全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 526532 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由陕西省“13115”科技创新工程重大项目(2007ZDKG-01)和现代农业产业技术体系建设专项(NYCYTX-001)资金资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 高翔, E-mail: gx@nwsuaf.edu.cn; Tel: 029-87082630
第一作者联系方式: E-mail: yopy619@163.com
Received(收稿日期): 2009-09-24; Accepted(接受日期): 2009-12-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00526
陕 253 γ-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析
王明霞 1 高 翔 1,2,* 陈其皎 1,2 董 剑 1,2 赵万春 1,2 李艳亮 1
李 敏 1 陈瑞佶 1 庞红喜 1,2 李哲清 1,2 刘 俊 1,2
1西北农林科技大学农学院; 2陕西省小麦工程技术研究中心 / 陕西省小麦新品种培育工程研究中心, 陕西杨凌 712100
摘 要: 针对 γ-醇溶蛋白基因家族成员, 设计了覆盖其启动子及全长编码区的 3对特异引物, 从强筋小麦品种陕 253
中克隆了 8条 1 000 bp左右的片段(GenBank登录号为 GQ871770~GQ871777)。该片段群包含典型醇溶蛋白亚基的完
整编码序列, 并在重复区存在丰富的插入/缺失(InDel); 推导的氨基酸序列显示, 8个基因均具有 γ-醇溶蛋白亚基的典
型结构特征, 其中 GQ871771为假基因, 4条序列(GQ871770、GQ871772、GQ871776和 GQ87177)具有 9个半胱氨酸
残基; 启动子区序列分析表明, GQ871770、GQ871772、GQ871774和 GQ871776在胚乳框存在 6处 SNP变异, 其中
两处变异发生于 GCN4基序内, 利用 WebLogo3在线构建了储藏蛋白更具代表意义的 30 bp保守胚乳盒模式。进化分
析证实克隆序列属于 γ-醇溶蛋白基因家族成员。
关键词: 普通小麦; γ-醇溶蛋白; 基因克隆; 序列分析
Gene Cloning and Sequence Analysis of γ-Gliadin Genes from Wheat Cultivar
Shaan 253
WANG Ming-Xia1, GAO Xiang1,2,*, CHEN Qi-Jiao1,2, DONG Jian1,2, ZHAO Wan-Chun1,2, LI Yan-Liang1, LI
Min1, CHEN Rui-Ji1, PANG Hong-Xi1,2, LI Zhe-Qing1,2, and LIU Jun1,2
1 College of Agronomy, Northwest A&F University; 2 Wheat Engineering Research Center of Shaanxi Province / New varieties cultivation of wheat
Engineering Research Center of Shaanxi Province, Yangling 712100, China
Abstract: Eight γ-gliadin genes (GenBank accession number GQ87170 to GQ87177) were cloned from wheat (Triticum aestivum
L.) cultivar Shaan 253 using three sets of specific primers, which were designed according to the known γ-gliadin gene family. All
of the eight genes possess the typical structure of γ-gliadin subunits and many sequences of insent/indel in the repeat region. The
deduced amino acid sequences showed that GQ871771 is a pseudogene, and nine cysteine residues existed in GQ871770,
GQ871772, GQ871776, and GQ87177. Promoter sequences analysis indicated that there were six SNPs in endosperm box of
GQ871770, GQ871772, GQ87174, and GQ871776, and two of them appeared in the GCN4-like motif. A model for endosperm
box of storage protein with better representation was constructed using the online tool WebLogo3. Phylogenetic analysis also
confirmed that the cloned sequences belong to γ-gliadin gene family.
