全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(5): 820−831 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由浙江省科学技术厅项目(2008C22069)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张国平, E-mail: zhanggp@zju.edu.cn
Received(收稿日期): 2010-10-22; Accepted(接受日期): 2011-01-06.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00820
高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因型和生育期差异
周伟辉 1 薛大伟 2 张国平 1,*
1浙江大学农业与生物技术学院, 浙江杭州 310029; 2杭州师范大学生命与环境科学学院, 浙江杭州 310036
摘 要: 高温已经成为水稻产量的主要限制因素, 且其影响由于全球温室效应的加剧而呈扩大趋势。本研究在鉴定
耐热水稻基因型的基础上, 从生理学和蛋白质组学上进行耐性机制研究。结果表明, 苗期或抽穗期高温处理导致结实
率、SPAD值、株高、根长和生物量下降, 丙二醛、过氧化氢、超氧阴离子含量增加和超氧化物歧化酶活性提高。同
时, 高温胁迫对热敏感品种明恢 63的影响大于对耐热品种密阳 46的影响。蛋白质组学分析表明, 高温使光合作用相
关蛋白、能量类蛋白、代谢类蛋白表达量下降, 抗逆相关蛋白表达量上升。另外, 蛋白试验结果佐证了密阳 46 的耐
热性以及水稻抽穗期对高温的敏感性。本研究还首次发现抗逆相关蛋白 2-cys过氧化物酶 BAS1的表达量在高温下上
升。
关键词: 水稻; 高温; 耐热性; 基因型; 蛋白质组学
Protein Response of Rice Leaves to High Temperature Stress and Its Difference
of Genotypes at Different Growth Stage
ZHOU Wei-Hui1, XUE Da-Wei2, and ZHANG Guo-Ping1,*
1 Department of Agronomy, College of Agriculture and Biotechnology, Huajiachi Campus, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China; 2 College
of Life and Environment Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China
Abstract: High temperature has become a major disastrous factor affecting rice productivity, and the temperature stress becomes
more severe due to the global warming effect. The present study was carried out to identify the rice genotypes with high heat tole-
rance and understand the tolerant mechanisms of both physiology and proteomics. The results showed that seed setting rate, SPAD
value, plant height, root length and biomass were dramatically reduced under high temperature, while contents of malondialde-
hyde, hydrogen peroxide and superoxide anions, and activity of superoxide dismutase were greatly increased, irrespectively of
growth stage. Moreover, Minghui 63 (a heat-sensitive genotype) was much more affected by heat stress than Milyang 46 (a
heat-tolerant genotype). Proteomic analysis showed that high temperature resulted in down-regulation of the proteins related to
photosynthesis, energy and metabolism, while resistance-related proteins were up-regulated. The results also confirmed the heat
tolerance of Milyang 46 and the heat sensitivity of the rice plants at heading stage. The up-regulation of anti-stress protein, 2-cys
peroxiredoxin BAS1, under heat stress was first reported in this study.
Keywords: Rice; High temperature; Thermo-tolerance; Genotype; Proteomics
蛋白质组(proteome)一词由澳大利亚科学家提
出, 源于蛋白质(protein)与基因组(genome)两个词的
组合, 意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”[1]。蛋
白质组学为在蛋白质水平上研究生物体、细胞、器
官和组织, 以及分析比较不同生理条件下的蛋白质
表达等提供了一套有力的工具和方法。双向电泳
(two dimensional gel electrophoresis, 2-DE)技术与质
谱技术的结合, 能快速鉴定蛋白质以及提供蛋白表
达量的变化和翻译后修饰(post-translation modifica-
tion, PTM)等信息, 可信度高。蛋白质组学技术已有
效地应用于分析非生物因子胁迫下植物的蛋白响应
过程, 包括热害、冷害、干旱胁迫、氧化胁迫、盐
害和重金属毒害等[2-8]。
Salekdeh等[9]研究了 2个水稻品种在干旱胁迫
第 5期 周伟辉等: 高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因型和生育期差异 821


