全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(2): 374−379 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30771527)和教育部博士点基金项目(20060466004)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 王成章, E-mail: wangchengzhang@263.net
第一作者联系方式: E-mail: zhujianming311@139.com, Tel: 15095289269
Received(收稿日期): 2010-05-28; Accepted(接受日期): 2010-09-22.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00374
紫花苜蓿光敏色素 B基因片段克隆及 RNA干扰表达载体的构建
朱见明 严学兵 史莹华 王成章*
河南农业大学牧医工程学院, 河南郑州 450002
摘 要: 根据紫花苜蓿 2级标准品种 Vernal PhyB基因的序列(GenBank登录号为 GQ379903.1), 设计 2对含有酶切位
点的特异性引物 F1/R1和 F2/R2, 以紫花苜蓿总 RNA为模板, 通过 RT-PCR法扩增得到 PhyB基因正向、反向目的片
段, 将片段连接到 pGEM-T Easy载体上得到重组载体 pGEMB-1和 pGEMB-2, 再以中间载体 pHANNIBAL和植物双
元表达载体 pART27为基础, 通过多次酶切和连接, 成功地构建了紫花苜蓿 PhyB 的 RNAi 表达载体。为进一步研究
光敏色素 B与苜蓿秋眠性之间的关系奠定了基础。
关键词: 紫花苜蓿; 秋眠性; 光受体; 光敏色素; RNA干扰
Cloning of Medicago sativa Phychrome B cDNA and Establishment of Its RNA
Interference Expression Vector
ZHU Jian-Ming, YAN Xue-Bing, SHI Ying-Hua, and WANG Cheng-Zhang*
Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The short day is one of the main factors affecting alfalfa fall dormancy, which is called as the photoperiodic effect. Study
on the relationship between the main photoreceptors-PhyB gene and alfalfa fall dormancy may reveal the regulation mechanism of
alfalfa fall dormancy radically, and provide a scientific reference for the application of alfalfa varieties differing in fall dormancy in
forage production. The objective of this study was to establish an RNAi expression vector harboring PhyB gene of Medicago sativa.
Two pairs of specific primers containing different enzyme sites were designed on the basis of PhyB gene sequence of alfalfa variety
“Vernal” (GenBank accession number: GQ379903.1). With the template of total RNA, positive sense strand and antisense strand
were amplified by RT-PCR and cloned into pGEM-T Easy vector to obtain recombinant vectors pGEMB-1 and pGEMB-2, then
based on the intermediate vector pHANNIBAL and the plant binary expression vector pART27, we constructed the RNAi expression
vector pART27-RNAi containing a hairpin structure by many times of enzyme digestion and connection. The results provide a foun-
dation for further studying the relationship between alfalfa dormancy and PhyB.
Keywords: Medicago sativa; Fall dormancy; Photoreceptor; Phytochrome; RNA interference
苜蓿秋眠性(fall dormancy, FD)是苜蓿在秋季因日照
长度变短和气温下降时所表现出的一种适应性生长特
性[1], 是栽培苜蓿选择品种时考虑的首要指标[2]。从本质
上讲, 秋眠性是对日照长度的反应[3], 短日照是其主要的
影响因子[4]。苜蓿作为长日照植物, 晚春及夏季长日照条
件下有利于其生长发育 , 秋冬季短日照则休眠 , 说明苜
蓿秋眠存在着光周期效应[5]。光敏色素(phytochrome, Phy)
是光周期反应的主要受体, 接受和传递光信息[6], 参与调
控植物的许多生理过程, 如种子萌发、幼苗去黄化、昼夜
节律及根、茎、叶、花等器官的分化与发育[7]。双子叶植
物中至少存在 PhyA、PhyB、PhyC、PhyD和 PhyE等不同
的光敏色素基因, 其中 PhyB 主要存在于绿色植物中, 在
光下和暗中都可合成并稳定存在 [ 8 -9 ]。Quail 等 [10]和
Wagner等[11]研究表明, PhyB对植物胚芽鞘和下胚轴的生
长以及植物茎的生长有抑制作用, 并且与延迟开花有关,
说明 PhyB无论在幼苗的生长抑制还是成株的开花抑制中均
发挥了重要作用。PhyB 调控的这些生理活动似乎与苜蓿的
秋眠性密切相关。王成章等[12]研究表明, 和非秋眠苜蓿相比,
秋眠苜蓿叶片中PhyB含量高, 推测PhyB作为绿色植物主要
光受体可能通过光周期调控参与了苜蓿的秋眠。
自 20世纪 20年代发现苜蓿秋眠性以来, 对其调控机
理进行了大量研究[13-15]。由于苜蓿的秋眠性和抗寒性存
第 2期 朱见明等: 紫花苜蓿光敏色素 B基因片段克隆及 RNA干扰表达载体的构建 375