Keywords: Common wheat; γ-gliadin gene; Gene clone; Sequence analysis
小麦醇溶蛋白约占小麦面粉总量的 4%~5%, 占小麦
胚乳贮藏蛋白总量的 50%~60%[1]。它通过分子内二硫键、
氢键和疏水作用形成球状结构, 赋予面筋延展性。根据电
泳图谱上的迁移率可将其分为 α、β、γ和 ω 4种, 其中 γ-
醇溶蛋白占醇溶蛋白总量的 30%[2-3]。大部分 γ-醇溶蛋白
基因位于第 1部分同源染色体短臂的远端部, 编码位点为
Gli-1, 即 Gli-A1、Gli-B1和 Gli-D1; 此外, 部分 γ-醇溶蛋
白由第 6 部分同源染色体臂上的 Gli-2 位点编码 , 即
Gli-A2、Gli-B2 和 Gli-D2 短臂的远端部 [4-5]。大多数 γ-
醇溶蛋白的分子量为 31~33 kD, 由保守 N 端序列和较一
致的氨基酸组成, 脯氨酸、苯丙氨酸和谷氨酰胺含量较少,
但含硫氨基酸含量较多[6-7]。Payne等[8]研究表明, 麦醇溶
蛋白为单聚体蛋白, 分子量小, 仅有分子内二硫键和较紧
密的三维结构, 呈球形, 溶于 70%乙醇, 流动性较大, 赋
予面筋以黏性。
陕 253 是西北农林科技大学农学院小麦研究所选育
第 3期 王明霞等: 陕 253 γ-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析 527
的丰产、早熟、优质强筋小麦新品种, 由陕 229/陕 213杂
交选育而成, 具有面团形成时间和稳定时间长、良好的
HMW-GS 组成及优良的加工品质等突出特征[9]。本研究
通过克隆的方式获得编码-醇溶蛋白基因家族的相关信
息 , 为深入探讨该品种优质性状来源与品种改良提供
依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其基因组 DNA提取
陕 253 的种子由西北农林科技大学小麦品质实验室
提供。以室内发芽 4~5 d的小麦幼叶片为材料, 采用微量
CTAB法[10]提取基因组 DNA。
1.2 目的片段的克隆和重组子筛选
根据 NCBI 已登录的 γ-醇溶蛋白基因序列设计了 3
对克隆 γ-醇溶蛋白基因完整编码区的引物 F1: ACYATGA
AGACCTTAYTCATC, R1: TYCCAATSTTGAACTAGCAC;
F2: ACYATGAAGACCTTAYTCATC, R2: TCATTGGCC
ACCAAT; F3: AAGATTTGGTTTATGYCTAACAAC, R3:
TYCCAATSTTGAACTAGCAC, 引物 F1 和 F2 位于起始
密码子附近, F3位于起始密码子上游–300区左右, R1、R2
和 R3 位于终止密码子附近。PCR 总体积为 1 μL, 含
10×PCR反应混合液 12.5 μL, 引物各 1 μL, Ex-Taq DNA
聚合酶 0.25 U, 基因组 DNA 1 μL, 加双蒸水至总量 25
μL。PCR 反应条件为 94℃预变性 5 min; 然后 94℃变性
45 s, 60℃退火 1 min, 72℃延伸 45 s, 共 30个循环; 最后
72℃延伸 10 min。扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上分离, 回
收的目的 DNA片段加入 pMD19-T载体(TaKaRa) 1 μL, T4
连接酶 1 μL, 反应缓冲液 1 μL, 在 16℃恒温条件下连接
过夜, 加入 DH5α感受态细胞(TaKaRa) 50 μL, 按标准程
序进行热击转化。转化菌液中加入 400 μL LB液体培养基,
37℃低速培养 50 min 后, 均匀涂布于含有氨苄青霉素的
LB固体平板上, 37℃恒温培养 12~16 h。用克隆引物做菌
落 PCR 检测, 从每个材料中筛选 3 个独立的阳性克隆进
行测序。
1.3 目的片段的测定及序列分析
3 个阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公
司进行序列测定。采用 NCBI在线工具 Blastn (http://www.