下以及恢复灌溉后叶片的蛋白质组, 发现有 42个蛋
白点的丰度在干旱胁迫状态下变化明显, 其中 27个
点在 2个品种中显示不同的反应方式; 恢复正常灌
溉 10 d后, 所有蛋白的丰度完全或基本恢复到对照
水平。Imin等[10]用蛋白质组学的方法研究了低温胁
迫对水稻花粉发育早期花粉囊成熟的影响。通过
2-DE分离和银染检测, 发现 70个蛋白质在低温处
理之后发生了变化, 其中 1 个为低温诱导新产生的,
47个为低温上调蛋白质, 另外 11个为低温下调蛋白
质。臭氧及盐胁迫等对水稻的影响也已在蛋白质组
学水平上得到揭示[11-13]。
高温已经成为水稻产量的主要限制因素, 且其
影响由于全球温室效应的加剧而呈扩大趋势[14-15]。
在蛋白质水平上研究高温胁迫下水稻基因的表达调
控机制, 可以更直接地找出与高温胁迫相关的基因
群, 揭示水稻的高温伤害和耐性机制。Lee等[16]研究
了高温 (42 )℃ 胁迫下水稻幼苗叶片蛋白质组变化 ,
利用 2-DE 和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱
(MALDI-TOF-MS)技术 , 成功鉴定到 48 个蛋白质,
其中包括热激蛋白、能量与代谢相关蛋白、氧化还
原相关蛋白和调控相关蛋白等。另外, 还发现了一
些低分子量的小分子热激蛋白 (sHSPs)。Han等[17]
对遭受 48 h高温(35℃、40℃和 45 )℃ 的水稻幼苗叶
片进行了蛋白质组学分析, 发现高温下蛋白质无论
在种类上和表达量上都有很大的变化, 且温度越高,
水稻植株内形成的保护机制越多。一些维持光合作
用能力的保护类蛋白在 35℃下被激活, 抗氧化相关
蛋白在 40℃下被激活, 而热激蛋白在 45℃下才被激
活发挥作用。
Satake 等[18]认为, 水稻高温伤害主要发生在开
花期, 此时高温影响授粉受精过程。减数分裂期(抽
穗前 9~15 d)是水稻高温伤害的次敏感期, 此时高温
主要影响花粉发育。水稻在孕穗、抽穗期对温度极
为敏感(即抽穗前后各 10 d), 最适宜的温度为 25~
30 , ℃ 日平均温度 30℃以上对水稻生理活动会产生
不利影响。Jagadish等 [19]对水稻开花期高温胁迫下
的花药进行蛋白质组学分析, 发现 46个差异表达蛋
白, 用质谱法鉴定了 13 个。Lin 等[20]研究高温对水
稻颖果发育的影响, 发现 70 个差异表达的蛋白, 用
液相色谱/串联质谱法确定了 54 个, 其中 21 个参与
碳水化合物代谢, 14个参与蛋白质的合成与分解, 9
个是胁迫响应基因, 其中蜡质蛋白、过敏原类蛋白
和蛋白延伸因子在高温下下调 , 而小分子热激蛋
白、3-磷酸甘油醛脱氢酶及醇溶蛋白上调。
本研究旨在通过高温胁迫对水稻叶片蛋白质种
类和表达量的影响, 明确不同耐热性水稻品种和不
同生育期在蛋白响应上的差异, 从而为揭示水稻的
高温伤害和耐性机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
依据前期研究结果 , 选择耐热性水稻品种“密
阳 46”(Oryza sativa L. spp. indica)和热敏感品种“明
恢 63”(Oryza sativa L. spp. indica)为供试材料。根据
前人水稻高温试验结果, 确定本试验的高温处理温
度[16-17,19]。试验在浙江大学华家池校区实验农场进
行。水稻种子经浸种、催芽后, 播于盛有过筛细土
的塑料育苗盘内, 放在温室。
(1) 试验 I: 播种 7 d 后从中选取生长一致的幼
苗以水培方式种在 50 mL离心管中, 每管 2株。依
据 Yoshida等[21]的介绍配营养液。培养 7 d后进行处
理, 高温处理为白天 43℃ (14 h)、黑夜 30℃ (10 h),
相对湿度为 75%; 对照组为白天 30℃ (14 h)、黑夜
25℃ (10 h), 相对湿度 75%。各处理重复 3次, 处理
3 d后, 测定叶绿素相对含量(SPAD值)、株高、根长、
地上部鲜重、根鲜重、地上部干重和根干重; 选取
第 1 片完全展开叶测定丙二醛(MDA)含量、过氧化
氢(H2O2)和超氧阴离子(O2܋ )含量、超氧化物歧化酶
(SOD)和过氧化物酶(POD)活性; 同时选取第 1 片完
全展开叶进行蛋白质组学分析。
(2) 试验 II: 播种 7 d后选取生长一致的幼苗移
栽至网室。抽穗时, 选择生长发育进程基本一致的
植株移栽于 5 L塑料桶中, 置人工气候箱中处理, 随
机排列基因型, 且每天重新排列, 以消除位置引起
的误差。高温处理为白天 40℃ (14 h)、黑夜 35℃ (10
h), 相对湿度为 75%; 对照组设置为白天 30℃ (14
h)、黑夜 22℃ (10 h), 相对湿度 75%。处理 3 d后, 从
人工气候箱中移出植株, 放回自然条件下生长, 直
至成熟。为防止过分拥挤, 保证其正常生长, 并使单
株抽穗开花时间相对集中, 去除一些分蘖, 使每株
只保留 3 个最大的分蘖。成熟后记录各基因型不同
处理植株的单穗结实率。处理结束时, 测定剑叶的
SPAD值、MDA含量、H2O2和 O2܋含量、SOD和 POD
活性; 同时, 取剑叶作为蛋白质组学分析样本。
1.2 植株生长性状考察
选水稻幼苗上部第 1 片完全展开叶和抽穗期植
822 作 物 学 报 第 37卷