在着显著的正相关关系, 多年来有关苜蓿秋眠机理的研
究多集中在与抗寒性有关的物质代谢上 [14], 甚至许多人
把秋眠性和抗寒性相混淆。近年来的研究表明, 苜蓿的秋
眠性和抗寒性为 2个独立的性状 [16-17], 短日照和低温分
别是苜蓿秋眠性和抗寒性的主要影响因子, 研究 PhyB 在
苜蓿秋眠中的作用与功能可能从根本上揭示苜蓿秋眠性
的调控机理。
近年来, RNA 干扰(RNA interference, RNAi)技术发
展迅速, 由于其高效性、稳定性和专一性, 逐渐成为植物
基因功能研究的重要的反向遗传学手段。该技术主要是通
过双链 RNA (double strands RNA, dsRNA)的介导, 特异
性地降解相应序列的靶 mRNA, 从而阻断相应的基因表
达 , 是一种典型的转录后基因调控方法 , 又称转录后基
因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[18]。在植
物 RNA 干扰的研究中 , 大多是通过构建表达载体将
dsRNA 转入植物[19], 载体中连入的具有反向重复基因序
列片段的结构在植物体内转录为 mRNA 后, 通过自我互
补形成发夹式 RNA(hairpin RNA, hpRNA)[20], 导致植物
内同源基因编码的 mRNA 降解, 从而抑制特定基因的表
达。研究 PhyB基因在苜蓿秋眠性中的作用和功能, RNAi
技术是一种理想方法。
本研究根据 RNA 干扰基因表达的技术原理, 以 PhyB
为靶基因, 构建了紫花苜蓿 PhyB 基因的 RNAi 植物双元表
达载体, 并转入根癌农杆菌菌株 EHA105 中, 以抑制 PhyB
基因的表达, 为进一步研究PhyB基因的功能以及探讨PhyB
基因与苜蓿秋眠性之间的关系奠定物质基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 采用秋眠级 2 级的紫花苜蓿标准品
种 Vernal, 采集实验室盆栽的紫花苜蓿的幼嫩叶片作为
总 RNA提取材料。
1.1.2 菌种及载体 大肠杆菌(Escherichia coli) DH-5α
转化菌株购自天根生化科技有限公司。连接载体 pGEM-T
Easy 购自 Promega。用于构建的中间载体 pHANNIB-
AL[21]、植物双元表达载体 pART27[22]由中国科学院武汉
植物园黄文俊博士惠赠。
1.1.3 主要试剂 RNAiso Plus (Total RNA提取试剂)、
TaKaRa BcaBESTTM RNA PCR Kit Ver.1.1、 TaKaRa
Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、DNA Marker、
T4 DNA Ligase、各种限制性内切酶等为宝生物工程(大连)
有限公司产品。TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂
盒为天根生化科技(北京)有限公司产品。试验所用的培养
基为 LB培养基(10 g胰蛋白胨, 5 g酵母提取物, 10 g NaCl
定容至 1 L, pH 7.0, 固体培养基加 15%琼脂粉)。其他生
化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯级。
1.2 引物设计及合成
根据本实验室克隆的紫花苜蓿 2 级标准品种 Vernal
PhyB 基因的 cDNA 全长序列 (GenBank 登录号为
GQ379903.1)并结合 pHANNIBAL、pART27 载体上的酶
切位点设计 2 对引物(表 1)。引入的 4 个酶切位点只在
pHANNIBAL 的多克隆位点存在, 而在所要构建的片段
中不能存在。

表 1 引物序列及 PCR扩增基因片段
Table 1 Primer sequences and the amplified gene fragments
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequences (5′–3′)
酶切位点
Restriction site
扩增产物长度
Fragment size (bp)
F1 CCATCGATTTCAGTTAGCCGCACAGT Cla I
R1 GCTCTAGATATACGCAACAGCCATCC Xba I
349
F2 CGGGGTACCTTCAGTTAGCCGCACAGT Kpn I 351
R2 CCGCTCGAGTATACGCAACAGCCATCC Xho I
F表示上游引物, R表示下游引物。F and R stand for forward primer and reverse primer.