ncbi.nlm.nib.gov/BLAST)进行序列分析。采用 DNAMAN
(6.0.40 Demo version)进行 DNA 序列比对与翻译。采用
MEGA 4.0[11] 进行同源序列比对。分别采用 PLACE da-
tabase[12]和 ExPASy 进行启动子分析与蛋白质二级预测。
利用 WebLogo3[13-14]在线构建序列模体。
2 结果与分析
2.1 目的片段的扩增、克隆与鉴定
扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上分离, 得到 1 000 bp左
右的带(图 1)。将目的片段回收纯化后, 连接到 pMD19-T
载体上, 并转化到大肠杆菌中。对白斑进行 PCR扩增, 确
认为阳性克隆后进行测序 , 得到 8 个 γ-醇溶蛋白基因 ,
GenBank编号为 GQ871770~GQ871777。
图 1 PCR产物电泳分析
Fig. 1 PCR amplified products separated on 1% agarose gel
M: DL2000; 1~6:陕 253; 1:F1/R1; 2:F2/R2; 3:F3/R3; 4:F3/R1; 5:F3/R2;
6:F1/R3。
M: DL2000; 1–6: Shaan 253; 1: F1/R1; 2: F2/R2; 3: F3/R3; 4: F3/R1; 5:
F3/R2; 6: F1/R3.
2.2 核苷酸与氨基酸序列分析
开放阅读框分析表明 , GQ871770、GQ871772、
GQ871773、GQ871774和 GQ871776的编码区长度分别为
888、945、969、777 和 909 bp, 可分别编码 295、314、
322、258 和 302 个氨基酸残基; GQ871775 与 GQ871770
相同 , 编码区长度为 888 bp, 编码 295 个氨基酸残基;
GQ871777 与 GQ871776 相同, 编码区长度为 909 bp, 编
码 302个氨基酸残基; 而 GQ871771由于在编码区起始密
码子后第 191、261位“C”突变成了“T” 导致终止密码子的
提前出现。此外, 该基因第 357 位碱基“A”的插入引起了
移码突变。这符合醇溶蛋白变异终止规律[15]。
在推导的氨基酸一级结构(图 2)中, 首先为 20个氨基
酸残基的信号肽,在此区 GQ871771以“MKTF”开始, 其他
基因是以“MKTL”开始。在信号肽区还有少数几个氨基酸
差异, 如第 7位, GQ871770是缬氨酸(V), GQ871773是谷
氨酰胺(Q)。其余序列在此为亮氨酸(L); GQ871773在第 7
位由疏水性的亮氨酸突变为亲水性的谷氨酰胺 , 这对于
信号肽功能和结构的影响还有待研究。第 11 位 ,
GQ871773 是缬氨酸(V), 其余为丙氨酸(A); 其后分为 5
个区, I区是由 11个氨基酸组成的 N末端, 各序列多以甲
硫氨酸(M)开头, 而GQ871771和GQ871774以异亮氨酸(I)
开头; II区是由若干重复单元组成的重复区, GQ871770、
GQ871772、GQ871776和 GQ871777在此区前端出现了一
个半胱氨酸(C), 使其含有的半胱氨酸总数为罕见的奇数;
III区为包含 6个保守半胱氨酸的非重复区; Ⅳ为多聚谷氨
酰胺区 , 不同基因在此区因长度和组成不同而有很大差
异; V区是包含 2个保守半胱氨酸残基的 C末端[16-17]。大
多数-醇溶蛋白基因中有 8 个保守的半胱氨酸, 它们两两
之间形成分子内二硫键。推测如果醇溶蛋白的半胱氨酸残
528 作 物 学 报 第 36卷
基数是奇数而非普遍认为的偶数 , 它们就有可能形成分
子间二硫键, 而后参与形成谷蛋白聚合物。Anderson等[18]
发现了包含奇数个半胱氨酸残基的 γ-醇溶蛋白, 并报道
大约 1/4的 γ-醇溶蛋白包含奇数个半胱氨酸。本研究也发
现奇数个半胱氨酸残基的 γ-醇溶蛋白, 即 GQ871770、
GQ871772、GQ871776 和 GQ871777, 它们在形成分子内
二硫键后还有一个自由的-SH可形成分子间二硫键, 参与
谷蛋白聚合物的形成。
