全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(12): 2299−2305 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中央级公益性科研院所基本科研业务费专项重点项目(SJA0904)和农业部种子农药质量安全监管专项(农财发[2011]50号)
资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 杨伟华, E-mail: yangwh@cricaas.com.cn, Tel: 0372-2525389
第一作者联系方式: E-mail: kuangmeng007@163.com, Tel: 0372-2562278
Received(收稿日期): 2011-06-13; Accepted(接受日期): 2011-09-18; Published online(网络出版日期): 2011-09-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110929.1550.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.02299
棉花杂交种纯度的 SSR标记检测及其与田间表型鉴定的相关性
匡 猛 杨伟华* 张玉翠 许红霞 王延琴 周大云 冯新爱 苏 畅
周 红
中国农业科学院棉花研究所 / 棉花生物学国家重点实验室, 河南安阳 455000
摘 要: 以分布于棉花 26 条染色体的 36 对 SSR 核心引物, 在 6 份成套中棉所系列杂交种间筛选双亲互补型杂合位
点作为纯度检测标记, 采用单位点平均法与双位点差异法统计 SSR 标记检测结果; 在棉铃期考察棉花株型、铃形、
叶形、花及茎等性状, 比对田间表型与分子检测结果, 分析相关性。结果表明, 34对核心引物在 6个杂交种上获得 101
个杂合位点, 平均每个杂交种具有 16.8 个。田间表型鉴定结果高于分子标记检测结果, 单位点平均法的相关性高于
双位点差异法, 校正后的相关性进一步提高, 相关系数 r=0.7841, 呈高度相关。EST-SSR标记的检测结果与田间表型
鉴定结果的相关性显著高于 Genomic-SSR标记。相同染色体上的不同引物检测结果差异较小。不同的统计方法与标
记类型获得的分子标记检测结果差异较大。高度纯合的亲本将会有效提高分子标记鉴定结果与表型鉴定结果的相关
性。
关键词: 棉花; 杂交种; SSR; 形态学; 纯度
Cotton Hybrid Purity Tested by SSR Markers and Its Correlation with Pheno-
type Identification in Field
KUANG Meng, YANG Wei-Hua*, ZHANG Yu-Cui, XU Hong-Xia, WANG Yan-Qin, ZHOU Da-Yun, FENG
Xin-Ai, SU Chang, and ZHOU Hong
Cotton Research Institute, Chinese Academy of Agriculture Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, China
Abstract: Cotton is one of the most important cash corps. Hybrid cotton is extensively grown in China. Hybrid seeds are generally
planted and used for purity identification. The process takes long time and much money. Therefore, it is important to explore a new
method to inspect the purity of hybrid cotton. In order to explore the validity of hybrid cotton purity identification using SSR marker
technique, the purity for six hybrids was tested by SSR approach and morphological assessment, and the correlation between the two
methods was researched. Primers with complementary band type screened out from 36 evenly distributed SSR pairs were applied in
purity identification. Morphological traits including plant type, boll, leaf shape, flower and stem were observed. Two statistics meth-
ods were used for testing purity based on SSR marker, and the results were compared to that of morphological identification. Among
the six hybrid cottons, 34 primer pairs had 101 heterozygous loci, with an average of 16.8 heterozygous loci for each hybrid. The
purity based on morphology was higher than that on SSR markers, the results of “Single locus on average” (the average value of
purity test by each SSR locus) had a higher correlation with morphology compared to “Double locus difference” (if more than two
SSR loci of an individual are different from the tested cultivar’s, the individual is considered as farraginous plant), and the correlation
would be better after calibration (correlation coefficient reached to 0.7841). Correlation based on EST-SSR was much better than that
on Genomic-SSR. There was certain relativity at different loci of the same chromosome. The purity was relevant to different statistics
method and marker type. There will be a good correlation for purity identification between methods of SSR marker and morphology
if the hybrid parents are highly pure.
Keywords: Cotton; Hybrid; SSR; Morphology; Purity
2300 作 物 学 报 第 37卷