株剑叶, 用叶绿素仪(Minolta SPAD-502, Japan)测定
SPAD 值。苗期处理时, 收获各品种不同处理幼苗,
蒸馏水冲洗后, 拭干, 测定株高、根长和鲜重。将测
完鲜重的样品置于烘箱中 105℃杀青 2 h, 70℃烘 48
h, 测定干重。
1.3 生理指标测定方法
按许长成等[22]的方法测定 MDA 含量。按阮海
华等[23]的方法测定 SOD 和 POD 活性。按 Lin 和
Kao[24]的方法测定 H2O2含量。按 Li 等[25]的方法测
定 O2܋含量。
1.4 蛋白质组学分析
1.4.1 蛋白质提取 按王经源等 [26]的 TCA-丙酮
沉淀法进行。用 Bradford 法测定蛋白质含量后, 用
作电泳样品。
1.4.2 双向电泳与凝胶成像 参考余初浪等 [27]
的方法, 并做少量修改。第一等电聚焦(IEF)采用 24
cm pH 3~10 IPG胶条。吸取含 150 μg蛋白的样品溶
液, 加入溶胀液至 250 μL。20℃下 500 V l h, 1 000 V
l h, 4 000 V l h, 8 000 V l h, 50 000 V 1 h, 500 V足够
长时间。第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的
分离胶浓度为 12%, 1 mm厚度, 不用浓缩胶。参照
Yan 等[28]的方法进行银染。用 Umax PowerLook 扫
描仪扫描凝胶图像 , 构建蛋白质表达图谱 ; Image
Master 5.0 软件分析凝胶图像。参考 Neuhoff 等[29]
的方法将制备胶用考马斯亮蓝染色法染色。
1.4.3 质谱分析与数据库检索 采用美国ABI公
司的 MALDI-TOF-MS 质谱仪(ABI 4800 型)进行质
谱分析, 获得肽指纹图谱(PMF), 用 MASCOT 软件
检索查询。选用 NCBI 数据库; 物种 viridiplantae
(green plants); 用 Trypsin 酶解; 最大未水解酶切位
点数(max missed cleavages), 选择 1; 固定修饰, 选
择 Carbamidomethyl (C); 可变修饰, 选择 Oxidation
(M); 可接受的肽段分子量误差为 0.3 Da。
1.5 数据分析
采用 SAS 9.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)
进行所有生理学数据的方差分析和基因型间显著性
(P<0.05)检验。耐热系数 (heat-tolerant coefficient,
HTC, %)=(高温处理株系的结实率/相应株系的自然
结实率)×100%。
2 结果与分析
2.1 高温对水稻生长性状的影响
高温处理抑制水稻幼苗生长, 表现为两品种的
SPAD 值、株高、根长和生物量下降。敏感品种明
恢 63的下降程度大于耐热品种密阳 46 (表 1)。除密
阳 46的 SPAD值和根长外, 其余所有参数下降均达
显著水平(P<0.05)。与对照相比 , 明恢 63的 SPAD
值、株高、根长、地上部鲜重、根鲜重、地上部干
重和根干重分别下降 11.8%、28.4%、18.8%、58.3%、
64.6%、53.5%和 62.5%; 相应地, 密阳 46 以上参数
分别下降 0.3%、20.9%、1.0%、31.2%、32.7%、18.1%
和 26.7%。

表 1 高温胁迫对水稻幼苗 SPAD值及生长性状的影响
Table 1 Effect of high temperature stress on SPAD value and growth traits of two-week old rice seedlings
品种
Variety
处理
Treat.
SPAD值
SPAD value
株高
PH (cm)
根长
RL (cm)
地上部鲜重
SFW (g)
根鲜重
RFW (g)
地上部干重
SDW (g)
根干重
RDW (g)
常温 NT 33.1±0.06 a 30.3±0.36 a 6.4±0.06 b 0.516±0.047 a 0.223±0.020 a 0.101±0.011 a 0.024±0.003 a明恢 63
Minghui 63 高温 HT 29.2±0.15 b 21.7±0.56 c 5.2±0.21 c 0.215±0.026 c 0.079±0.009 c 0.047±0.005 c 0.009±0.001 c
常温 NT 30.5±1.22 b 25.3±0.49 b 7.0±0.15 a 0.375±0.012 b 0.162±0.013 b 0.072±0.003 b 0.015±0.002 b密阳 46
Milyang 46 高温 HT 30.4±0.56 b 20.0±0.75 d 6.9±0.10 a 0.258±0.020 c 0.109±0.022 c 0.059±0.005 c 0.011±0.003 c
所有数据均为 3个重复的平均值。不同字母代表 4个区组间的显著性差异(P<0.05)。
Data were means of three independent replications. Values within a column followed by different letters are significant by different
(P<0.05) among the four blocks. NT: normal temperature; HT: high temperature; PH: plant height; RL: root length; SFW: shoot fresh weight;
RFW: root fresh weight; SDW: shoot dry weight; REW: root dry weight.

