E1 ARC1的氨基酸序
列进行分析后发现, 该序列中存在一个 U-box 结构,
5 个臂重复序列, U-box[23]结构位于第 282 个氨基酸
和第 347个氨基酸之间, 与 B. oleracea kale ARC1、
B. oleracea ARC1 20010197中 U-box结构的位置一
致, 而 B. napus ARC1的 U-box结构位于第 283个氨
基酸和第 347个氨基酸之间[23], 芸薹属 4个氨基酸序
列中的 U-box结构均位于蛋白质的中间。B. oleracea
E1 ARC1的臂重复序列编码 42个氨基酸残基, 与 B.



图 1 ARC1 cDNA的 PCR产物电泳图
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the cDNA PCR products
of ARC1
M: GeneRuler 100 bp DNA ladder plus; 1, 2: cDNA PCR产物。
M: GeneRuler 100 bp DNA ladder plus; 1, 2: cDNA PCR products.
第 7期 牛 义等: 甘蓝自交不亲和信号传导元件 ARC1的体外表达及其与 SRK相互作用验证 1205




图 2 ARC1 基因组 DNA的 PCR产物电泳图
Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of the genomic DNA PCR
products of ARC1
M: GeneRuler 100 bp DNA ladder plus; 1, 2: DNA PCR 产物。
M: GeneRuler 100 bp DNA ladder plus; 1, 2: DNA PCR products.



图 3 部分 ARC1编码区核苷酸序列分子进化树
Fig. 3 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of some ARC1
NCBI登录号 B. oleracea kale ARC1为 EU344909; B. napus ARC1
为 AF024625; A. thaliana ARC1为 AY150512; B. oleracea ARC1
20010197的核苷酸序列见文献[26]。
EU344909 is accession number for B. oleracea kale ARC1in NCBI;
AF024625 for B. napus ARC1; AY150512 for A. thaliana ARC1; Nu-
cleotide sequence of B. oleracea ARC1 20010197 is in reference 26th.

oleracea kale ARC1、B. oleracea ARC1 20010197、
B. napus ARC1的一样。在 A. thaliana ARC1的氨基
酸序列中也发现一个 U-box结构和一个臂重复序列,
U-box位于第 308个氨基酸和第 371个氨基酸之间。
2.2 表达质粒的构建与鉴定
构建的表达质粒 pET43.1a-ARC1经 EcoR I、Kpn
I双酶切(图 4), 电泳结果表明, 可以得到约 2 000 bp
的 ARC1 片段, 表达质粒送大连宝生物工程有限公
司测序, 结果 ARC1插入位点和方向完全正确。表达



图 4 pET43.1a-ARC1酶切电泳图
Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of pET43.1a-ARC1 digested
by restriction enzymes
1: λDNA marker; 2: pET43.1a-ARC1质粒对照; 3: Kpn І单酶切;
4: EcoR І单酶切; 5, 6: Kpn І and EcoR І双酶切;
7: DL2000 DNA marker。
1: λDNA marker; 2: pET43.1a-ARC1 without digestion as control;
3: recombinant digested by Kpn І; 4: recombinant digested by
EcoR І; 5, 6: recombinant digested by Kpn І and EcoR І;
7: DL2000 DNA marker.
质粒 pET43.1a-SRKE1分析结果见高启国等[27]。
2.3 重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE检测
本实验中 IPTG浓度(mmol L−1)与诱导温度( )℃
对 pET43.1a-ARC1的表达影响很大。对 9个诱导组
合筛选(表 1)表明, IPTG浓度是 1.0 mmol L−1、诱导
温度为 32℃、诱导时间为 4 h。图 5表明, 与诱导的
载体质粒 pET43.1a(泳道 1)和未诱导的样品(泳道 3)
相比, 诱导表达后的各泳道(泳道 4、5和 6)多出一条
带, 大小约 135 kD, 其蛋白质相对分子质量与估计值
相符, 说明 pET43.1a-ARC1融合蛋白诱导表达成功。



图 5 ARC1在大肠杆菌中重组表达的 SDS-PAGE
Fig. 5 SDS-PAGE of recombinant expressed ARC1 in E. coli
strain BL21
1: 诱导的 pET43.1a产物对照; 2: 未诱导 pET43.1a对照; 3: 未诱
导 pET43.1a-ARC1对照; 4~6: 诱导的 pET43.1a-ARC1产物;
M: 蛋白质高分子量 marker。
1: BL21/pET43.1a induced; 2: recombinant strain BL21/ pET43.1a
uninduced; 3: recombinant strain BL21/ARC1 uninduced;
4–6: recombinant strain BL21/ARC1 induced; M: protein molecular
mass marker.