将克隆的这些基因在 GenBank 上进行 BLAST 分析,
发现 8个基因与来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)和
硬粒小麦(T. durum Desf.)等的 γ-醇溶蛋白基因序列一致
性很高, 最高达 99%; 与来源于斯卑尔脱小麦(T. spelta
L.)、密穗小麦(T. compactum Host.)和硬粒小麦的相似性也
较高 , 大部分超过 80%; 而与来源于黑麦的(Secale syl-
vestre)的 γ-secalin基因的相似性较低, 约为 50% (表 1)。
γ-醇溶蛋白重复区由富含脯氨酸(P)和谷氨酰胺(Q)的
若干重复单元组成, 均具有一致的重复单元 PFPQ1-2 (PQQ)1-2
(表 2)。8个 γ-醇溶蛋白都出现了单个氨基酸变异的现象, 如
GQ871770 在 56 位“Q”→“H”, 在 104 位“Q”→“L”, 在 142
位“P”→“L”等等; GQ871771 相对于其他序列在 86 位缺少
了重复单元“QPQQ”导致该重复区出现两个 P 相连的重复
单元 PFPPQQPQ; 此外, 各序列重复区的长度均有不同,
GQ871772、GQ871776和 GQ871771在 64位比其他序列多
两个重复单元(TFPQPEQ和 TYPHQPQQ- Q); GQ871774在
122 位较其他多两个重复单元(PFPQ- SQQPQQ 和 PFP-
QPQQQ), 且在 56位有 57个氨基酸的缺失; GQ871771由
于碱基的突变导致编码框移位, 重复区在 130 位后终止。
所有这些序列的重复单元的长度差异较大, 在五肽到十三
肽之间。各序列都有 PFPQPQQPQ 单元的连续出现, 这种
差异只在于出现频率不同和单个氨基酸的变化。除假基因
GQ871771 外 7 个序列在多聚谷氨酰胺区也出现很大的变
异, 如 GQ871770、GQ871776 和 GQ871777 在此区只有 6
个氨基酸QQEQQ/RQ, 而GQ871772长达 17个谷氨酰胺(Q)
重复出现(表 3)。
图 2 8个推导的氨基酸序列比对
Fig. 2 Alignment of eight deduced amino acid sequences
“.”、“*”和“C”分别表示缺失氨基酸、终止密码子和半胱氨基酸残基。
“.”, “*”, and “C” represent deletions, stop condons, and cysteineresidues, respectively.
第 3期 王明霞等: 陕 253 γ-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析 529
表 1 8个基因与其他来源的醇溶蛋白基因序列一致性比较
Table 1 Comparison of nucleotide sequences between the eight gliadin genes and those from other species
序列一致性 Identity of sequences (%) GenBank登录号
GenBank acc. No.
基因来源
Source GQ871770 GQ871771 GQ871772 GQ871773 GQ871774 GQ871775 GQ871776 GQ871777
AF234649 T. aestivum 85 83 83 93 74 85 82 83
AF120267 T. spelta 86 84 83 86 73 86 83 83
AJ389670 T. compactum 80 78 79 82 70 80 78 78
EF432546 S. sylvestre 51 50 52 53 42 51 52 52
X77963 T. durum 92 86 91 79 68 91 99 99
M36999 T. aestivum 92 87 92 79 67 92 99 99
表 2 γ-醇溶蛋白重复区的比较
Table 2 Comparison of the repeated regions of γ-gliadins
GenBank登录号
GenBank acc. No.