抽穗期高温处理的剑叶 SPAD值, 明恢 63显著
下降, 而密阳 46 变化较小(表 2)。高温胁迫对结实
率的影响也因品种而异, 明恢 63的结实率从对照的
86.4%下降到处理的 5.9%, 密阳 46 则从 79.4%下降
到 19.2%, 下降程度明显较轻。从图 1 还可以看出,
高温胁迫后密阳 46有较多正常灌浆的籽粒。
2.2 高温对 MDA、H2O2和 O2܋含量的影响
如图 2所示, 高温胁迫增加叶片MDA含量, 且
增加程度因品种而异, 敏感品种明恢 63 增加较多,
苗期和抽穗期分别比对照增加 48.7%和 20.8%; 而
耐热品种密阳 46仅分别增加 3.2%和 11.3%。
高温胁迫显著增加水稻幼苗叶片的 H2O2 含量
第 5期 周伟辉等: 高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因型和生育期差异 823


表 2 高温胁迫对水稻结实率、SPAD值及耐热系数的影响
Table 2 Effect of high temperature on SPAD value, seed setting rate, and heat-tolerant coefficient
品种
Variety
处理
Treatment
SPAD值
SPAD value
结实率
Seed setting rate (%)
耐热系数
Heat-tolerant coefficient (%)
明恢 63 Minghui 63 常温 Normal temperature 47.8±0.42 b 86.4±0.70 a
高温 High temperature 45.3±0.82 c 5.9±1.01 d 6.8 b
密阳 46 Milyang 46 常温 Normal temperature 49.9±0.10 a 79.4±1.20 b
高温 High temperature 50.1±0.17 a 19.2±3.89 c 24.1 a
所有数据均为 3个重复的平均值。不同字母代表 4个区组间的显著性差异(P<0.05)。
Data were means of three independent replications. Different letters indicate significant differences (P<0.05) among the 4 blocks and
refer to each subset of data.

图 1 不同温度处理下明恢 63和密阳 46的结实情况
Fig. 1 Floret fertility and fulfillment of Minghui 63 and Milyang 46 under different temperature treatments
左侧小穗为高温处理; 右侧小穗为常温处理; 红圈表示发育正常的颖花。
The left panicle was under high temperature treatment, and the right panicle under normal condition. The red circle demonstrates nor-
mally-developed florets.

(P<0.05)(图 2-C), 其中明恢 63比对照增加了 57.0%,
而密阳 46 增加了 52.5%。在抽穗期, 高温胁迫使明
恢 63 叶片的 H2O2含量比对照增加 23.2%, 而密阳
46的 H2O2含量未见显著性变化。
高温胁迫也增加叶片的 O2܋含量(图 2-E), 且增
加程度亦因品种而异。明恢 63均表现显著增加, 苗
期和抽穗期分别增加 47.6%和 65.8%。而密阳 46的
O2܋含量, 在苗期高温胁迫处理与对照无显著差异;
在抽穗期增加 38.3%, 增幅小于敏感品种。
2.3 高温对 SOD和 POD活性的影响
如图 2 所示, 高温胁迫增加叶片的 SOD 活性,
且增加程度因品种而异, 表现为耐热品种密阳 46增
加更多。与对照相比, 密阳 46 幼苗叶片的 SOD 活
性增加 13.6%, 抽穗期增加 9.8%; 而明恢 63在苗期
和抽穗期分别增加 7.7%和 4.1%, 与对照的差异不
显著。
高温处理对 POD 活性的影响不大(图 2-D)。如
抽穗期, 明恢 63 的 POD 活性(15.6 nmol min−1 g−1
FW)仅比对照(15.4 nmol min−1 g−1 FW)高 1.4%。另外,
无论是高温胁迫还是对照, 耐热水稻品种密阳 46的
POD活性均高于敏感品种明恢 63。
2.4 高温胁迫下水稻叶片蛋白质组的变化
为阐明水稻的高温伤害和耐性机制, 利用不同
温度处理下的水稻幼苗第 1 片完全展开叶和抽穗期
水稻剑叶, 进行了蛋白质组学分析。在每一块 2-DE
胶图上, 均检测到 1 000多个可重复的蛋白点。在高
温胁迫下, 有 50多个蛋白点至少在其中一个品种中
表达量发生了很大的变化。对其中的 35个蛋白点进
行了质谱鉴定, 鉴定到 24个, 分别标记为 1~24; 另
外 11 个蛋白点(编号为 25~35)在蛋白数据库中没有
明显的同源匹配蛋白, 未能成功鉴定(图 3)。与对照
相比, 高温下明恢 63 幼苗叶片的蛋白点中, 表达量
824 作 物 学 报 第 37卷


图 2 高温对不同水稻品种叶片 MDA、H2O2和 O2܋含量以及 SOD、POD活性的影响
Fig. 2 Effect of high temperature at seedling stage or heading stage on MDA content (A), activities of SOD (B), H2O2 content (C), O2
܋ content (D), and activities of POD (E) of different heat-tolerant rice genotypes
MH63: 明恢 63; MY46: 密阳 46; NT: 正常温度; HT: 高温。
MH63: Minghui 63; MY46: Milyang 46; NT: normal temperature; HT: high temperature. Base marked by different letters are significantly
different at P<0.05.

