全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(2): 360368 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国科学院“百人计划”(KZCX2-YW-BR-11), 国家自然科学基金项目(30971813 和 31101170), 黑龙江省杰出青年基金(JC200919),
黑龙江省青年基金(QC2011C015), 黑龙江省归国基金(09SRS11), 教育部留学回国人员科研启动基金项目(Y0SQY11001)和所前沿领
域项目(2009ZX08009-013B)资助。
* 通信作者(Corresponding authors): 刘宝辉, E-mail: liubh@neigaehrb.ac.cn; 邱丽娟, E-mail:qiu_lijuan@263.net
第一作者联系方式: E-mail: sunxia@neigaehrb.ac.cn ** 同等贡献(Contributed equally to the work)
Received(收稿日期): 2011-06-21; Accepted(接受日期): 2011-10-12; Published online(网络出版日期): 2011-12-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20111201.0921.006.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00360
非生物胁迫诱导的 GmMYB基因克隆与表达分析
孙 霞 1,** 刘晋跃 1,2,** 袁晓辉 1 潘相文 1 杜维广 3 任海祥 3 马永波 4
Jun ABE5 邱丽娟 6,* 刘宝辉 1,*
1 中国科学院东北地理与农业生态研究所大豆分子育种实验室 / 中国科学院黑土区农业生态院重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150081;
2中国科学院研究生院, 北京 100049; 3黑龙江省农业科学院牡丹江分院 / 国家大豆改良中心牡丹江试验站, 黑龙江牡丹江 157041; 4
辽宁省农业环境保护监测站, 辽宁沈阳 110034; 5日本北海道大学农学院, 日本札幌 060-8589; 6中国农业科学院作物科学研究所, 北
京 100081
摘 要: 本研究室根据一段抗逆的 EST序列, 从栽培大豆东农 42中克隆到 4个开放阅读框均是外显子和内含子间隔
构成的 R2R3-MYB基因, 其中 Gm02g01300、Gm03g38040和 Gm10g01340与已公布的 Williams 82基因组序列完全一
致, Gm19g40650第 375位的单核苷酸突变导致多肽链第 125位的氨基酸发生置换(GAG375→GAC375, E125→D125)。以
人工气候箱内模拟非生物胁迫(盐、碱、干旱和低温)处理栽培大豆东农 42芽期, 选择适宜时间点, 采用荧光定量 PCR
技术, 检测 R2R3-MYB基因的表达。结果表明, 4个基因的表达水平都存在明显波动, 呈诱导后短暂上调或下调两种
表达模式, 但表达时间、强度和趋势存在明显差异; Gm02g01300受干旱诱导明显, Gm03g38040受多种胁迫条件诱导
表达强烈, 推测这些基因在大豆非生物胁迫的调控中起到重要作用; 另外, 在子叶与胚间, 单个基因的表达也存在
差异; 多种非生物胁迫条件下, 基因的表达不仅存在时空差异, 可能也具有调控模式的差异。
关键词: 非生物胁迫; GmMYB; 芽期; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of GmMYB Genes Induced by Abiotic Stresses
SUN Xia1,**, LIU Jin-Yue1,2,**, YUAN Xiao-Hui1, PAN Xiang-Wen1, DU Wei-Guang3, REN Hai-Xiang3, MA
Yong-Bo4, Jun ABE 5, QIU Li-Juan6,*, and LIU Bao-Hui1,*
1 Laboratory of Soybean Molecular Breeding, Northeast Institute of Geography and Agroecology, Chinese Academy of Sciences / Key Laboratory of
Mollisols Agroecology, Chinese Academy of Sciences, Harbin 150081, China; 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing
100049, China; 3 Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Mudanjiang 157041, China; 4 Liaoning Agricultural Envi-
ronmental Protection Monitoring Station, Shenyang 110034, China; 5 Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University, Sapporo, Hokkaido
060-8589, Japan; 6 Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: Response to external environment is the outcome of stress-induced gene expression. In this paper, based on one
stress-induced EST sequence, we cloned four R2R3-MYB genes from soybean cultivar Dongnong 42, whose genomic sequences con-
sisted of three exons and two introns. Three of them corresponding to Gm02g1300, Gm03g38040, and Gm10g01340 are respectively
consistent with the sequences of Williams 82. A mutation at the 375th single nucleotide in the sequence of Gm19g40650 from
Dongnong 42 caused a synonymous amino acid substitution (E125–D125). To test the relationship of four MYB genes with stress resis-
tance, we treated the seedlings of cultivar Dongnong 42 with abiotic stresses including salt, alkali, drought and low temperature in the
artificial climate chamber. Quantitative PCR analysis indicated that all of the four genes were transient down-regulated or
up-regulated when subjected to the stresses, but different in the expression time, level and tendency. Gm02g01300 was induced by
drought stress while Gm03g38040 was strongly induced by multiple stresses, indicating that they play important roles in responding
to external stresses. There were also differences in the expression of individual gene between cotyledons and embryos. These results
under a variety of abiotic stress conditions suggest that the four R2R3-MYB genes are different not only in the expression patterns, but
also in the regulation modes.
