全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 1904−1909 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室开放基金(ZW2009001), 国家转基因植物新品种培育重大专项(2009ZX08001-
010B)和国家自然科学基金项目(30870191)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘炜, E-mail: wheiliu@163.com, Tel: 0531-83179572
第一作者联系方式: E-mail: feixueliangxiao@163.com, Tel: 0531-83178133
Received(收稿日期): 2011-03-07; Accepted(接受日期): 2011-06-25; Published online(网络出版日期): 2011-07-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110728.1002.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01904
水稻种胚特异性启动子 OsESP1的克隆及其表达特性
房孝良 1,2,3 刘 炜 1,2,3,* 安 静 1 王庆国 1,2
1山东省农业科学院高新技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生物技术重点实验室, 山东济南 250100; 2农业部黄淮海作物遗传改良与生物
技术重点开放实验室, 山东济南 250100; 3山东师范大学生命科学学院, 山东济南 250014
摘 要: 以水稻品种“中花 11”基因组 DNA为模板, 通过 PCR的方法, 对水稻基因 OsESG1上游调控序列扩增, 获得
长度约为 1.4 kb 的特异性条带, 命名为 OsESP1。以 OsESP1 与带有 GUS 报告基因的植物表达载体连接, 经农杆菌
介导转化获得转基因水稻阳性植株。结合组织化学染色法, 检测 GUS 报告基因的表达特性, 结果表明, 由 OsESP1
所调控的 GUS 报告基因仅在水稻种胚中特异表达, 而在其他组织中均未被检测到, 初步证明 OsESP1 为水稻种胚特
异性启动子。
关键词: 水稻; 种胚特异性启动子; 表达特性分析; GUS报告基因
Isolation and Characterization of an Embryo-specific Promoter OsESP1 from
Rice
FANG Xiao-Liang1,2,3, LIU Wei1,2,3,*, AN Jing1, and WANG Qing-Guo1,2
1 High-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop Animal and Poultry
of Shandong Province, Jinan 250100, China; 2 Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and Biotechnology, Huanghuaihai, Ministry of Agricul-
ture, Jinan 250100, China; 3 College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China
Abstract: A pair of specific primers were designed according to the 5′ upstream regulatory sequence of rice gene OsESG1, and a 1.4
kb fragement named OsESP1 was amplified using rice (Oryza sativa L. cv. Zhonghua 11) genomic DNA as template by PCR.
OsESP1 was further fused with GUS reporter gene and transformed into rice callus through Agrobacterium-mediated transformation.
GUS activities in various tissues of transformed plants were examined and the GUS activity was detected only in rice embryo,
indicating the OsESP1 is an embryo-specific promoter.
Keywords: Rice; Embryo-specific promoter; Expression pattern analysis; GUS reporter gene
植物类受体蛋白激酶[1](receptor-like protein kinases,
RLKs)是一类重要的植物蛋白激酶, 它几乎参与了所有的
细胞代谢及调控过程, 包括组织形成和器官发生、发育调
控[2]、花粉自交不亲和[3]、胁迫响应[4]等。而作为基因表
达调控中的起始步骤, 基因上游启动子控制着基因在特
定组织、发育阶段以及环境条件下的表达。因而, 分离、
鉴定基因启动子, 了解启动子的时空专一性表达特征及
其作用机制已成为研究基因表达调控的主要内容, 获得
有组织专一性表达特性的启动子也是寻找相关功能基因
的一种有效途径。
前人以拟南芥为模式植物, 利用胚发育相关突变体
已分离和鉴定了一些胚特异性启动子[5]。近年来有关水稻
种子特异性或诱导型启动子的研究逐渐增多 [6], 但由于
目前已知的胚发育过程中特殊分子标记较少, 具有种胚
特异表达模式的功能基因报道的的也不多, 故对水稻种
子特异性启动子的研究仍主要集中在胚乳特异性启动子
上, 像谷蛋白基因启动子 [7], 醇溶蛋白基因启动子 [8], 球
蛋白基因启动子 [9]等 , 而对胚特异性启动子的研究及报
道较少。
水稻是世界上最重要的粮食作物之一 , 而研究其种
子贮藏蛋白表达调控和克隆种子特异性启动子是开展稻
米品质分子改良工作的基础。对水稻种胚特异性表达的启
动子的功能研究与鉴定, 将有利于实现外源基因在转基
因植物特定组织中高效表达。本实验室在前期研究中, 发
现并分离了水稻中一个编码类受体蛋白激酶的基因, 命
名为OsESG1, RT-PCR分析显示该基因特异地在水稻种胚
第 10期 房孝良等: 水稻种胚特异性启动子 OsESP1的克隆及其表达特性分析 1905