图 3 正常温度下生长的明恢 63幼苗叶片的双向凝胶电泳图谱
Fig. 3 2-DE gels of proteins extracted from the leaves of rice seedlings of MINGHUI 63 which grew under normal temperature
数字和箭头标注的即为质谱鉴定确定的 24个差异蛋白点和未成功鉴定的 11个蛋白点。
Twenty-four differentially accumulated protein spots that were identified by MS and 11 unidentified protein spots are numbered and indicated
by arrows.

上升的有 3个(点 3、点 11和点 24), 下降的有 10个
(点 1、点 7、点 8、点 10、点 12、点 14、点 16、点
18、点 20和点 22); 相应地, 密阳 46中表达量上升
的蛋白点有 3 个(点 5、点 20 和点 24), 下降的有 2
个(点 10 和点 13)。在抽穗期, 与对照相比, 高温下
明恢 63剑叶的蛋白质组中表达量上升的蛋白点有 3
个(点 3、点 23和点 24), 下降的有 10个(点 2、点 8、
点 9、点 12、点 15、点 16、点 17、点 19、点 20和
第 5期 周伟辉等: 高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因型和生育期差异 825


点 21); 而密阳 46表达量上升的有 7个(点 3、点 4、
点 5、点 13、点 20、点 23和点 24), 下降的有 6个(点
2、点 6、点 9、点 12、点 17和点 19)。
2.4.1 光合作用相关蛋白 由质谱鉴定和数据库
检索结果(表 3)可知, 点 9、点 14、点 15、点 16、
点 17、点 18、点 21和点 22都为 1,5-二磷酸核酮糖

表 3 质谱鉴定成功的蛋白点的信息
Table 3 Leaf proteins responsive to high-temperature stress identified by MALDI-TOF-MS
编号 1)
ID 1)
蛋白质名称
Protein name
理论
等电点 2)
H. pI 2)
理论
分子量 3)
H. Mw 3)
分数 4)
Score 4)
覆盖率 5)
SC 5)
(%)
匹配
肽段数 6)
PM 6)
登录号
Accession No.
物种
Species
1 20 kD伴侣蛋白
Os09g0438700 (20 kD chaperonin)
5.97 25.5 88 23 9 NP 001063270 Oryza sativa
2 ATP合成酶 α亚基
ATPase alpha subunit
5.95 55.1 70 20 17 AAM12499 Oryza sativa
3 Os04g0490800 (Haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing protein) 6.75 39.5 219 34 17 NP 001053167 Oryza sativa
4 2-cys 过氧化物酶 BAS1
Os02g0537700 (2-cys peroxiredoxin BAS1)
5.67 28.1 305 49 16 NP 001047050 Oryza sativa
5 Os01g0501800 (Photosystem II oxygen-evolving complex protein 1) 6.10 34.8 266 31 15 NP 001043134 Oryza sativa
6 放氧复合蛋白
Os07g0141400 (23 kD polypeptide of photosystem II)
8.66 26.9 190 46 16 NP 001058863 Oryza sativa
7 铁氧化蛋白-NADP(H)-氧化还原酶
Putative ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase
7.98 40.6 136 28 17 BAD07827 Oryza sativa
8 铁氧化蛋白-NADP(H)-氧化还原酶
Putative ferredoxin-NADP(H) oxidoreductase
7.98 40.6 227 48 25 BAD07827 Oryza sativa
9 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶
Rubisco
6.32 49.5 254 25 15 AAC35114 Neomoorea irrorata
10 ATP合成酶 CF1 α亚基
ATP synthase CF1 alpha subunit
5.95 55.6 472 53 33 NP 039380 Oryza sativa
11 Fd-谷氨酸合成酶
Putative ferredoxin-dependent glutamate synthase
6.42 174.6 93 14 39 BAD30339 Oryza sativa
12 ATP合成酶 CF1 α链
ATP synthase CF1 alpha chain
6.66 58.9 165 26 20 AAS46052 Oryza sativa
13 ATP合成酶 CF1 α亚基
ATP synthase CF1 alpha subunit
5.95 55.6 88 20 15 NP 039380 Oryza sativa
14 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基
Rubisco large subunit
6.13 50.5 179 32 19 AAB37133 Caryopteris bicolor
15 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基
Rubisco large subunit
6.45 46.2 75 25 15 BAD60963 Harperocal-lis flava
16 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基
ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit
9.40 19.6 160 48 11 AAB70543 Oryza sativa
17 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基
Rubisco large subunit
6.33 53.7 240 26 17 YP 654221 Oryza sativa
18 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶
Rubisco
6.32 49.5 383 26 19 AAC35114 Neomoorea irrorata
19
FAD-吡啶二硫化核苷酸氧化还原酶
Os01g0328700 (FAD-dependent pyridine nucleotide-
disulphide oxidoreductase domain containing protein)
7.21 52.6 295 41 27 NP 001042918 Oryza sativa
20
磷酸吡哆醛-转移酶
Os08g0502700 (pyridoxal phosphate-dependent trans-
ferase)
8.19 44.2 120 28 18 NP 001062170 Oryza sativa
21 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基
Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase, large subunit
6.33 51.1 197 29 19 BAA04194 Disporum sessile
22 1,5-二磷酸核酮糖羧化酶
Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase
6.32 49.6 193 28 19 AAK72540 Wolffia australiana
23 过氧化氢酶
Catalase
6.93 56.8 395 38 26 BAA34205 Oryza sativa
24 过氧化氢酶
Catalase
7.36 56.1 162 32 27 BAA34714 Oryza sativa
1) 斑点 ID (与图 3相对应); 2) 推断的等电点; 3) 推断的分子量; 4) 蛋白质分数; 5) 顺序覆盖率; 6) 匹配肽段数。
1) spot ID (corresponding to Fig. 3); 2) hypothetical isoelectrical point; 3) hypothetical molecular weight; 4) protein score; 5) sequence
coverage; 6) the number of peptides matched.
826 作 物 学 报 第 37卷