Keywords: Abiotic stress; GmMYB; Bud period; Expression analysis
第 2期 孙 霞等: 非生物胁迫诱导的 GmMYB基因克隆与表达分析 361


高盐、极端温度、干旱等非生物胁迫因子是全球粮
食减产的重要因素, 导致世界主要农作物产量每年损失
约 50% (http://www.isaaa.org/)。面对复杂的环境影响因子,
植物体内功能蛋白和调节蛋白两大类基因被诱导表达 ,
产生一系列形态和生理生化方面的适应性变化, 从而在
一定范围内耐受非生物胁迫。
转录因子(调节蛋白中的重要一类)又称反式作用因
子, 是指能够与基因启动子区域中顺式作用元件发生特
异性相互作用的 DNA 结合蛋白, 通过它们之间以及与其
他相关蛋白之间的相互作用激活或抑制某些基因的转
录[1]。在信号传递与胁迫应答基因表达中, 通过转录因子
调控功能基因的表达, 是植物逆境应答反应的关键环节。
一个转录因子可以调控多个与同类性状有关的基因表
达[2]。对压力诱导基因的启动子分析结果表明, 植物受到
低温和渗透压(例如干旱、高盐)等胁迫时, 体内至少有 4
条独立途径控制基因的表达, 除 DREB1/CBF 仅对冷刺激
相应的多个组件具有诱导作用外, MYB 具有参与多条途
径响应胁迫信号的功能[2]。MYB (v-myb avian myelobla-
stosis viral oncogene homolog)是植物体内最大的转录因
子家族之一, 不仅参与了细胞分化、细胞周期的调节、激
素、植物次生代谢以及叶片等器官形态建成的调控 , 并
对环境因子应答起着重要的作用[3]。自 1987 年克隆出第
一个植物 R2R3-MYB 基因 ZmMYBC1 以来, 已从各种植
物中分离鉴定了大量 MYB 类基因 [4-7]。已有研究表明,
MYB 类转录因子在植物抗非生物胁迫过程中起着重要
的作用[8]。
厚叶悬蒴苣苔(Boea crassifolia)中的 BcMYB1受干旱
强烈诱导, 同时对 PEG、高盐、低温等胁迫产生一定程度
的应答[9]; 水稻(Oryza sativa)中的 OsMYB4基因的高量表
达能显著提高转基因植株对干旱、高盐、UV辐射等的耐
受性[10]; OsMYB3R-2 基因的过量表达不仅能提高拟南芥
转基因植株耐受低温、干旱和高盐的能力[11], 还能增强转
基因水稻耐受低温的能力[12]。转录因子 MYB基因还参与
植物营养成分缺乏等的应答反应 , 如: 拟南芥中参与高
等植物及单细胞藻类磷酸盐饥饿应答信号传导途径的
MYB基因 PHR1与 PSR1[13], 涉及 N缺乏调控和色氨酸饥
饿应答的MYB基因 ATR1和 ATR2等也相继被克隆[14-15]。
拟南芥中已发现的 100多个 R2R3-MYB基因[16-17]中, 至少
有 23 个 AtMYB 基 因 (AtMYB2[18-19] 、 AtMYB4[20] 、
AtMYB8[21]、AtMYB12[22]、AtMYB15[23-24]、AtMYB21[25]、
AtMYB30[26]、AtMYB32[27]、AtMYB34[28]、AtMYB41[29]、
AtMYB44[30]、AtMYB51[31]、AtMYB52[32]、AtMYB60[33]、
AtMYB61[34]、AtMYB68 [35]、AtMYB73[24,36]、AtMYB74[16]、
AtMYB77[24,36]、AtMYB94[16]、AtMYB96[37]、AtMYB102[38]
和 AtMYB108[39])被证实参与了非生物胁迫的应答过程 ,
提高了转基因植株的耐逆性。
大豆作为人类植物蛋白质和油分的重要来源, 是我
国重要的油料和经济作物。随着生态环境的不断恶化, 干
旱、低温、多雨、盐碱以及病虫害已成为限制大豆生产的
瓶颈, 选育抗逆性强的优良大豆品种是实现高产、优质、
高效大豆产业的根本途径。利用生物芯片分析大豆相关基