棉花是我国主要的经济作物 , 优良新品种的培育与
推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要
意义。近年来, 随着棉花杂交育种工作的迅速开展, 加上
杂交种所表现出的杂种优势, 棉花杂交种在中国得到了
广泛的推广与种植。杂交种子的纯度鉴定是农作物种子质
量检验的一项重要内容。然而, 由于骨干亲本的集中使用
与转基因技术在棉花育种中的应用, 棉花品种间的遗传
差异越来越小。完全根据表型性状鉴定品种纯度越来越困
难 , 同时表型鉴定的时效性差 , 容易受环境与主观因素
的影响。以分子标记为基础的DNA指纹鉴定技术具有准
确可靠、简单快速、易于自动化的优点, 通过构建DNA
指纹图谱快速鉴定是品种鉴定技术实现产业化的前提 ,
也是品种鉴定技术的发展趋势。郭旺珍等[1]建立了我国几
个棉花主栽品种的RAPD指纹图谱, 易成新等 [2]将RAPD
标记应用于皖杂40杂交种的纯度鉴定。相比之下, 以微卫
星为基础的SSR标记在DNA指纹鉴定上显示了独特的优
越性[3-4], 已被广泛应用于水稻[5-8]、小麦[9-11]、玉米[12-14]、
大豆[15-17]和油菜[18-21]等主要农作物。武耀廷等[22]首次利
用SSR标记检测了30个陆地棉栽培品种和4个杂交种亲本
的多态性, 建立了杂交种的指纹图谱。刘勤红等[23]通过广
泛筛选 , 获得了十几个能够区分鲁棉研15与其F1的标记
位点, 为鲁棉研15的纯度快速鉴定奠定了基础。许兰杰
等[24]利用SSR标记研究了棉花杂交种兴杂2号纯度。研究
者普遍认为, 利用分子标记技术鉴定棉花品种是可行的。
然而 , 我国目前棉种鉴定仍以田间表型性状为主 , 尚未
见将分子标记检测结果与田间形态鉴定的结果比较研究
的报道。本研究采用SSR标记对中棉所系列杂交种F1代的
纯度进行了分子检测与田间小区种植鉴定, 对比其结果,
研究其与相关性 , 为SSR标记技术应用于棉花杂交种纯
度鉴定提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 供试材料
中棉所 47 (ZMS47)、中棉所 48 (ZMS48)、中棉所 52
(ZMS52)、中棉所 66 (ZMS66)、中棉所 72 (ZMS72)和中
棉所 75(ZMS75)均由中棉种业科技股份有限公司制种基
地提供 , 种植于中国农业科学院棉花研究所试验农场 ,
在铃期调查田间性状, 包括株型、铃形、叶形、花及茎等
性状, 以供鉴定杂交种纯度。
1.2 DNA提取及引物
采用匡猛等[25]的单粒棉花种子 DNA 快速提取方法
制备 DNA 样品。每套杂交种父母本各取 8 粒重复, F1代
杂交种子随机取 80粒。采用本课题筛选的分布于棉花 26
条染色体的 36对 SSR核心引物[26], 在 6份成套中棉所系
列杂交种间筛选双亲互补型位点作为纯度检测标记。
1.3 SSR-PCR扩增
20 μL反应液中包含: 10×buffer (含 15 mmol L–1 Mg2+)
1.65 μL, 2.5 mmol L–1 dNTP 0.8 μL, 20 μmol L–1 SSR引物
0.3 μL, 2.5 U μL–1 Taq DNA聚合酶 0.4 μL, 20 ng μL–1
DNA模板 2 μL, ddH2O 14.85 μL。反应程序为 95℃预变
性 2 min; 94℃变性 45 s, 55℃退火 45 s (个别引物适当调
整退火温度), 72℃延伸 2 min, 共 30个循环; 72℃延伸 7
min。
1.4 电泳检测
PCR扩增产物变性后在 6%测序胶上分离, 90 W电泳
1 h。参考王凤格等[27]快速银染法, 稍加修改如下, 10%无
水乙醇+0.5%冰醋酸组成的固定液固定 5 min; 双蒸水快
速漂洗 1次; 0.2% AgNO3溶液染色 5 min; 3% NaOH+0.5%
甲醛组成的显影液显影; 固定液定影。
1.5 纯度统计
以引物筛选获得的在杂交种与亲本间表现为双亲互
补型的杂合位点作为纯度检测标记, 依据 SSR 扩增产物
在电泳凝胶上的相对位置, 以父本与母本基因型作为对
照, 统计杂交种 F1 代中各种基因型的表现, 包括双亲互
补型, 偏母型、偏父型及杂种型, 表现为双亲互补型的样
品计为真实杂交种 F1 代种子, 表现为其他带型的样品计
为杂株。采用单位点平均法(平均单个位点的纯度结果作
为纯度最终值)和双位点差异法[以同一样品在多个受检
位点上存在大于或等于 2个差异位点(即杂株带型)作为杂
株的判定标准], 统计正常株纯度。
2 结果与分析
2.1 杂交种纯度检测位点
采用 36对 SSR核心引物对 6个成套杂交种进行杂合
位点的筛选, 获得可用于杂交种纯度检测的双亲互补型
杂合位点 101个(表 1), 其中中棉所 47杂合位点最多, 达
23个, 占所用筛选引物的 64%。中棉所 75杂合位点最少,
为 11 个, 平均每个杂交种具有 16.8 个杂合位点, 足以满
足杂交种纯度分析的需要。36 个引物中 , 除 M06-1 与
M25-1 未表现杂合基因型外, 其他 34 个标记均有 1~6 个
杂合位点, 平均每个标记具有 2.97 个杂合位点, 平均杂
合率接近 50%。其中 M26 在 6 个杂交种上都表现为双亲
互补的杂合基因型, 杂合率达 100%, 尤其适用于杂交种
纯度检测。图 1所示为引物 M07对中棉所 66的纯度检测
扩增结果, 以父本与母本基因型作为对照, F1代杂交种子
在编号为 13的样品上表现为偏母的基因型, 在编号为 10
的样品上表现为不同于父本、母本及杂合基因型的杂种带
型, 且父本的 8个重复中, 编号为 F6 的样品表现为偏母
带型。
2.2 室内纯度检测与田间形态鉴定结果比较
对室内 SSR 标记检测结果采用两种方法统计, 单位
点平均法结果表明纯度最高的品种是中棉所 47, 为
94.7%; 纯度最差的品种是中棉所 66, 为 86.7%, 平均纯
度为 89.9%。双位点差异法结果表明纯度最高的品种是中
棉所 47, 为 86.3%, 这与方法一的结果一致。纯度最差的
品种是中棉所 52 与中棉所 72, 均只有 73.8%, 平均纯度
第 12期 匡 猛等: 棉花杂交种纯度的 SSR标记检测及其与田间表型鉴定的相关性 2301