重复单元
Motif
数目
Number
脯氨酸含量
Proline content (%)
谷氨酰胺含量
Glutamine content (%)
GQ871770 PQQQPSPQPQQ PFCQQPQQ TIPQPHQ TFHHQPQQ TYPHQPQQQ
FPQTQQPQQ PFPQPQQ TFPQQPQL PFPQQPQQ PFPQPQQPQQQ
FPQSQQPQQ PLPQPQQQ FLQPQQPQQ SFPQQQQ PLIQLSLQQQ
15 27.9 44.8
GQ871772 PQQQPFPQPQQ PFCEQPQR TIPQPHQ TFHHQPQQ TFPQP EQ
TYPHQPQQQ FPQTQQPQQ PFPQPQQ TFPQQPQL PFPQQPQQ
PFPQPQQPQQ PFPQSQQPQQ PFPQPQQQ FPQPQQ PQQ SFPQQQQ
PLIQPYLQQQ
16 26.8 31.7
GQ871773 PQQQPFPQPHQ PFSQQPQQ TFPQPQQ TFPHQPQQQ FSQPQQPQQQ
FIQPQQ PFPQQPQQ TYPQRPQQ PFPQTQQPQQPF PQSQQPQQ
PFPQSQQPQQ PFPQPQQQ FPQPQQPQQ SFPQQQ PSLIQQSLQQQ
15 26.7 48.8
GQ871774 LQQQLVPQLQQ PLSQQPQQ TFPQPQQ TFPQTQQPQQ
PFPQLQQPQQ PFPQPQQQ LPQPQQPQQ SFPQQQ RSFIQPSLQQQ
9 20.4 44.1
GQ871775 PQQQPVLLPQQ PFSQQPQQ TFPQPQQ TFPHQPQQQ FSQPQQPQQQ
FIQPQQ PFPQQPQQ TYPQRPQQ PFPQTQQPQQ PFPQSQQPQQ
PFPQPQQQ FPQPQQQ SFPQQQ PSLIQQSLQQQ
14 24.2 46.2
GQ871776 PQQQPLPQPQQ PFCEQPQR TIPQPHQ TFHHQPQQ TFPQPEQ
TYPHQPQQQ FPQTQQPQQ PFPQPQQ TFPQQPQL PFPQQPQQ
PFPQPQQPQQ PFPQSQQPQQ PFPQPQQQ FPQPQQPQQ SFPQQQQ
PAIQSFLQQQ
16 27.9 44.8
GQ871777 PQQQPFPQPQQ PFCEQPQR TIPQPHQ TFHHQPQQ TFPQPEQ
TYPHQPQQQ FPQTQQPQQ PFPQPQQ TFPQQPQL PFPQQPQQ
PFPQPQQPQQ PFPQSQQPQQ PFPQPQQQ FPQPQQPQQ SFPQQQQ
PAIQSFLQQQ
16 27.9 44.8
表 3 7个序列多聚谷氨酰胺区的比较
Table 3 Alignment of polyglutamine regions of seven sequences
obtained
GenBank登录号
GenBank acc. No.
多聚谷氨酰胺区序列
Sequence of polyglutamine region
GQ871770 QQEQRQ
GQ871772 QQEQQQQQQQQQQQQQQQ
GQ871773 QQEQQEQRQ
GQ871774 QQQQQQQQQQ
GQ871775 QQEQQEQRQ
GQ871776 QQEQQQ
GQ871777 QQEQQQ
2.3 启动子序列分析
将其中 4 个包含启动子区的序列 (GQ871770、
GQ871772、GQ871774和 GQ871776)起始密码子上游–350
bp 片段递交到 PLACE database 进行分析, 结果如图 3。
在–308 bp处, 4条序列均具有胚乳基序元件(TGTAAAG);
在上游–284 bp 处, 4 条序列均具有 CCAAT 元件(CAAT-
like box); 在上游–97 bp处, 4条序列均存在保守的 TATA
AAA 基序 (TATA box), 该元件与模式元件 TATAA/
TAA/T符合度很高[19]。
麦类作物种子储藏蛋白编码基因上游－300 bp 附近
存在一段长度为 30 bp的保守胚乳盒(endosperm box, EB),
该序列又包含–300 bp元件(TGTAAAGT)及 GCN4类似基
序(GCN4-like motif, GLM, G/ATGAGTCATG)[20-22]两种类
型的反式作用因子。序列比对表明 , GQ871770、
GQ871772、GQ871774和 GQ871776在胚乳框存在典型变
异, 此 4 条序列分别在胚乳盒的第 5、第 14、第 15、第
21、第 29 和第 30 位点存在 6 处 SNP, 其中第 29、第 30
位点变异发生于 GCN4 基序内。BLAST 证实, 这些位点
均首次见于储藏蛋白的–300 bp 区。WebLogo3 在线模体
分析表明, 储藏蛋白的 30 bp保守胚乳盒更具代表性的模
体公式为 TGACWTGTAAAGTGAATAAGRTGAGTCADD
(图 4)。
530 作 物 学 报 第 36卷
图 3 γ-醇溶蛋白启动子序列比对
Fig. 3 Alignment of sequence of promotion region of γ-gliadin
黑体字表示胚乳框。Bold character represented the endosperm box.