羧化酶/加氧酶(Rubisco)相关蛋白, 这类蛋白在高温
胁迫下表达量大幅度下降(图 4)。Rubisco 是存在于
绿色植物中的重要蛋白复合体, 是决定 C3植物光合
效率的关键酶, 具有同时参与光合 CO2固定及光呼
吸 CO2 释放的双重功能, 其活性与光合作用密切相
关[30]。Bose 和 Ghosh[31]研究证明, 40℃以上的高温
胁迫显著降低 Rubisco 亚基的活性和表达量。其他
一些试验也得到类似的结果[16-17]。
20 kD 伴侣蛋白(点 1)也与光合作用关系密切 ,
它在植物体内主要与 cpn60 家族协同作用 , 促进
Rubisco大小亚基装配成具有活性的全酶, 利于 CO2
的固定。PSII 23 kD蛋白(点 6)是光系统 II (PSII)的
外周蛋白, 具有增加 Ca2+和 Cl−的结合、维持放氧活
性的作用[32]。高温胁迫导致 20 kD伴侣蛋白和 PSII
23 kD蛋白表达量的下降(图 4)。
放氧复合蛋白(oxygen-evolving complex protein)
存在于质膜的 PSII中, 主要位于 PSII将 H2O氧化释
放 O2的位置。研究表明, PSII放氧复合蛋白含有 19
个亚基(16个位于内部, 3个位于外部), 这些亚基有
的可作为载体, 有的则作为共转录因子[33]。高温胁
迫导致 PSII放氧复合蛋白 1 (点 5)表达量的增加(图
4)。氧化胁迫和渍水胁迫等也会导致 PSII 放氧复合
蛋白 1表达量的上升[34-35]。
2.4.2 能量相关蛋白 由表 3可知, 点 2、点 10、
点 12和点 13都是 ATP合成酶相关蛋白。高温胁迫
导致 ATP 合成酶活性的下降(图 4)。ATP 合成酶是
内膜上的一种多亚基复合蛋白, 是 ATP 生物合成过
程中的主要酶。ATP 合成酶有 2 个主要部分 F0 和
Fl, F0在膜的外侧, 有 3个接触位点, 由 5个不同的
亚基组成; 而 F1则形成一个跨膜蛋白, 由 3个亚基
组成。高温胁迫下 ATP合成酶表达量的下降将会影
响需要独立能量供应的生物化学反应。Wang等[36]
认为, CF1 α-亚基在 ATP 合成酶的多亚基装配过程
中有组织功能。
2.4.3 代谢相关蛋白 高温胁迫导致明恢 63叶
片中铁氧化蛋白 -NADP(H)-氧化还原酶 [ferredoxin
NADP(H) oxidoreductases, FNR](点 7和点 8)表达量
的下降(图 4)。植物体内的 FNR与 PSI、PSII、电子
传递、氮素固定等有关。FNR 能提供 NADPH 以利
于 CO2的固定, 而且它也能利用 NADPH 还原铁氧
化蛋白。高温减少 FNR的表达量在大豆叶片中也曾
发现过[37]。Girardini 等[38]研究认为, FNR 不仅参与
固醇类化合物的生物合成, 而且在 ROS导致的细胞
损伤或线粒体损伤中起保护酶的作用。
谷氨酸合酶(glutamate synthase, GOGAT)催化
谷氨酰胺的胺基在 NAD(P)H 或还原型铁氧还蛋白
的存在下, 还原转移于 α-酮戊二酸, 生成 2 分子谷
氨酸。高温胁迫下, Fd-GOGAT(点 11)表达量的增加
利于维持植物体内的正常代谢。同时, 高温胁迫导
致 FAD-吡啶二硫化核苷酸氧化还原酶 (FAD-
dependent pyridine nucleotide-disulphide oxidoreduc-
tase)(点 19)表达量的下降。FAD-吡啶二硫化核苷酸
氧化还原酶能有效地催化二硫键的形成 [39]。另外 ,
磷酸吡哆醛-转移酶(pyridoxal phosphate-dependent
transferase)(点 20)和 Haloacid dehalogenase-like hy-
drolase (HDHD)(点 3)都为代谢类蛋白。
2.4.4 抗逆相关蛋白 2-cys 过氧化物酶(2-cys
peroxiredoxin)是过氧化蛋白(Prxs)的一种。Prxs是一
类新的过氧化物酶, 它可以催化 H2O2还原为水, 或
在供氢体的存在下, 催化各种烷基过氧化物还原为
水和相应的醇。植物体内的 2-cys 过氧化物酶被称
为 BAS1(点 4), 高温胁迫导致其表达量上升(图 4)。
由图 4 可知, 高温胁迫诱导过氧化氢酶(点 23 和点
24)表达量的上升。Majoul等[40]研究发现, 六倍体小
麦在开花期受高温胁迫后, 过氧化氢酶表达量增加
显著。而高温胁迫同样也造成番茄叶片中过氧化氢
酶等抗氧化酶类活性的增加[41]。过氧化氢酶可保护
高温胁迫下水稻的正常生长和发育。
3 讨论
高温对水稻生长发育的影响曾有过不少报
道[16-17,19]。本试验表明, 无论在苗期还是在抽穗期,
高温都降低水稻的 SPAD 值。苗期高温还导致水稻
株高、根长和生物量的下降, 而抽穗期高温严重影
响水稻的结实率。高温胁迫下水稻叶片的 H2O2 和
O2܋以及 MDA 含量增加, 说明氧化胁迫加重(图 2),
与此相对应, 一些抗氧化酶的活性增加。同时, 高温
对水稻生长及生理性状的影响因品种而异。本试验
中, 高温对耐热品种密阳 46的影响明显小于对敏感
品种明恢 63 的影响。如高温对密阳 46 的 SPAD 值
影响很小 , 苗期叶片的 MDA 值和抽穗期剑叶的
H2O2含量与对照无显著差异。蛋白质组学分析结果
则佐证了生理学分析结果。
高温胁迫导致水稻叶片中光合作用相关蛋白以
及能量类、代谢类蛋白表达量的下降(表 3和图 4)。
同时, 高温胁迫也诱导产生了一些抗逆蛋白。另外,
第 5期 周伟辉等: 高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因型和生育期差异 827