2.4 ARC1和 SRKE1相互作用的体外验证
2.4.1 Ni+剩余检测 为排除相互作用检测过程
中可能由于 Ni+ 没有完全与 pET43.1a-SRKE1 结合,
使得剩余的 Ni+又与 pET43.1a-ARC1 结合, 从而带
来的假阳性结果, 试验设置了 8 个 Ni+梯度, 结果表
明, 加入 40、45、50、55 和 60 μL MagneHis Ni-
Particles 时未见 pET43.1a-ARC1 融合蛋白条带, 说
明 Ni+完全与 pET43.1a-SRKE1结合, 而加入 65、70
和 75 μL MagneHis Ni-Particles 时就会同时出现
pET43.1a-SRKE1、pET43.1a-ARC1融合蛋白条带, 说
明过量的 Ni+ 与 pET43.1a-ARC1结合。因此以 37.5
mL pET43.1a- SRKE1表达菌液, 加入 60 μL Ni+ 为基
准进行下一步试验。
2.4.2 ARC1 与 SRKE1 相互作用的电泳检测
将孵育结果、纯化的 pET43.1a-ARC1、pET43.1a-
SRKE1 以及 Ni+与 pET43.1a-SRKE1结合情况对照一
起电泳(图 6)。Ni+ 磁珠与 pET43.1a SRKE1融合蛋白
结合后得到 50 μL Ni+ 磁珠悬浮液, 取其 20 μL悬浮
液与 300 μL pET43.1a-ARC1上清液室温孵育 2 min
1206 作 物 学 报 第 35卷

的电泳结果见泳道 5, 只有 pET43.1a-SRKE1融合蛋
白条带, 没有 pET43.1a-ARC1 融合蛋白条带, 说明
Ni+全部与 pET43.1a-SRKE1结合。剩余 30 μL悬浮液
与 300 μL pET43.1a-ARC1上清液 4℃孵育 2 h后的
电泳结果见泳道 1既有 pET43.1a-SRKE1融合蛋白条
带也有 pET43.1a-ARC1 融合蛋白条带, 而对照泳道
5中没有 pET43.1a-ARC1融合蛋白条带, 说明 SRKE1
与 ARC1 结合在一起并随 Ni+ 磁珠一起沉淀下来,
进而证实了两者间的相互作用。