中表达(数据未发表), 为了深入解析该基因在水稻中的表
达特性及其生物学功能, 研究拟利用分子生物学方法结
合水稻数据库中公布的序列信息, 进一步分离并获得了
该基因上游转录调控序列, 以期进一步对该基因深入研
究及解析功能, 为水稻品质改良提供材料。
1 材料与方法
1.1 植物材料与菌种
水稻品种“中花 11”由本实验室提供。将水稻种子水
培萌发后于组培室生长 2周, 取水稻叶片用液氮速冻后于
–70℃保存, 用于水稻基因组 DNA的提取。
植物双元表达载体 pCAMBIA1381Z、大肠杆菌 (E.
coli)菌株 DH5α、根癌农杆菌 LBA4404均由本实验提供。
1.2 实验试剂
各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶、dNTP 和 T4
DNA 连接酶、T-vector 试剂盒和反转录试剂盒均购自
TaKaRa公司(辽宁大连); DNA Marker、质粒小提试剂盒、
胶回收试剂盒均购自 Transgen公司(山东济南雨同生物科
技有限公司); 组培中用到的乙酰丁香酮、潮霉素、头孢
霉素、2,4-D、谷氨酰胺等购自 Sigama 公司(山东济南盛
伟生物科技有限公司); 其余试剂为进口或国产分析纯。
由上海生工生物工程有限公司合成引物, 由山东省农业
科学院高新技术研究中心测序。
1.3 水稻基因组 DNA的提取
参照CTAB法[10], 以水稻 2周龄幼叶提取基因组DNA。
取 4 μL DNA样品, 以琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。
1.4 启动子 OsESP1的克隆与序列分析、载体构建
参照水稻数据库 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)列
出的水稻基因组序列, 结合基因 OsESG1 信息, 选取基因
上游约 1.4 kb 作为其转录调控序列, 根据该序列设计特
异性引物 , 上游引物为 5′-CGGGATCCTATGGAATTAC
AAGGACAGC-3′ (下画线显示添加的 BamH I酶切位点);
下游引物为 5′-AACTGCAGAGAGGGCAGAGAAAGAA
TGC-3′ (下画线显示添加的 Pst I酶切位点), 以水稻基因
组 DNA为模板, 经 PCR扩增, 获得启动子 OsESP1片段。
PCR反应步骤如下 95 5 min; ℃ 之后 95 1 min℃ 、58 1.5 ℃
min、72 45 s℃ 、共 35个循环; 最后 72 10 min℃ 。PCR
产物通过序列同源性比对结合基因顺式调控元件数据库
PLACE [14](http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)分析, 对其
中的转录调控元件作进一步解析。
同时, 将 PCR获得的启动子OsESP1片段与植物表达
载体 pCAMBIA1381Z分别用 BamH I和 Pst I进行双酶切
后连接, 获得重组质粒, 命名为 pCAMBIA1381Z-OsESP1
(图 1), 并测序验证。

图 1 植物双元表达载体 pCAMBIA1381Z-OsESP1的 T-DNA区简图
Fig. 1 Schematic map of T-DNA region of binary vector of pCAMBIA1381Z-OsESP1