因的表达, 发现大豆根中受低磷诱导的转录因子大部分
为MYB类转录因子[40], 说明该类转录因子参与缺磷应答
反应。豆科模式植物百脉根(Lotus japonicus)中的 LjMYB101
基因和大豆中的 GmMYB101 基因参与缺氮的应答反
应[14]。GmMYB76、GmMYB92和 GmMYB177基因在 ABA、
高盐、干旱和/或低温诱导时均表现为上调, 拟南芥转基
因植株表现出抗逆性的增强[3]。Yang 等[41]利用 UV-B 射
线、干旱和高盐处理中豆 27, 诱导 GmMYBJ6基因的表达
水平增加, 暗示 GmMYBJ6基因表达与非生物胁迫密切相
关。因此, 开展大豆 GmMYB功能的研究对于大豆抗逆分
子育种研究十分必要。
1 材料与方法
1.1 大豆基因组 DNA的提取与 MYB基因的克隆
大豆品种 Williams 82、东农 42、黑农 35和合丰 25
分别由本研究室、东北农业大学大豆所、黑龙江省农业科
学院大豆所和合江大豆所提供。将种子于室温下
(24±0.5℃, 湿度 70%)吸胀, 避光培养 4 d, 取黄化苗, 经
液氮冷冻贮存在–80℃冰箱中备用。以 CTAB 法(Sigma)
小量提取基因组 DNA, Thermo Scientific NaNoDrop 2000c
检测提取 DNA的浓度和质量。
应用本研究室已获得的一段抗逆 EST 序列(未公布)
搜索大豆基因组数据库 (http://www.phytozome.net/soy-
bean), 获得高度相似的 MYB基因 Gm02g01300、Gm03g-
38040、Gm10g01340和 Gm19g40650。根据基因全序列分
别设计特异性引物 (表 1), 以基因组 DNA 为模板在
GeneAmp PCR System 9700 上进行全序列的扩增
(Invitrogen, Platinum Taq高保真 DNA聚合酶), PCR条件
为 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 68℃ 90 s, 38个循环;
68℃ 5 min。用 0.8%琼脂糖, TAE缓冲液, 100 V, 分离 30
min; 将回收的 PCR产物(Promega)连接至T载体(Promega)
上, 送交 Invitrogen公司测序。
1.2 大豆芽期非生物胁迫条件的设定
大豆芽期采用 PEG6000 (10%、20%、30%和 40%)、
盐(50、100、150和 200 mmol L1 NaCl)和碱(20、37.5、
50和 100 mmol L1 Na2CO3)胁迫处理, 低温下(0、2.0、4.0
和 6.0±0.5℃)使种子萌发, 与对照比较, 根据种子发芽率
或芽成活率, 设定 20% PEG6000、100 mmol L1 NaCl、20
mmol L1 Na2CO3和 6.0±0.5℃的胁迫条件。
1.3 总 RNA的提取纯化和 cDNA第一链的合成
选取饱满的东农 42种子, 室温下, 避光吸胀萌发 48
h, 分别采用低温、干旱、盐和碱胁迫处理, 间隔 0、0.5、
1、2、4、6、8、12和 24 h分别收集胚和子叶, 液氮冻存,
放于–80℃冰箱中备用。以 TRIzol (Invitrogen)和 LiCl
(Sigma)沉淀相结合小量提取总 RNA, 经 DNase I (Promega)
362 作 物 学 报 第 38卷


处理后, 以电泳与 Thermo Scientific NaNoDrop 2000c相
结合检测 RNA的浓度和质量, SuperScript III First-Strand
Synthesis System for RT-PCR试剂盒(Invitrogen)合成第一
条单链 cDNA, –20℃保存备用。

表 1 研究中所需引物
Table 1 Primers used in this study