828 作 物 学 报 第 37卷


图 4 差异蛋白在各处理下的表达情况
Fig. 4 Close-up views of the differentially expressed proteins identified by MALDI-TOF-MS analysis
A: 明恢 63, 正常温度, 苗期; B: 明恢 63, 高温, 苗期; C: 明恢 63, 正常温度, 抽穗期; D: 明恢 63, 高温, 抽穗期; E: 密阳 46, 正常温
度, 苗期; F: 密阳 46, 高温, 苗期; G: 密阳 46, 正常温度, 抽穗期; H: 密阳 46, 高温, 抽穗期。箭头标注的蛋白点与图 3一致。
A: Minghui 63, normal temperature, at seedlings stage; B: Minghui 63, high temperature, at seedlings stage; C: Minghui 63, normal tem-
perature, at heading stage; D: Minghui 63, high temperature, at heading stage; E: Milyang 46, normal temperature, at seedlings stage; F:
Milyang 46, high temperature, at seedlings stage; G: Milyang 46, normal temperature, at heading stage; H: Milyang 46, high temperature, at
heading stage. Arrows indicate the protein spots which were consistent with these in Fig. 3.

蛋白质组学分析结果表明, 耐热品种密阳 46和敏感
品种明恢 63之间存在着差异。高温所导致的Rubisco
相关蛋白表达量下降, 明恢 63的下降程度远大于密
阳 46; 而密阳 46 叶片中 PSII 放氧复合蛋白 1 的表
达有助于其光合作用的正常进行。能量类蛋白中 ,
ATP合成酶相关蛋白的表达在明恢 63中显著下降,
且其叶片中 FNR 表达量下降也证明高温造成了严
重损伤。在高温胁迫对磷酸吡哆醛-转移酶的表达量
的影响上, 明恢 63叶片表现下降, 而密阳 46叶片表
现上升, 进一步佐证了密阳 46的耐热性。高温胁迫
诱导密阳 46 叶片中 BAS1 的表达量的上升, BAS1
能保护高温胁迫下光合作用的顺利进行以及清除植
物体内过多的 H2O2。
综上所述, 耐热品种密阳 46有更多的热应对机
制, 其通过抗氧化酶(SOD、CAT和 BAS1)、光合相
关蛋白(PSII 放氧复合蛋白 1)和代谢相关蛋白(磷酸
吡哆醛-转移酶)的过表达来维持其高温胁迫下的正
常生长。Jagadish等[19]在研究不同耐热性水稻品种
第 5期 周伟辉等: 高温胁迫下水稻叶片的蛋白响应及其基因型和生育期差异 829