1.5 水稻遗传转化
将构建好的植物表达载体 pCAMBIA1381Z-OsESP1
经液氮冻融法[11]导入根癌农杆菌菌株 LBA4404感受态细
胞中, 参照刘巧泉等 [12]的方法对水稻愈伤组织进行遗传
转化, 经共培养及抗性筛选, 最终获得转基因抗性植株。
1.6 转基因植株的 PCR检测
取抗性筛选获得的再生水稻的幼叶叶片, 按照 1.3的
方法提取基因组 DNA, 应用启动子 OsESP1 上游引物及
GUS 报告基因的下游引物 5′-AGACTTCGCGCTGATACC
AG-3′进行 PCR扩增, 检测、鉴定经 40 mg L−1潮霉素抗
性筛选获得的后代植株中是否转入 pCAMBIA1381Z-
OsESP1重组质粒。以 T1代阳性植株为材料, 对所收获的
T2代种子进行 GUS组织化学染色, 分析其表达模式。
1.7 GUS组织化学染色
按照 Jefferson[13]的方法进行 GUS 组织化学染色分
析。将截取的适合大小的水稻根、茎、叶、小穗、种子等
组织浸泡在预先配制好的 GUS染液里, 37℃保温、染色过
夜, 之后用 75%乙醇脱色至阴性对照为白色, 于体视显微
镜(LEICA S-系列)下观察染色结果, 照相并记录。
2 结果与分析
2.1 启动子 OsESP1片段的克隆
以水稻“中花 11”基因组 DNA 为模板, 经 OsESP1 特
异性引物扩增, 获得约 1.4 kb的条带(图 2), 经测序, 证明
所获产物为目的片段。

图 2 启动子 OsESP1 PCR扩增
Fig. 2 PCR amplification of the promoter OsESP1
M: 2 kb plus DNA marker; 1, 2: OsESP1的 PCR产物; 3: 阴性对照。
M: 2 kb plus DNA marker; 1, 2: PCR product of OsESP1; 3: negative
control
1906 作 物 学 报 第 37卷

2.2 启动子 OsESP1片段的生物信息学分析
应用 PLACE网站上的植物基因顺式调控元件分析数
据库[14], 对所克隆的 OsESP1 序列(图 3)进行分析, 结果
显示这段调控序列中除包含典型的具有转录起始功能的
TATA 盒、CAAT 盒外, 还存在多种与种子发育相关的调
控元件(表 1)。如在起始密码上游的不同位置多次出现和
可通过增强启动子的转录效率来调节下游基因表达的
CAAT[15]盒及 GATA 盒[16]; 及作为 WRKY 蛋白所特异识
别的 DNA序列W盒, 其存在可参与植物许多抗病及生长
发育调节过程 [17]; 位于基因读码框上游这段序列中还存
在大量不同种类的、在种子、胚及胚乳发育中起关键调控
作用的顺式作用元件, 如胚、胚乳和种子发育及胚特异性
启动子表达调控所必须的 CANBNNAPA元件[18]; bZIP转
录因子家族, 与胚特异性表达密切相关并调节晚期胚胎
发育[19]的 DPBFCOREDCDC3 元件; 增强胚乳的特异性
表达、与种子发育密切相关、或在调节花粉特异性表达中
起作用的−300ELEMENT 序列元件 [20]、YMOTIFOSRA-
MY3D元件[21]、POLLEN1LELAT 52元件[22]等。同时, 序
列中还存在 CEREGLU 元件, 能够在调节组织特异性表
达方面发挥作用[23]。以上分析表明, 启动子片段 OsESP1
可以启动外源基因在种子中特异性表达。
2.3 转基因植株的 GUS组织化学染色
对 T1 代阳性转基因水稻植株, 待收获其种子后, 经
潮霉素筛选获得的抗性苗, 以之为材料, 取水稻根、茎、
叶、小穗、及收获的种子进行 GUS 组织化学染色, 结合
启动子片段中所包含的不同顺式作用元件的种类及功能,
分析其表达特性。
染色结果显示, 经 GUS 染色后, 阴性对照的幼苗及
种子、胚及胚乳部位均未观察到显示 GUS活力的蓝色(图
4-A), 仅在转基因水稻种胚处观察到有代表 GUS 活性的
蓝色(图 4-B, C), 而在不同生长时期转基因水稻幼苗的
根、茎、叶、小穗和种子胚乳部位, 均未观察到显示 GUS
活力的蓝色(图 4-D, E), 说明带有GUS报告基因的启动子
OsESP1 在这些组织中均没有启动功能; 将种子纵切及