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence (5′→3′)
Gm02g01300F ATGGAGACCATGAATGTTCAGG
Gm02g01300R TCATAATTCATCAGCAAGATGC
Gm03g38040F ATGGAGAGAAGTAGTGAAGAGG
Gm03g38040R TCAGAACAAGTCATGATGAGCAAG
Gm10g01340F ATGGATACGATCAGTGTTCAGG
Gm10g01340R TCATAAGTGATCAGCAAGATGC
Gm19g40650F ATGGAGAGGAGTTTATCAGGAAG
Gm19g40650R TCACGACAAGTCATGATCAGCG
qRT-β-tublin F[42-43] GAGAAGAGTATCCGGATAGG
qRT-β-tublin R[42-43] GAGCTTGAGTGTTCGGAAAC
qRT-Gm02g01300F ATGGAGACCATGAATGTTCAGGT
qRT-Gm02g01300R AACATTTGGGCGCAAGTAGTTC
qRT-Gm03g38040/Gm19g40650F CCTCCATTCCCGTTGGGGCAACAG
qRT-Gm03g38040R GTTACTGTTGGAGATTAAGCTGC
qRT-Gm19g40650R TTGAGCGTTGGAGATTAACGTGG
qRT-Gm10g01340F ATGGATACGATCAGTGTTCAGGC
qRT-Gm10g01340R GAACATTTGGTCGCAAATAGTTC
下画线的核苷酸分别为起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)。
The iniation and termination codes are underlined, respectively.

1.4 4个 GmMYB基因的克隆
以干旱和碱胁迫处理 2 h的 cDNA为模板, 分别扩增
4个 GmMYB基因序列(Invitrogen), PCR条件为 94℃ 2 min;
94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 68℃ 60 s, 38个循环; 68℃ 5 min。将
扩增产物克隆至 T载体(Promega)上, 送交 Invitrogen公司
测序。
1.5 以 MEGA4.0构建系统发生树
基于已公布的拟南芥中参与非生物胁迫应答的 23个
R2R3-MYB 蛋白序列和 ZmMYBC1、 AmMYBMIXTA、
AmMYBPHAN、 HvMYBGA、 NtMYB1、 PhMYBAn2 和
LjMYB101 同源蛋白保守结构域 DOMAIN 以及本研究克
隆到的 GmMYB、GmMYB92、GmMYB101和 GmMYBJ6, 用
Neighbor-Joining (NJ)方法构建系统发生树, Bootstrap 值
为 1000。
1.6 GmMYB基因表达模式分析
根据已获得的测序结果, 设计特异的荧光定量 PCR
(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物(表 1), 以东农
42 的基因组 DNA 和 cDNA 分别为模板, 扩增内参基因
β-tublin 和 GmMYB 基因, 连接至 T 载体(Promega)上, 送
交 Invitrogen 公司测序, 克隆片段与预测结果间的大小和
序列相一致。
以东农 42 非生物胁迫下不同时间点合成的第一链
cDNA为模板, 在 Bio-Rad DNA Engine Chromo4 多色实
时荧光定量 PCR 仪上进行 qRT-PCR, 反应体系含待测样
品 cDNA 1 L, 1.2  mol L–1上下游引物混合液 5 L,