图 1 引物 M07对中棉所 66的纯度检测扩增结果
Fig. 1 SSR profile of cotton hybrid ZMS66 amplified by M07 primer
F1~F8: 父本; M1~M8: 母本; 1~20: F1种子样品编号。
F1–F8: male; M1–M8: female; 1–20: F1 individual seeds.

表 1 供试杂交种的杂合位点分布
Table 1 Distribution of heterozygous loci in the tested cotton hybrids
引物编号
Primer No.
中棉所 47
ZMS47
中棉所 48
ZMS48
中棉所 52
ZMS52
中棉所 66
ZMS66
中棉所 72
ZMS72
中棉所 75
ZMS75
杂合位点数
Number of heterozygous loci
M01 1 1 1 1 4
M02 1 1 2
M03 1 1 1 1 4
M03-1 1 1 2
M04 1 1 1 1 1 5
M05 1 1
M05-1 1 1 1 1 4
M06 1 1 1 1 4
M06-1 0
M07 1 1 2
M08 1 1 2
M09 1 1 1 1 4
M10 1 1 1 1 4
M11 1 1 1 3
M11-1 1 1 2
M12 1 1 2
M13 1 1 1 3
M13-1 1 1 1 3
M14 1 1 1 1 4
M15 1 1
M15-1 1 1 1 1 4
M16 1 1 2
M17 1 1 1 3
M17-1 1 1
M18 1 1 1 3
M19 1 1 1 1 1 5
M20 1 1 2
M21 1 1 1 1 4
M21-1 1 1 1 3
M22 1 1 1 3
M23 1 1 1 3
M23-1 1 1
M24 1 1
M25 1 1 1 1 4
M25-1 0
M26 1 1 1 1 1 1 6
合计 Total 23 14 19 18 16 11 101
2302 作 物 学 报 第 37卷