图 4 小麦储藏蛋白胚乳框序列比对
Fig. 4 Alignment of the endosperm box from wheat storage proteins
＊: 本研究测定 γ-醇溶蛋白所特有的碱基。＊: Novel nucleotides appeared in the present study.
2.4 γ-醇溶蛋白基因进化树分析
γ-醇溶蛋白基因与 ω-醇溶蛋白基因及高分子量谷蛋
白基因差异显著, 而与 α-醇溶蛋白基因和低分子量谷蛋
白基因较为接近, 可聚为一大类。同时, γ-醇溶蛋白本身存
在内类群 , 其中 GQ871770、GQ871771、GQ871775 与
GQ871772、GQ871776、GQ871777分别聚合于两个亚支,
共同与 GQ871773与 GQ871774聚合的一支并列并保持了
对小麦种子其他种类的贮藏蛋白亚基的距离(图 5)。
3 讨论
本研究克隆的 8 个 γ-醇溶蛋白基因在信号肽、重复
区和多聚谷氨酰胺区均有不同。在醇溶蛋白基因中, 半胱
氨酸的数目和相对位置非常保守 , 这对于形成稳定的分
子间和分子内二硫键非常重要 [23], 稳定的分子间和分子
内二硫键的形成, 有助于将多个蛋白质亚基联在一起, 形
成网络结构, 从而影响小麦面粉的黏弹性和延展性[24]。通
常, γ-醇溶蛋白基因含有 8 个保守的半胱氨酸, 形成分子
内二硫键。Anderson 等[18]曾报道 γ-醇溶蛋白基因中出现
额外半胱氨酸现象 , 并认为这样的醇溶蛋白基因可能为
聚合体的形成提供更多因素。本实验中的 8个 γ-醇溶蛋白
中 4个氨基酸序列含有多余的半胱氨酸残基, 形成分子间
二硫键, 从而参与面筋的聚合。这些特殊的变异可能会影
响二硫键的形成, 对面团特性造成影响。因此在下一步实
验中, 进一步表达纯化这些基因, 进行功能分析将有助于
研究不同半胱氨酸数目的 γ-醇溶蛋白的功能。克隆的 8
个 γ-醇溶蛋白基因重复区结构同 Shewry等[25]的研究结果
相似, 由两个基本的重复单元 PQPQPFP 和 PQQPY 组成,
但重复区在数量上有很大差异, 如 GQ871774在 122位比
其他少长达 57 个氨基酸的重复序列, GQ871773 在 64 位
比其他序列多两个重复单元(PFPQSQQPQQ和 PFPQPQQQ)。
因此, 可以进一步表达纯化这些基因, 研究不同重复区长
度的 γ-醇溶蛋白的功能。
本研究发现尽管胚乳框元件被公认为高度保守, 但
在–300 bp元件前以及转录激活因子(GCN4)中存在变异。
这种变异意味着在 γ-醇溶蛋白中一些亚基的表达效率可
能因此而受到抑制/提高, 是否具有此种效应将做深入探
讨。另外, 进化树比对分析表明 γ-醇溶蛋白内存在显著的
分歧, 本研究将其聚为两支, 而且含有 9 个半胱氨酸残基
的 γ-醇溶蛋白独立一支。
通过对优质小麦品种 γ-醇溶蛋白家族基因克隆及序
第 3期 王明霞等: 陕 253 γ-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析 531
图 5 γ-醇溶蛋白与已知的小麦贮藏蛋白开放阅读框序列同源性对比树状图
Fig. 5 Phylogenetic trees based on ORFs of γ-gliadin and some storage genes alignment published previously
列分析 , 从另一个侧面反映了该家族成员可能在小麦加
工品质中扮演某种不为所知的角色 , 特别是对本研究发
现的 4个具有奇数半胱氨酸残基的基因。同时, 随着对小
麦及其近缘种属材料的研究 , 将发掘大批为分子育种所
用的优异资源。
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