图 6 pET43.1a-ARC1与 pET43.1a-SRKE1相互作用的
SDS-PAGE
Fig. 6 SDS-PAGE of interaction between pET43.1a-ARC1 and
pET43.1a-SRKE1
1: pET43.1a-ARC1 和 pET43.1a-SRKE1 孵育产物 ; 2: 纯化的
pET43.1a-ARC1; 3: 纯化的 pET43.1a-SRKE1; 4: 蛋白质高分子量
标记; 5: Ni+剩余情况检测。
1: pET43.1a-ARC1 was incubated with pET43.1a-SRKE1; 2: puri-
fied pET43.1a-ARC1; 3: purified pET43.1a- SRKE1; 4: protein
molecular mass marker; 5: test of the rest Ni+ as control.
3 讨论
本文克隆了 ARC1的编码序列, 大小为 1 992 bp,
编码 663 个氨基酸残基, DNA 序列无内含子存在。
作为芸薹属的 4 个基因, B. oleracea E1 ARC1、B.
oleracea kale ARC1、B. oleracea ARC1 20010197, 其
碱基的差异很小, 而且氨基酸序列的相似性达 90%
以上。作为十字花科中不同属的两个基因 B. ole-
racea E1 ARC1和 A. thaliana ARC1, 在碱基上却存
在相对较大的差异, 同时氨基酸序列的相似性只有
53.2%, 这说明 ARC1 基因存在较强的保守性, 而且
种间的保守性高于属间的保守性。在甘蓝 E1 的
ARC1蛋白质序列中有一个 U-box结构, 5个臂重复
序列, U-box结构位于第 282个氨基酸和第 347个氨
基酸之间, 而油菜 ARC1 的 U-box 结构位于第 283
个氨基酸和第 347个氨基酸之间。甘蓝 E1的 ARC1
蛋白序列中, 臂重复序列编码 42 个氨基酸残基, 与
oleracea kale ARC1、B. oleracea ARC1 20010197、
B. napus ARC1的一样。这两种结构的存在有可能是
ARC1 蛋白质分子发生同源或异源二聚化时的结合
域, 从而使得 ARC1 能够调控柱头乳突细胞中某一
完全未知的自交不亲和信号传导元件。由于 ARC1
在两个属间的碱基差异较大, 导致其编码的蛋白质
序列也发生较大的差异, 特别是 ARC1 的臂重复序
列, 在甘蓝与油菜中有 5个, 而在拟南芥中只有 1个,
这种较大的差异可能是导致 ARC1 作为与自交不亲
和信号传导有关的基因在两个不同属之间的功能有
所不同的原因。
Gu等[23]和 Stone等[24]研究认为, 在 SRK介导的
芸薹属自交不亲和过程中, ARC1能够依赖磷酸化的
方式特异性地与 SRK激酶域结合, 导致 ARC1的磷
酸化, 从而启动信号传递。本文以甘蓝 E1 为材料,
构建了 ARC1 表达质粒并成功地进行了体外表达,
验证了 ARC1 和 SRKE1之间相互作用。这一实验结
果是从体外表达角度对 Gu 等[23]和 Mazzurco 等[25]
利用酵母双杂交系统研究结果的进一步证实。酵母
双杂交系统能检测到蛋白质与蛋白质瞬间的相互作
用, 因此 Gu 等和 Mazzurco 等的研究结果只能说明
ARC1与 SRK之间存在相互作用而不能解释两者的
作用方式。在本文检测中为纯化两者相互作用产物
用 150 μL清洗缓冲液清洗了 3次, 最终仍能检测到
SRKE1 与 ARC1 蛋白条带, 说明在反复的清洗过程
中并没有洗掉与 SRKE1 结合的 ARC1, 而且电泳检
测洗脱液, 没有发现 ARC1 蛋白条带, 因此两者的
相互作用并非瞬间发生, 可能是相互结合后形成了
复合体。这说明 ARC1 尽管不是 S 位点基因的编码
蛋白, 但能够与 SRK激酶域结合, 引起 SI反应胞内
信号传递, 起胞内第 2信使的作用。
目前, 人们普遍认为, 当甘蓝自花花粉落到柱
头上时, 花粉包被蛋白在花粉和柱头之间形成接触
层, 花粉外壳蛋白 SCR在细胞壁中 SLG的协助下与
SRK 胞外域相互作用, 激活了膜上的 SRK, 于是
THL1与 THL2被释放到胞质中, 胞内的 ARCl开始
与 SRK结合, 促使细胞内一未知底物泛素化而形成
一复合物, 进而引发一系列级联反应, 抑制自花花
粉萌发、水合或花粉管伸长[21,29]。可见, SRK与ARC1
复合体的存在及其聚合与解离在自交不亲和反应中
起重要作用。因此, 通过深入分析 ARC1与 SRK的
相互作用和实现 ARC1-SRK复合体聚合与解离的人
为调控对于自交不亲和材料保存和育种制种工作有
重要意义。免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用原理
表明, 蛋白质 X 与蛋白质 Y 相互作用, 如蛋白质 X
与其抗体免疫沉淀, 则蛋白 Y会与蛋白质 X及其抗
体一起沉淀下来[28]。依据该原理本文利用 pET43.1a
作为表达载体表达 ARC1, 巧妙利用了 pET43.1a-
第 7期 牛 义等: 甘蓝自交不亲和信号传导元件 ARC1的体外表达及其与 SRK相互作用验证 1207