为 78.0%。田间表型鉴定表明, 中棉所 52的纯度最高, 为
98.3%。中棉所 72的纯度最差为 90.2%, 这可能是其母本
纯度较差所致(仅为 92.6%), 父母本平均纯度均为 97.7%,
高于杂交种平均纯度 93.3%。总体来看, 表型鉴定纯度高
于分子标记检测, 单位点平均法的平均纯度值高于双位
点差异法(表 2)。

表 2 表型鉴定与分子检测鉴别的纯度结果
Table 2 Purity results of two test methods
品种名称
Name of hybrid
中棉所 47
ZMS47
中棉所 48
ZMS48
中棉所 52
ZMS52
中棉所 66
ZMS66
中棉所 72
ZMS72
中棉所 75
ZMS75
平均值
Average
表型鉴定 Morphological identification
父本 Male parent 98.4 98.4 98.9 95.7 98.7 96.1 97.7
母本 Female parent 99.3 99.3 98.8 99.4 92.6 96.7 97.7
杂交种 Cotton hybrid 95.1 95.1 98.3 90.5 90.2 90.7 93.3
SSR标记鉴定 Identification based on SSR
单位点平均法 SLA 94.7 90.8 90.5 86.7 89.3 87.5 89.9
双位点差异法 DLA 86.3 75.0 73.8 75.0 73.8 83.8 78.0
SLA: single locus on average; DLA: double locus difference.

以田间表型鉴定的 6个杂交种纯度结果为对照, 分别
与 SSR 标记纯度检测获得的两组统计数据进行相关性分
析(低度相关: 0<|r|<0.4; 中度相关: 0.4≤|r|<0.7; 高度相关:
0.7≤|r|≤1)。单位点平均法的相关系数为 r = 0.6379 (R² =
0.4069, 图 2), 达到了中度相关, 双位点差异法的相关系
数为 r = –0.0548 (R² = 0.003, 图 3), 为负相关。表明单位
点平均法相比双位点差异法与田间表型鉴定的结果相关
性高。

图 2 单位点平均法的相关性
Fig. 2 Correlation of “single locus on average”