图 3 长度为 1 439 bp的启动子 OsESP1序列及其中所包含的可能的调控元件
Fig. 3 1 439 bp OsESP1 promoter sequence and the putative cis-elements
启动子中可能的顺式作用元件用方框及下画线标出。
The putative cis-elements of the promoter are indicated by box and underline.
第 10期 房孝良等: 水稻种胚特异性启动子 OsESP1的克隆及其表达特性 1907


表 1 启动子 OsESP1中存在的与种子发育相关的顺式作用元件
Table 1 cis-elements related to seed development in the promoter of OsESP1
顺式作用元件
cis-element
DNA序列
DNA sequence
出现次数
Frequency
位于起始密码 ATG上游位置
To start codon ATG
生物学功能
Biological function
CAAT BOX CAAT 10 204, 222, 257, 396, 540, 691, 704, 884, 1078, 1205
调控下游基因的转录起始及频
率、增强转录效率
GATA BOX GATA 8 174, 313, 444, 930, 997, 1196, 1314, 1388, 1401 调节光信号诱导的转录调控
POLLEN1LELAT52 AGAAA 6 583, 587, 591, 949, 1318, 1405 种子特异性表达所需元件
W BOX TGAC 5 497, 710, 818, 1039, 1054 参与植物抗病及生长发育调节
CANBNNAPA CNAACAC 2 137, 1102 与胚特异性表达相关
−300ELEMENT TATTCT 2 957, 1155 增强胚乳的特异性表达
CEREGLUBOX2 TGAAAACT 1 1148 组织特异性启动子活性调节
YMOTIFOSRAMY3D TATCCA 1 1221 参与种子转录调控
DPBFCOREDCDC3 ACACNNG 1 140 调节晚期胚胎发育


图 4 水稻种子纵切后及幼苗、胚根的 GUS组织化学染色
Fig. 4 GUS staining of the longitudinal cutted seeds, seedling and
embryo root of rice
A: 阴性对照; B, C: 转基因水稻种子; D: 转基因水稻幼苗; E: 转基
因水稻胚根。
A: negative control; B, C: seeds of transgenic plants; D: seedling of
transgenic plants; E: embryo root of transgenic plants.