F1 和 R1 用于 PhyB 基因正向目的片段扩增; F2 和
R2 用于 PhyB 基因反向目的片段扩增。引物由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成。
1.3 紫花苜蓿总 RNA的提取
取约 80 mg 新鲜的紫花苜蓿茎顶端叶片 , 采用
RNAiso Plus(Total RNA提取试剂)提取总 RNA, 具体操作
参考说明书。
1.4 以 RT-PCR扩增获得目的片段
按照 TaKaRa BcaBESTTM RNA PCR Kit Ver.1.1的说
明合成第一条 cDNA 链, 以提取的紫花苜蓿总 RNA为模
板, Random 9 mers为引物, 配制 10 µL反转录反应液, 混
匀后, 按 65℃ 1 min, 30℃ 5 min (15~30 min内匀速升温),
65℃ 30 min, 98℃ 5 min, 5℃ 5 min进行反应。PCR扩增
以 cDNA链为模板, 分别加入引物 F1/R1、F2/R2配制 PCR
反应液, 混匀, 反应程序为 94℃预变性 5 min; 94℃变性
30 s, 54.1℃退火 30 s, 72℃延伸 45 s, 30个循环; 72℃延伸
5 min; 4℃。
1.5 PCR产物的克隆与序列测定
将 PCR 扩增产物在 1%的琼脂糖凝胶上电泳, 切下
含目的片段的胶块 , 按照 TaKaRa Agarose Gel DNA
Purification Kit Ver.2.0 的说明对其纯化回收。将回收的
PCR 产物与 pGEM-T Easy 载体连接(连接方法参考说明
书), 再用热激法转化新鲜的大肠杆菌 DH-5α感受态细胞,
涂布于含氨苄/IPTG/X-Gal的 LB平板上进行蓝白斑筛选,
376 作 物 学 报 第 37卷

用菌液 PCR、酶切鉴定连接成功重组载体后, 送宝生物工
程(大连)有限公司测序。将正、反向基因片段阳性克隆分
别命名为 pGEMB-1和 pGEMB-2。
1.6 中间载体 pHANNIBAL-RNAi的构建
用Cla I/Xba I分别双酶切 pHANNIBAL和 pGEMB-1,
从凝胶中回收和纯化中间载体质粒的大片段以及来自重
组质粒 DNA的目的基因片段, 用 T4 DNA连接酶将二者
在 16℃过夜反应 , 构建成含有正向插入片段的质粒
pHB-1。然后用 Kpn I/Xho I双酶切质粒 pHB-1和 pGEMB-2,
同样回收相应 DNA 片段, 用 T4 DNA 连接酶连接, 从而
完成反向片段的插入, 构建成含有正向和反向目的片段
的中间载体 pHANNIBAL-RNAi。用上述转化方法将其转
化感受态细胞 DH-5α, 挑取阳性克隆, 并提取质粒, 进行
PCR测定及双酶切检测。
1.7 植物双元表达载体 pART27-RNAi的构建
用 Not I 酶切 pHANNIBAL-RNAi, 回收大片段, 与
经同样酶切回收的 pART27载体相连, 得到具有目的片段
反向重复序列的植物 RNAi双元表达载体 pART27-RNAi。
将检测正确的克隆提取质粒, 用液氮冻融法将 pART27-
RNAi 质粒转入根癌农杆菌 EHA105。提取质粒进行酶切
分析。
2 结果与分析
2.1 紫花苜蓿 PhyB基因片段的克隆与鉴定
从紫花苜蓿幼嫩叶片中提取总 RNA (图 1-A), 以此
为模板反转录成 cDNA, 再以 cDNA 为模板, 分别用正向
和反向目的片段引物进行 PCR, 扩增产物经凝胶电泳检
测, 得到 2条长约 350 bp的 DNA片段(图 1-B), 与预期扩
增片段相符。将 PCR 产物回收纯化后连接到 pGEM-T
Easy 载体上, 经转化获得重组子菌落, 选取经菌液 PCR
检测为阳性的克隆质粒, 用 Cla I/Xba I及 Kpn I/Xho I两
对限制性内切酶分别鉴定重组质粒 pGEMB-1和 pGEMB-
2克隆的正确性, 经检测分别得到长约 350 bp的 DNA插
入片段(图 2, 泳道 3 和 6 所示), 以 PCR 扩增同样分别得
到长约 350 bp的片段(图 2, 泳道 4和 7所示)。对经过鉴
定的阳性克隆进行序列测定(图 3), 结果表明其结构与在