2×SYBR溶液 10 L (Green qPCR SuperMix-UDG试剂盒,
Invitrogen), 超纯水补充体积至 20 L; 每个样品至少独
立重复 3次。反应条件为 95℃预变性 5 min; 95℃ 10 s,
60℃ 20 s, 72℃ 20 s, 40个循环。由荧光定量 PCR仪自动
读取数据。参见 Liu等[42]和 Kong等[43]的方法处理和分析
数据。
2 结果与分析
2.1 GmMYB基因的克隆与序列分析
依据本研究室在多种非生物胁迫条件下获得的一段
EST 序列 (259 bp, 未发表 ), 在大豆基因组数据库
(http://www.phytozome.net/soybean)中运用 Blast比对获得
Gm02g01300、Gm03g38040、Gm10g01340 和 Gm19g-
40650四个高度相似的基因序列。设计特异性引物在大豆
东农 42基因组中分别扩增获得 1 080、1 069、1 085和
1 481 bp的基因全序列(图 1-A); 以东农 42干旱和碱胁迫
的 cDNA为模板, 获得片段长度分别为 783、714、849和
第 2期 孙 霞等: 非生物胁迫诱导的 GmMYB基因克隆与表达分析 363


783 bp (图 1-B)的表达序列, 预测氨基酸序列长度(不计终
止密码子)分别为 260、237、282和 260。其中 Gm03g38040
和 Gm19g40650 在 NCBI 上分别注册命名为 GmMYB12a
和 GmMYB12b, 登录号为 AB510903 和 AB510904,
Gm02g01300 与已发表的 GmMYB76 (DQ822895)高度同
源。
对 GmMYB的基因组和 cDNA序列进行比较, 4个基
因都是由外显子和内含子间隔构成(图 2); 基因间基因组
序列长度的差异主要由内含子的长度所决定 , Gm19g-
40650的第 2个内含子明显较其他基因多 400 bp左右, 因
此全基因序列约 1 500 bp; 基因第 2个外显子的核苷酸数
目均是 130 bp, 开放阅读框(open reading frame, ORF)长
度的差异是由第 1和第 3个外显子的核苷酸数目所决定的,
而 DNA结合域 R2和 R3的核苷酸序列固定分配在 3个外
显子上, 第 1至第 3外显子上分别由 94、115和 127个核
苷酸构成(图 2)。
植物MYB蛋白氨基端的 DNA结合域(R1、R2和 R3)
中一般都含有起着疏水作用的保守的色氨酸残基(Trp, W),
通过对 4个 GmMYB 氨基酸序列的分析, 均具有 MYB 类
转录因子的共同特征, 其 N端具有 R2、R3两个 MYB结
构域(图 3-A), R3结构域的第一个色氨酸残基被异亮氨酸
残基(Ile, I)所取代; C端均含有一个富含酸性氨基酸残基
(Asp, D; Glu, E)的转录激活区 (Transcription activation
domain), 因此确定 Gm02g01300、Gm03g38040、Gm10g-
01340和 Gm19g40650均是 R2R3-MYB基因。
将 GmMYB 基因表达的 cDNA 序列分别与已公布的
基因组序列相比较 , Gm02g01300、Gm03g38040 和
Gm10g01340 基因完全一致; Gm19g40650 的测序结果较
预测的 cDNA序列在第 1和第 2外显子间插入了 30 bp核
苷酸(10 个氨基酸残基 : HWNSVARYTG); 对东农 42、
Williams 82、黑农 35和合丰 25中的Gm19g40650的 cDNA
序列进行比较, 东农 42、黑农 35和合丰 25在第 2和第 3

图 1 4个大豆 R2R3-MYB基因的克隆
Fig. 1 Cloning of four R2R3-MYB genes in soybean
100bp:exon