GUS 染色后, 显示 GUS 活力的蓝色在胚处更加明显, 而
在胚乳处未见蓝色出现(图 4-B, C), 说明带有GUS报告基
因的启动子 OsESP1只在水稻种胚中具有启动功能, 故为
水稻种胚特异性表达的启动子。
3 讨论
组织特异性启动子也称器官特异性启动子 , 该类启
动子所调控的下游基因往往只在某些特定的器官或组织
部位表达 , 并表现出发育调节的特性。例如烟草的花粉
绒毡层细胞中特异表达基因启动子TA29, 豌豆的豆清蛋
白 (leguimin)基因启动子LeB4可在转化植物种子中特异
表达, 马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)基因启动子B33在块
茎中优势表达。目前, 为了使外源基因在植物体内有利、
高效地发挥作用, 人们开始越来越多地研究组织特异性
启动子、分析特异启动子中的顺势作用元件及作用机制,
并根据需要选择或人工构建合适的启动子, 实现对外源
基因表达的定时、定点、定量三维精确调控。例如, 组织
特异性启动子在植物育种、植物生物反应器等研究的应用
上已初见成效[24]。虽然前期研究取得了一定成果 , 但关
于植物种胚特异表达启动子的克隆还比较少。Maren等[25]
对拟南芥中FAE1基因及其启动子的表达特性研究表明 ,
FAE1的启动子仅在胚中表达, 是一个胚特异表达启动子;
Kuwano等 [26]研究证实水稻Ole18基因的启动子驱动相关
基因在种子种胚中特异表达。Wu等[27]通过对水稻中不同
贮藏蛋白相关基因的表达模式分析, 从中鉴定了一个在
水稻种胚中表达强度较高的水稻球蛋白启动子Glb。
Hwang等[28]把水稻球蛋白启动子Glb应用于人的溶菌酶基
因在水稻种胚的特异表达调控研究中, 并通过构建5′系列
缺失载体对水稻球蛋白启动子Glb中调控其表达特异性的
区段及元件进行了鉴定。Matilde等[29]将已知在玉米未成
熟胚中表达的基因zmHyPRP的启动子应用于玉米及烟草
的转化, 获得了产物具有种胚表达特异性的植株。利用大
麦中种胚特异性启动子Dhn12、Itr1及Ltp1分别与小麦中
参与花青素合成的基因C1和B-peru融合 , 获得的转基因
植株仅在胚中检测到表达产物 , 且启动子Ltp1在种胚中
的启动水平最高[30-31]。Kim等[32]在对水稻愈伤的蛋白质组
学分析过程中 , 分离到一系列受ABA诱导的蛋白质 , 对
其中一编码基因1Cys-Prx上游调控序列分析显示 , 其包
含种子特异性的顺式调控元件, 在水稻种胚及糊粉层中,
其活力水平较之前所报道的种胚特异表达启动子都要高,
且表达水平受ABA及损伤诱导, 且在拟南芥等双子叶植
物中也可应用。本研究成功克隆到1个在水稻种胚中特异
表达的启动子OsESP1, OsESP1-GUS转基因水稻植株仅在
种胚中检测到GUS活力 , 该启动子的鉴定为进一步深入
研究其下游基因OsESG的表达调控及功能提供了线索和
试验依据。
通过 PLACE 网站, 进一步对 OsESP1 中所包含的顺
式作用元件进行生物信息学分析。结果显示, 在该区域中
包含大量与种子发育及种胚形态建成、功能行使相关的特
征元件 , 其中包括十多个能够增强启动子转录效率的
CAAT盒、GATA盒, 7个与植物抗病及生长发育过程相关
的W盒, 以及与胚特异表达密切相关的 CANBNNAPA元
件和与胚乳特异表达密切相关的−300ELEMENT元件等。
进一步分析显示该启动子中还包括了可能对 ABA和干旱
等因子产生响应的元件, 具有多重因子的诱导活性。下一
步将结合这些线索, 对 OsESP1启动子在非生物胁迫下的
表达特征及强度做进一步研究。
同时 , 鉴于启动子缺失分析是分析启动子功能及其
1908 作 物 学 报 第 37卷

中关键调控元件的重要手段之一, 以往研究中被成功用
来确定启动子中响应特殊发育及环境信号的顺式作用元
件的位置和序列[33]。故根据启动子中与种子发育相关的
顺式作用元件的数量与其分布的位置 , 我们已构建了
OsESP1 启动子的系列缺失载体, 正通过水稻转化, 期望
获得相应的转基因植株, 为进一步对影响 OsESP1启动子
活性及功能的顺式作用元件作深入、细致的分析奠定基
础。同时, 拟将该启动子与 GUS 所构建的植物双元表达
载体转化拟南芥, 分析其在双子叶植物中表达模式及驱
动能力。从而鉴定影响在种胚中特异表达的关键调控顺式
作用元件 , 解析其转录调控的分子机制 , 最终应用于农
业生产。
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Chinese with English abstract)





欢迎订阅 2012年《杂交水稻》
《杂交水稻》是由国家杂交水稻工程技术研究中心和湖南杂交水稻研究中心主办的、对国内外公开发
行的专业技术刊物, 刊号: ISSN 1005-3956, CN 43-1137/S。获第二届国家期刊奖提名奖, 为全国中文核心期
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用中的最新成果、进展、动态、技术经验和信息等。辟有专题与综述、选育选配、栽培技术、繁殖制种、
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《杂交水稻》为双月刊, 大 16开本, 每期 96页, 逢单月出版, 每期定价 8.0元, 年价 48元。订阅办法：
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