图 1 紫花苜蓿总 RNA(A)及 PhyB基因 cDNA的 RT-PCR扩增(B)
Fig. 1 Total RNA(A) and RT-PCR amplification of PhyB gene
cDNA(B) of Medicago sativa
M: DNA marker I; 1~2: RT-PCR 扩增产物。
M: DNA marker I; 1–2: amplification product by RT-PCR.

图 2 pGEMB-1/2质粒的鉴定
Fig. 2 Identification of plasmid pGEMB-1/2
M: DNA marker DL2000; 1: pGEM-T Easy质粒; 2: pGEMB-1质粒;
3: pGEMB-1质粒 Cla I/Xba I双酶切; 4: pGEMB-1质粒 PCR(引物
F1/R1); 5: pGEMB-2质粒; 6: pGEMB-2质粒 Kpn I/Xho I双酶切;
7: pGEMB-2质粒 PCR(引物 F2/R2); 8: PCR负对照。
M: DNA marker DL2000; 1: plasmid pGEM-T Easy; 2: plasmid
pGEMB-1; 3: plasmid pGEMB-1 digested with Cla I and Xba I; 4: PCR
of plasmid pGEMB-1 (primer F1/R1); 5: plasmid pGEMB-2; 6: plasmid
pGEMB-2 digested with Kpn I and Xho I; 7: PCR of plasmid pGEMB-2
(primer F2/R2); 8: negative control of PCR.

GenBank上注册号为 GQ379903.1的紫花苜蓿 2级标准品
种 Vernal PhyB基因相似性高达 99%。说明获得的片段是
紫花苜蓿 PhyB基因的目的片段。
2.2 中间载体 pHANNIBAL-RNAi的构建
该载体的构建主要分两步进行, 首先用 Cla I/Xba I
位点正向插入目的片段并命名为 pHB-1, PCR、酶切鉴定
正确后再利用 Kpn I/Xho I位点反向插入目的片段并命名
为 pHANNIBAL-RNAi 。 根 据 构 建 的 中 间 载 体
pHANNIBAL-RNAi上阅读框架的限制性酶切位点的特点
对其进行酶切分析, 经 Cla I/Xba I、Kpn I/Xho I分别双酶
切, 均在 350 bp左右处出现了特异条带(图 4, 泳道 3和 5
所示), 大小与正向、反向目的片段相符; 用 Cla I/Kpn I
双酶切, 在 740 bp 左右处出现特异条带(图 4, 泳道 7 所
示), 与 PDK (丙酮酸磷酸激酶, 该中间载体的内含子序
列)大小相符; 经 Xba I/Xho I双酶切, 在 1 440 bp左右处
出现特异条带(图 4, 泳道 8 所示), 其大小与正向目的片
段、PDK和反向目的片段之和相符。同时, 以引物 F1/R1、
F2/R2对 pHANNIBAL-RNAi进行 PCR扩增检测, 也均在
350 bp左右处出现了特异条带(图 4, 泳道 4和 6)。以上结
果说明成功构建了含有 PhyB基因正向、反向目的片段的
中间载体 pHANNIBAL-RNAi。
2.3 植物双元表达载体 pART27-RNAi的构建
通过 Not I酶切及 T4 DNA连接酶的过夜连接, 构建
了 pART27-RNAi载体, 提取质粒进行检测。经 Not I酶切
在 3650 bp左右处出现特异条带(图 5, 泳道 3所示), 其大
小 与 “CaMV 35S Promoter-PhyB-PDK-anti PhyB-OCS
terminator”的大小相符(图 5, 泳道 4 所示)。以 F1/R1、
F2/R2为引物对 pART27-RNAi进行 PCR扩增, 也分别在
350 bp 左右处出现了特异条带(图 5, 泳道 5和 6所示)。
酶切及 PCR检测结果均说明成功构建了含有 PhyB-RNAi
表达框架的植物双元表达载体 pART27-RNAi (图 6)。
第 2期 朱见明等: 紫花苜蓿光敏色素 B基因片段克隆及 RNA干扰表达载体的构建 377