图 3 双位点差异法的相关性
Fig. 3 Correlation of “double locus difference”
在 SSR 标记检测结果中, 剔除了在亲本上表现出大
于或等于 2 个差异位点的标记。将 SSR 标记纯度结果校
正后(表 3), 相关性分析表明, 单位点平均法的相关系数
r=0.7841 (R²=0.6148, 图 4), 呈高度相关 ; 双位点差异法
的相关系数 r=0.4257 (R²=0.1812, 图 5), 呈中度相关。即
校正后两种 SSR 标记纯度统计方法相比校正前都显著提
高。
2.3 不同标记类型的纯度检测结果
进行杂交种纯度检测的 34对 SSR核心引物中, 15对
为 EST-SSR标记(来源于表达序列标签开发的 SSR), 19对
为 Genomic-SSR 标记 (来源于基因组序列直接开发的
SSR)。对两种标记类型的纯度检测结果分别统计, 校正后
的纯度结果与田间表型鉴定结果进行了相关性分析 (表
4)。EST-SSR标记, 单位点平均法的统计结果相关系数为
0.8254, 达到了高度相关; 双位点差异法的统计结果相关
系数为 0.4845, 为中度相关。Genomic-SSR标记, 单位点
平均法的统计结果相关系数为 0.7192, 达到了高度相关;
双位点差异法的统计结果相关系数为 0.3635, 为低度相
关。即 EST-SSR 标记的检测结果与田间表型鉴定结果的
相关性显著高于 Genomic-SSR 标记 , 这可能是由于
EST-SSR 标记来源于表达序列标签, 与表型性状的相关
性更大。
2.4 相同染色体上不同引物位点的检测结果
以中棉所 47为例, 在 4条染色体上均具有 2个杂合
位点 , 其杂交种纯度检测结果表明(表 5), 同一染色体上
的 2个标记位点纯度检测结果相差最大的为染色体 21上
的 M21 与 M21-1, 差异为 2.5%; 染色体 23 上的 M23 与
M23-1相差 1.3%; 染色体 11与染色体 15差异最小, 均为
1.2%, 4条染色体上的 2个标记纯度差异平均值为 1.55%,
表明相同染色体上的不同引物检测结果差异较小, 这与
前人的结论一致[28]。
3 讨论
广大科研工作者普遍认为利用分子标记技术进行品
第 12期 匡 猛等: 棉花杂交种纯度的 SSR标记检测及其与田间表型鉴定的相关性 2303


表 3 校正后的纯度结果
Table 3 Results of calibrated purity
品种名称
Name of hybrid
中棉所 47
ZMS47
中棉所 48
ZMS48
中棉所 52
ZMS52
中棉所 66
ZMS66
中棉所 72
ZMS72
中棉所 75
ZMS75
表型鉴定结果 Morphological identification 95.1 95.1 98.3 90.5 90.2 90.7
单位点平均法 Single locus on average 94.7 91.3 93.3 86.7 90.6 87.5
双位点差异法 Double locus difference 86.3 75.0 88.8 76.3 82.5 83.8



图 4 校正后单位点平均法的相关性
Fig. 4 Calibrated correlation of “single locus on average”

图 5 校正后双位点差异法的相关性
Fig. 5 Calibrated correlation of “double locus difference”

表 4 不同标记类型的检测结果与相关系数
Table 4 Results and correlation coefficients of different marker type
品种名称
Name of hybrid
中棉所 47
ZMS47
中棉所 48
ZMSo48
中棉所 52
ZMS52
中棉所 66
ZMS66
中棉所 72
ZMS72
中棉所 75
ZMS75
相关系数
r
EST-SSR
单位点平均法 Single locus on average 93.5 92.9 93.8 86.1 90.9 87.9 0.8245
双位点差异法 Double locus difference 90.0 91.3 91.3 76.3 92.5 86.3 0.4845
Genomic-SSR
单位点平均法 Single locus on average 95.4 90.0 93.1 87.3 90.4 87.3 0.7192
双位点差异法 Double locus difference 90.0 80.0 90.0 78.8 88.8 85.0 0.3635

表 5 同一染色体上不同引物位点的纯度检测结果
Table 5 Detection results of different loci on the same chromosome
染色体
Chromosome
标记编号
Marker No.
品种纯度
Purity
差异
Difference
M11 93.8 染色体 11
Chromosome 11 M11-1 95.0
1.2
M15 97.5 染色体 15
Chromosome 15 M15-1 96.3
1.2
M21 95.0 染色体 21
Chromosome 21 M21-1 97.5
2.5
M23 96.3 染色体 23
Chromosome 23 M23-1 95.0
1.3