130 505136 161148
130 130 45479 276
190 529124 112130
130142 511120 578
Gm02g01300
Gm03g38040
Gm10g01340
Gm19g40650

图 2 4个大豆 R2R3-MYB基因的外显子与内含子结构
Fig. 2 Exon/intron structures of four R2R3-MYB genes in soybean

图 3 GmMYB蛋白序列的多重比较
Fig. 3 Multiple alignment of GmMYB amino acid sequences
100 : xon
364 作 物 学 报 第 38卷


外显子上各存在一个单核苷酸突变(A156→G, G375→C), 且第
125位的氨基酸残基发生突变(GAG→GAC, E→D) (图 3-B)。
2.2 GmMYB序列的生物信息学分析
利用 MEGA程序将拟南芥 R2R3-MYB基因家族中参
与非生物胁迫调控的 23个MYB基因, 其他物种和栽培大
豆的R2R3-MYB基因各 7个进行保守区结构域氨基酸比对,
相似度达 68.60%。利用蛋白质序列构建系统发生树(图 4),
这些 R2R3-MYB蛋白可分为 3个主要的分支, 其中本研究

图 4 GmMYB与其他植物 MYB蛋白的系统发生树
Fig. 4 Phylogenetic tree analysis of GmMYB and MYBs from other plants
多种植物的 MYB系统发生树用 MEGA(Ver.4.0)程序构建, 分支上的数字表示 Bootstrap验证中该树枝可信度的百分比。
The phylogenetic tree is constructed by the MEGA (Ver. 4.0). The number at the cluster nodes is percentage of homology among MYB verified by
bootstrap. Accessions are as follows: Arabidopsis thaliana (AtMYB2, At2g47190; AtMYB4, At4g38620; AtMYB8, At4g09460; AtMYB12, At2g47460;
AtMYB15, At3g23250; AtMYB21, At3g27810; AtMYB30, At3g28910; AtMYB32, At4g34990; AtMYB34, At5g60890; AtMYB41, At4g28110; AtMYB44,
At5g67300; AtMYB51, At1g18570; AtMYB52, At1g17950; AtMYB60, At1g08810; AtMYB61, At1g09540; AtMYB68, At5g65790; AtMYB73, At4g37260;
AtMYB74, At4g05100; AtMYB77, At3g50060; AtMYB94, At3g47600; AtMYB96, At5g62470; AtMYB102, At4g21440; AtMYB108, At3g06490), Zea may
(ZmMYBC1, X06333), Antirrhinum majus (AmMYBMIXTA, X79108; AmMYBPHAN, AJ005586), Hordeum vulgare (HvMYBGA, X87690), Nicotiana
tabacum (NtMYB1, U72762), Petunia×hybrida (PhMYBAn2, AF146702), Lotus japonicus (LjMYB101, AB108648), Glycine max (GmMYB92,
DQ822903; GmMYB101, AB108651; GmMYBJ6, DQ902863).