ARC1融合蛋白序列中的 6×His标签与 Ni+ 结合, 探
索性地建立了体外检测蛋白质间相互作用的新方
法。将 pET43.1a-SRKE1融合蛋白与 Ni+ 结合, 结合
后的复合物作为“诱饵蛋白”, 把体外表达的 ARC1
融合蛋白溶于适于相互作用的缓冲液中作为“靶蛋
白”溶液 , 两者 4℃条件下孵育后利用 pET43.1a-
SRKE1 上结合的 Ni+ 与磁力架吸附性将“诱饵蛋白”
与靶蛋白的复合体纯化出来。本文对 ARC1与 SRKE1
相互作用的检测, 条带清楚, 明确证实了两者相互
作用, 得到了理想的结果, 说明我们建立的体外检
测蛋白相互作用方法是可行的。利用该方法将 SRK
与 ARC1 作用的复合物与甘蓝柱头总蛋白共孵育,
钓取 ARC1 的下游蛋白, 这部分内容正在试验中。
本方法与免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用相比 ,
不需要制备抗体, 简化了实验操作, 避免了因抗体
特异性不强可能带来的假阳性结果。另外本文建立
的检测体系可作为 ARC1与 SRK相互作用化控试剂
筛选平台, 为深入分析两者相互作用的机理和了解
自交不亲和信号传导中的下游元件奠定了基础。
4 结论
克隆了甘蓝 E1的 ARC1基因, 并成功地在大肠
杆菌中表达。探索性地建立了体外检测蛋白质相互
作用的新方法, 利用该方法在体外证实了 ARC1 与
SRK之间的相互作用, 建立了 SRK与 ARC1相互作
用化控试剂的筛选平台, 这对于深入分析 SRK 与
ARC1 相互作用的机理, 筛选相互作用的化控试剂,
分析这些调控对自交不亲和反应的影响, 有望为自
交不亲和性在实际生产上的应用提供全新内容。
References
[1] McCubbin A G, Kao T H. Molecular recognition and response in
pollen and pistil interactions. Annu Rev Cell Dev Biol, 2000, 16:
333–364
[2] Nasrallah J B, Nasrallah M E. Pollen-stigma signaling in the
sporophytic self-incompatibility response. Plant Cell, 1993, 5:
1325–1335
[3] Conner J A, Conner P, Nasrallah J B. Comparative mapping of
the Brassica S locus region and its homology in Arabidopsis: Im-
plications for the evolution of mating systems in the Brassicaceae.
Plant Cell, 1998, 10: 801–812
[4] Nasrallah J B, Kao T H, Goldberg M L, Nasrallah M E. A cDNA
clone encoding an S-locus specific glycoprotein from Brassica
oleracea L. Nature, 1985, 318: 263–267
[5] Watanabe M, Ono T, Hatakeyama K. Molecular characterization
of SLG and S-related genes in a self-incompatible Brassica
campestris L. var. yellow sarson. Sex Plant Reprod, 1997, 10:
332–340
[6] Kusaba M, Nishio T, Satta Y, Hinata K, Ockendon D. Striking
sequence similarity in inter-and intra-specific comparisons of
class I SLG alleles from Brassica oleracea and Brassica campes-
tris: Implications for the evolution and recognition mechanism.
Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 7673–7678
[7] Hatakeyama K, Takasaki T, Watanabe M, Hinata K. Molecular
characterization of S locus genes, SLG and SRK, in a pol-
len-recessive self-incompatibility haplotype of Brassica rapa L.
Genetics, 1998, 149: 1587–1597
[8] Doughty J, Dixon S, Hiscock S J, Willis A C, Parkin I A P, Dick-
inson H G. PCP-A1, a defensin-like Brassica pollen coat protein
that binds the S locus glycoprotein, is the product of gameto-
phytic gene expression. Plant Cell, 1998, 10: 1333–1348
[9] Schopfer C R, Nasrallah M E, Nasrallah J B. The male determi-
nant of self-incompatibility in Brassica. Science, 1999, 286:
1697–1700
[10] Suzuki G, Kai N, Hisrose T, Fukui K, Nishio T, Takayama S,
Isogai A, Watanabe M, Hinata K. Genomic organization of the
S-locus: Identification and characterization of genes in the
SLG/SRK region of S9 haplotype of Brassica campestris (syn.
rapa). Genetics, 1999, 153: 391–400
[11] Takayama S, Shiba H, Iwano M, Shimosato H, Che F S, Kai N,
Watanabe M, Suzuki G, Hinata K, Isogai A. The pollen determi-
nant of self-incompatibility in Brassica campestris. Proc Natl
Acad Sci USA, 2000, 97: 1920–1925
[12] Stein J C, Howlett B, Boyes D C, Nasarllah M E, Nasarllah J B.
Molecular cloning of a putative receptor protein kinas encoded at
the self-incompatibility locus of Brassica oleracea. Proc Natl
Acad Sci USA, 1991, 88: 8816–8820
[13] Stein J C, Nasrallah J B. A plant receptor-like gene, the S-locus
receptor kinase of Brassica oleracea, encodes a functional ser-
ine/threonine kinase. Plant Physiol, 1993, 101: 1103–1106
[14] Giranton J L, Duma C, Cock M, Gaude T. The integral membrane
S-locus receptor kinase of Brassica has serine/threonine kinase
activity in a membranous environment and spontaneously forms
oligomers in planta. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 3759–
3764
[15] Shiu S H, Bleecker A B. Plant receptor-like kinase gene family:
Diversity, function and signaling. Sci STKE, 2001, 113: RE22
[16] Stein J C, Dixit R, Nasrallah M E, Nasrallah J B. SRK, the stigma
specific S-locus receptor kinase of Brassica, is targeted to the
plasma membrane in transgenic tobacco. Plant Cell, 1996, 8:
429–445
[17] Cabrillac D, Cock J M, Dumas C. The S-locus receptor kinase is
inhibited by thioredoxins and activated by pollen coat proteins.
Nature, 2001, 410: 220–223
[18] Goring D R, Rothstein S J. The S-locus receptor kinase gene in a
self-Incompatible Brassica napus line encodes a functional ser-
ine/threonine kinase. Plant Cell, 1992, 4: 1273–1281
[19] Takasaki T, Hatakeyama K, Suzuki G, Watanabe M, Isogaill A,
1208 作 物 学 报 第 35卷