对开花期高温胁迫的反应时发现, 强耐热品种 N22
中热激蛋白和冷激蛋白表达量上升, 铁缺失蛋白表
达量下降; 而热敏感品种 Moroberekan 中热激蛋白
和冷激蛋白表达量下降, 铁缺失蛋白和可溶性无机
焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophosphatase)表达量
上升。相应地, 高温使耐热品种 IR64中热激蛋白、
冷激蛋白和核糖体蛋白上升, 丝氨酸蛋白酶(serine
protease)、引导蛋白(dirigent)和铁缺失蛋白下降。类似
结果在大麦和翦股颖草的高温试验中也被发现[2-3]。
水稻的生长发育需要一定的温度。一定范围内,
温度升高促进生长 , 但过高的温度会抑制水稻生
长。苗期高温使秧苗发育不良; 营养生长期遇高温
导致营养生育期缩短, 生长发育受阻, 分蘖受抑制;
幼穗分化期遇高温导致花粉发育异常, 致结实率下
降[42]。一般作物的生殖生长都较营养生长更易受到
高温胁迫, 抽穗开花期是水稻生长发育过程中对温
度变化最敏感的时期[18,43]。Satake和 Yoshida[18]研究
发现, 小花在水稻开花期遇 35℃以上高温 5 d, 导致
花粉败育, 结实率为零。本研究中, 蛋白质组学分析
结果表明, Rubisco相关蛋白的表达量下降主要发生
在抽穗开花期。ATP 合成酶的表达量下降在抽穗开
花期也十分明显。光合作用相关蛋白 PSII 23 kD蛋
白和代谢类蛋白 FAD-吡啶二硫化核苷酸氧化还原
酶的表达量下降也发生在抽穗开花期, 说明抽穗开
花期较苗期对温度变化更为敏感。
高温胁迫导致植物体内 ROS的过多积累, 致使
膜结构和功能以及蛋白质和核酸等受损, 甚至导致
细胞死亡。为了应对由此造成的氧化损伤, 细胞内
有一套抗氧化系统, 以清除过多的 ROS及其诱导产
生的有毒物质。Lee等[16]对正常温度和高温胁迫下
生长的水稻幼苗叶片进行蛋白质组学分析, 结果显
示, 高温使 3 类抗氧化酶 , 即谷胱甘肽 S-转换酶
(glutathione S-transferase, GST)、脱氢抗坏血酸还原
酶 (dehydroascorbate reductase, DHAR)和硫氧化酶
(thioredoxin h-type)上调。Han等[17]报道, 温度越高,
水稻幼苗叶片中 DHAR 表达量越大。本研究表明,
高温诱导两水稻品种叶片中 CAT表达量上升。另外,
抽穗期高温胁迫使耐热水稻品种密阳 46叶片中
BAS1表达量上升。
高温使 BAS1 的表达量上升, 这是本研究首次发
现的。Dietz 等[44]研究认为, BAS1 可降低氧化胁迫对
叶绿体蛋白的损伤。Baier和 Dietz[45]研究认为, BAS1
与烷基过氧化氢还原酶(subunit C of alkyl hydroper-
oxide reductase, AhpC)关系密切, 活跃在类囊体的基
质表面。在拟南芥的叶片生长中, BAS1能保护光合组
织免遭氧化胁迫[46]。BAS1 还可以作为叶绿体中氧化
胁迫的信号, 继而引发一系列胞内反应。可以认为, 由
于 BAS1能清除植物体内过多的 H2O2, 故能保护高温
胁迫下的水稻顺利进行光合作用。
水稻叶片蛋白中大量存在的 Rubisco 对试验结
果产生一定的影响。因此, 在今后的蛋白质组学分
析中 , 应利用聚乙二醇(PEG)预分离技术等去除水
稻叶片中的 Rubisco, 以获得更多的相关信息。本研
究中一些蛋白质的表达量过低, 使后期数据库检索
过程中无法获得明显的同源匹配蛋白, 未能成功鉴
定。因此, 拟在今后研究中加大上样量, 对尚未成功
鉴定的 11个差异表达蛋白点继续做质谱鉴定分析 ,
对已经成功鉴定的部分蛋白质做验证分析(Western-
blot)。
4 结论
苗期或抽穗期高温处理导致热敏感品种明恢 63
和耐热品种密阳 46结实率、SPAD值、株高、根长
和生物量的下降, 丙二醛、过氧化氢、超氧阴离子
含量的增加和超氧化物歧化酶活性的提高。同时 ,
高温胁迫对明恢 63的影响要大于对密阳 46的影响。
高温胁迫可使水稻叶片蛋白中光合作用相关蛋白和
能量代谢类蛋白表达量的下降, 以及抗逆相关蛋白
表达量的上升。耐热品种密阳 46 通过抗氧化酶
(SOD、CAT 和 BAS1)、光合相关蛋白(PSII 放氧复
合蛋白 1)和代谢相关蛋白(磷酸吡哆醛-转移酶)的过
表达维持其高温胁迫下的正常生长。
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