第 2期 孙 霞等: 非生物胁迫诱导的 GmMYB基因克隆与表达分析 365


中的 GmMYB 与拟南芥中参与抗逆的 AtMYB2、AtMYB21
和 AtMYB108 蛋白距离较近, 共同组成一个分支, 亲缘关
系最近, 与其他抗逆的 AtMYB 蛋白距离较远, 这可能与
MYB在逆境胁迫中的功能多样性相关。
2.3 非生物胁迫条件下大豆芽期 GmMYB基因的表达分析
在干旱、盐、碱和低温等非生物胁迫条件下, 栽培大
豆东农 42胚中GmMYB上调表达的最大强度为(图 5-A~D)
干旱>盐>碱>低温 ; Gm02g01300 明显受干旱强烈诱导 ,
胁迫处理 2 h达到最大值(1.0756), Gm03g38040紧随其后,
最高值出现在干旱处理 2 h, 但比值仅约为前者的 1/2
(0.5272)(图 5-A); 而其他 3 种非生物胁迫下 Gm03g38040
的诱导表达水平均高于其余 GmMYB 基因(图 5-B~D); 干
旱、盐和碱胁迫条件下, GmMYB 基因受胁迫诱导呈现表
达上调的趋势 , 最大值明显高于初始值 , 而后呈现下降
趋势, 24 h接近初始值(图 5-A~C); 低温处理 4个MYB基
因的表达呈现“降-升-降”的不同趋势, 最大值仅接近或略
高于初始值(图 5-D)。
同一非生物胁迫处理条件下, R2R3-MYB基因的诱导
表达量存在明显差异。干旱处理后 GmMYB基因表达量最
大比值为 Gm02g01300>Gm03g38040>Gm10g01340>Gm19g-
40650; 低 温 后 为 Gm03g38040>Gm10g01340>Gm19g-
40650>Gm02g01300; 100 mmol L–1 NaCl 胁 迫 后 为
Gm03g38040>Gm10g01340>Gm02g01300>Gm19g40650;
0 mmol L–1 Na2CO3胁迫后为 Gm03g38040>Gm19g40650
>Gm02g01300>Gm10g01340, Gm02g01300 和 Gm03g38040
明显呈现双峰曲线, 但出峰时间存在差异, Gm02g01300
是在碱胁迫诱导后的 1 h和 6 h, 而 Gm03g38040是 2 h和
6 h。同一 R2R3-MYB基因在不同的非生物胁迫条件下, 基
因表达水平和达到最大值的时间也存在差异。从
Gm02g01300诱导表达的最大比值来看, 干旱>盐胁迫>碱
胁迫>低温, 出现最大值的时间依次为 2、1、1 和 0 h;
Gm03g38040和 Gm10g01340表达的最大比值均为盐胁迫
>干旱>碱胁迫>低温, 但 Gm03g38040 最大值出现时间依
次为 2、2、4 和 4 h, Gm10g01340 为 0.5、1、2 和 0 h;
Gm19g40650 的表达为碱胁迫>盐胁迫>干旱>低温, 时间
依次为 2、0.5、2和 6 h。

图 5 GmMYB在非生物胁迫下表达模式
Fig. 5 Expression profile of four GmMYBs induced by different abiotic stresses
A~D: 胚; E~H: 子叶; A和 E: 干旱; B和 F: 100 mmol L–1 NaCl; C和 G: 20 mmol L–1 Na2CO3; D和 H: 低温。
AD: embryos; EH: cotyledons; A and E: drought; B and F: 100 mmol L–1 NaCl; C and G: 20 mmol L–1 Na2CO3; D and H: low temperature.

在非生物胁迫条件下, 东农 42 子叶内 GmMYB 上调
表达的最大强度为(图 5-E~H)干旱、盐胁迫>碱胁迫>低温;
且 Gm02g01300 明显受干旱和盐胁迫诱导 (图 5-E~F),
Gm03g38040和 Gm10g01340在 20 mmol L1 Na2CO3胁迫
处理条件下大量诱导表达(图 5-G); 而低温处理后 MYB
基因的表达呈现复杂趋势 , 通过与对照比较发现 , 低温
下 R2R3-MYB 基因的表达量极低, 没有明显的诱导上调
或下调表达趋势(图 5-H)。同一非生物胁迫处理条件下,