种鉴定是可行的。在我国, 关于玉米与水稻品种DNA指纹
鉴定方法的行业标准已经发布与实施。然而, 棉花作为常
异花授粉的异源四倍体作物, 因其复杂的遗传背景与特
殊的组织成分, 相比二倍体作物, DNA指纹技术在棉花品
种鉴定中的应用研究面临更多的问题与难点, 如检测体
系的优化、适用于品种鉴定的标记筛选与评价、分子标记
与形态鉴定的相关性等方面都需要深入的研究。
3.1 SSR标记检测体系
基于 SSR 分子标记的 DNA 指纹检测技术能否得到
普及与推广, DNA快速提取是关键环节之一。由于棉花
组织富含棉酚、多糖、单宁等其他干扰物质 , 在细胞破
裂时 , 棉酚等多酚类物质自动氧化 , 与蛋白质、核酸等
发生不可逆反应 , 形成棕色胶状复合物 , 相对于其他作
物难以获得高质量的 DNA。传统的方法均以棉花幼苗叶
片为材料, 经液氮研磨提取 DNA[29-32]。此过程需要经过
幼苗培养、液氮研磨等环节, 存在 DNA提取周期较长、
操作步骤较多、实验成本较高等问题 , 不能完全适应实
际中杂交种纯度快速检测的需要。本课题经过大量的实
验探索 , 以棉花干种子为材料 , 开发出了一种适用于棉
花 SSR 分析的单粒棉种 DNA 快速提取方法[25], 相比常
规的以棉花幼苗叶片为材料的 DNA 提取方法, 在降低
实验成本的同时大大提高了工作效率。此外 , 以建立快
速准确、经济简便、稳定可靠的棉花 DNA 指纹鉴定标
准实验体系为目标, 在 PCR扩增、凝胶电泳与银染检测
等技术环节的系统优化, 为 DNA 指纹技术应用于棉花
品种鉴定奠定了基础。
2304 作 物 学 报 第 37卷

3.2 适用于纯度检测的 SSR标记
由于杂交棉在制种过程中大部分都是通过人工去雄
完成的, 所以影响棉花杂交种子纯度的主要问题就是杂
交棉母本去雄不彻底或漏去雄形成的自交铃[23-24]。此外,
由于制种过程中的串粉及收获后的机械混杂也导致杂株
的产生。因此, 棉花杂交种纯度鉴定, 一是检测自交铃,
这是最主要的; 二是检测杂株。基于这两点, 适用于纯度
鉴定的核心引物必须具备以下 2个特征: ①杂合率高, 能
比较容易地筛选到双亲互补型的引物, 用于自交铃的检
测; ②多态性高, 具有较高的区分其他杂株的能力。本研
究所采用的 36对核心引物是以 2008年来自我国 3大棉区
8 个棉花主产省份 32 份棉花主栽品种为筛选材料[26], 以
常规种的表现评价多态性, 以杂交种的表现评价杂合率,
同时考虑到染色体上的分布, 综合入选的一套核心引物,
因此 , 既具有一定的多态性也具有一定的杂合率 , 适用
于棉花杂交种纯度检测的需要。然而, 随着受检品种的范
围不断扩大, 需要适当补充新的标记。
3.3 分子标记与形态鉴定的相关性
棉花是常异花授粉作物 , 具有不同于自花授粉作物
和异花授粉作物的遗传特性。随着我国经济社会的迅速发
展 , 培育和审定棉花新品种速度也在加快 , 许多杂交育
成的新品种 , 尽管在主要性状上看起来表现一致 , 其实
并不稳定, 后代仍有分离的可能。特别是在急功近利的思
想指导下, 将一些表现较好的杂种低代材料提前审定推
广, 结果形成性状多样化的混杂群体。即棉花杂交种除了
在生产与加工环节由于人为原因导致的自交与混杂外 ,
同时 , 在品种选育过程中因亲本自交代数不够 , 存在亲
本本身遗传背景未完全纯合稳定的现象。如某些位点还存
在剩余变异, 而这些未纯合的位点不一定直接反映在形
态性状上, 因此使用这些标记位点进行纯度检测的结果
与田间形态鉴定结果的相关性较差, 本研究基于这一观
点 , 对亲本上表现纯合度较差的标记位点剔除后 , 分子
标记检测结果与田间形态鉴定结果的相关性大大提高 ,
达到了高度相关。即高度纯合的亲本将会有效提高分子标
记鉴定结果与形态鉴定结果的相关性, 这与沈金雄[33]、汤
天泽等[34]在油菜上的研究结果一致。
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