Hinata K. The S receptor kinase determines self-incompatibility
in Brassica stigma. Nature, 2000, 403: 913–916
[20] Cui Y, Bi Y M, Brugiere N, Amoldo M, Rothstein S J. The S lo-
cus glycoprotein and the S receptor kinase are sufficient for
self-pollen rejection in Brassica. Proc Natl Acad Sci USA, 2000,
97: 3713–3717
[21] Silva N F, Goring D R. Mechanisms of self-incompatibility in
flowering plants. Cell Mol Life Sci, 2001, 58: 1988–2007
[22] Silva N F, Stone S L, Christe L N, Sulaman W, Nazarain K A P,
Burnett M, Arnoldo M A, Rothstein S J, Goring D R. Expression
of the S receptor kinase in self-compatible Brassica napus cv.
Westar leads to the allele-specific rejection of self-incompatible
Brassica napus pollen. Mol Gen Genet, 2001, 265: 552–559
[23] Gu T, Mazzurco M, Sulaman W, Matias D, Goring D R. Binding
of an arm repeat protein to the kinase domain of the S-locus re-
ceptor kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 382–387
[24] Stone S L, Arnoldo M A, Goring D R. A breakdown of Brassica
self-incompatibility in ARC1 antisense transgenic plants. Science,
1999, 286: 1729–1731
[25] Mazzurco M, Sulaman W, Elina H, Cock J M, D R Goring. Fur-
ther analysis of the interactions between the Brassica S receptor
kinase and three interacting proteins (ARCl, THLl and THL2) in
the yeast two-hybrid system. Plant Mol Biol, 2001, 45: 365–376
[26] Liu D(刘东), Zhu L-Q(朱利泉), Wang X-J(王小佳). Cloning and
characterization of encoding sequence of srk-binding protein
ARC1 from Brassica olereacea L. in self-incompatibility signal-
ing process. Acta Hort Sin (园艺学报), 2004, 30: 427–431(in
Chinese with English abstract)
[27] Gao Q-G(高启国), Song M(宋明), Niu Y(牛义), Yang K(杨昆),
Zhu L-Q(朱利泉), Wang X-J(王小佳). Test of interaction be-
tween THL1 and SRK from Brassica oleracea L. in self-incom-
patibility signaling process. Acta Agron Sin (作物学报), 2008,
34(6): 1–10(in Chinese with English abstract)
[28] He F-C(贺福初), Qian X-H(钱小红), Zhang X-M(张学敏). Pro-
tein-Protein Interactions (蛋白质-蛋白质相互作用), 2nd edn.
Beijing: China Agriculture Press, 2004. pp 47–56(in Chinese)
[29] Sobotka R, Sakova L, Curn V. Molecular mechanisms of self-
incompatibility in Brassica. Mol Biol, 2000, 2: 103–112