GmMYB 基因的诱导表达量存在明显差异。干旱处理后
GmMYB 基因表达量最大比值为 Gm02g01300>Gm10g-
01340>Gm03g38040>Gm19g40650; 100 mmol L–1 NaCl胁
迫后为 Gm02g01300>Gm03g38040>Gm10g01340> Gm19g-
40650; 20 mmol L–1 Na2CO3胁迫后为 Gm03g38040> Gm10g-
01340>Gm02g01300>Gm19g40650, 且Gm19g40650在干旱、
盐和碱胁迫条件下表达都极低。同一 GmMYB基因在不同
的非生物胁迫条件下, 基因表达水平和达到最大值的时
间也存在差异。从 Gm02g01300诱导表达的最大比值来看,
盐胁迫>干旱>碱胁迫, 出现最大值的时间依次为 1、4 和
2 h; Gm03g38040表达的最大比值为碱胁迫>盐胁迫>干旱,
最大值出现时间为 2、1和 4 h; Gm10g01340的表达为碱
胁迫>盐胁迫>干旱, 时间依次为 1、1和 2 h。Gm19g40650
在 4 种非生物胁迫处理条件下均未表现出明显的上调或
366 作 物 学 报 第 38卷


下调趋势。
3 讨论
近年来, 转录因子诱导提高转基因植物抗非生物胁迫
的能力一直是国内外的研究热点[2,9-12,18-39], 对一些模式植
物(如拟南芥、水稻、番茄、烟草)的研究表明, 转录因子在
调节植物对非生物胁迫的防御过程中起着重要作用。MYB
基因作为植物体内最大的转录因子家族之一, 与植物抗逆
性密切相关, 可以通过控制相关 MYB 转录因子的表达而调
节植物的抗逆能力, 但有关大豆 MYB 基因在非生物胁迫过
程中的相关研究较少[3,14,41], 利用 qRT-PCR技术研究胁迫条
件下大豆MYB基因的表达模式还鲜见报道。
根据本研究室已获得的一段抗逆 EST 序列, 克隆了
4 个都是由 3 个外显子和 2 个内含子间隔构成的 GmMYB
基因。 Gm02g01300、 Gm03g38040、 Gm10g01340 和
Gm19g40650基因序列分别为 783、714、849和 783 bp, 编
码氨基酸残基数目(不含终止密码子)分别为 260、237、282
和 260。GmMYB 基因序列的 N-端均具有 R2 和 R3-MYB
结构域, C-端含有一个富含酸性氨基酸残基的转录激活区,
因此确定克隆的都是 R2R3-MYB基因。在一定程度上, 进
化树反应了功能的相关性[44]。4个 GmMYB基因的相似性
程度很高 , 系统发生树中 , 与参与抗逆的 AtMYB2、
AtMYB21 和 AtMYB108 蛋白距离较近 , 与其他抗逆的
AtMYB蛋白距离较远, 而且 4个 GmMYB基因在各种非生
物胁迫过程中的表达模式存在着很大差异 , 这可能与
MYB基因功能的复杂性密切相关。
在非生物胁迫条件下, Gm02g01300明显受干旱强烈
诱导 , 2 h 达到最大比值(1.0756), 紧随其后的 Gm03g-
38040 仅约为前者的 1/2(0.5272), 而 Gm03g38040 在多种
胁迫条件下的诱导表达水平均明显高于其他基因, 暗示
二者可能在大豆非生物胁迫的调控中起到重要作用。
植物感受到各种非生物胁迫后, 通过体内不同的途
径启动相关基因的表达[2], 其中 DREB1/CBF 参与的冷刺
激调控独立于其他胁迫应答机制, 这与本研究中 GmMYB
基因在 4种非生物胁迫条件下表达模式相一致。干旱、盐
和碱胁迫条件下, GmMYB基因被诱导呈表达上调的趋势,
最大值明显高于初始值, 而后呈下降趋势, 24 h是接近初
始值; 而低温处理时 MYB基因的表达呈无明显波动的趋
势 , 最大值仅接近或略高于初始值 , 说明植物对低温胁
迫的应答机制不同于前面 3种胁迫。
除低温外 , 干旱和盐碱胁迫都能诱导子叶中 4 个
GmMYB 基因表达水平的上调, 但表达数量和出现时间的
最大值要低于和晚于胚中, 这在一定程度上可以说明基
因表达具有组织特异性 , 大豆芽期受到非生物胁迫时 ,
胚中基因的调控作用可能更利于其抗逆性的提高。
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