图 3 目的片段的序列分析
Fig. 3 Sequence analysis of target fragment



图 4 pHANNIBAL-RNAi质粒的鉴定
Fig. 4 Identification of plasmid pHANNIBAL-RNAi
M1: DNA marker DL5000; M2: DNA marker DL2000; 1: pHANNIBAL
质粒; 2: pHANNIBAL-RNAi质粒; 3: pHANNIBAL-RNAi质粒 Cla
I/Xba I双酶切; 4: pHANNIBAL-RNAi质粒 PCR(引物 F1/R1); 5:
pHANNIBAL-RNAi质粒 Kpn I/Xho I双酶切; 6: pHANNIBAL-RNAi
质粒 PCR(引物 F2/R2); 7: pHANNIBAL-RNAi质粒 Cla I/Kpn I双酶
切; 8: pHANNIBAL-RNAi质粒 Xba I/Xho I双酶切。
1: plasmid pHANNIBAL; 2: plasmid pHANNIBAL-RNAi; 3: plasmid
pHANNIBAL-RNAi digested with Cla I and Xba I; 4: PCR of plasmid
pHANNIBAL-RNAi (primer F1/R1); 5: plasmid pHANNIBAL-RNAi
digested with Kpn I and Xho I; 6: PCR of plasmid pHANNIBAL-RNAi
(primer F2/R2); 7: plasmid pHANNIBAL-RNAi digested with Cla I and
Kpn I; 8: plasmid pHANNIBAL-RNAi digested with Xba I and Xho I.

图 5 pART27-RNAi质粒的鉴定
Fig. 5 Identification of plasmid pART27-RNAi
M1: DNA marker DL15000; M2: DNA marker DL5000;1: pART27质
粒; 2: pART27-RNAi质粒; 3: pART27-RNAi质粒 Not I酶切; 4:
pHANNIBAL-RNAi质粒 Not I酶切; 5: pART27-RNAi质粒 PCR(引物
F1/R1); 6: pART27-RNAi质粒 PCR(引物 F2/R2)。
M1: DNA marker DL15000; M2: DNA marker DL5000; 1: plasmid
pART27; 2: plasmid pART27-RNAi; 3: plasmid pART27-RNAi di-
gested with Not I; 4: plasmid pHANNIBAL-RNAi digested with Not I;
5: PCR of plasmid pART27-RNAi (primer F1/R1); 6: PCR of plasmid
pART27-RNAi (primer F2/R2).

图 6 pART27-RNAi表达框架结构示意图
Fig. 6 Structure map of pART27-RNAi expressing framework
RB: 右边界; CaMV 35S: CaMV 35S启动子; Anti-sense: 反向片段; PDK: PDK内含子; sense: 正向片段; OCS ter: OCS终止子; NOS pro: NOS启
动子; NPT II: 新霉素磷酸转移酶基因; NOS ter: NOS 终止子; LB: 左边界。
RB: Right Border; CaMV 35S: CaMV 35S promoter; Anti-sense: fragment in anti-sense orientation; PDK: PDK intron; sense: fragment in sense ori-
entation; OCS ter: OCS terminator; NOS pro: NOS promoter; NPT II: neomycin phosphotransferase gene; NOS ter: NOS terminator; LB: left border.

378 作 物 学 报 第 37卷

3 讨论
RNA 干扰现象自被发现以来, 就广泛用于植物基因
功能的分析验证, 尤其是 hpRNA介导的基因沉默[23]更是
研究热点。Chuang等[24]采用 RNAi技术证实了 AG、CLV3、
API、PAN基因在拟南芥花发育过程中的作用。Gong等[25]
构建了拟南芥 SOS 家族样的蛋白激酶基因 PKSes 的一个
成员 PKS18的 RNAi载体, 研究证实 PKS18与 ABA信号
转导有关。Senthil等[26]用 RNA干扰技术证实 RNAi对大
豆子叶中 IFS 基因的功能分析有效。李小平等 [27]应用
RNA 干扰技术验证了大豆 LRP 型类受体蛋白激酶基因
rlpk2与大豆叶片衰老有关。Hirotaka等[28]应用 RNA干扰
技术证实, 豆科植物根瘤素合成基因 ENOD40 基因对根
瘤的产生和后续生长是必需的, 但和根瘤菌与植物之间
早期的相互作用无关。同样, 将 RNAi技术应用于紫花苜
蓿 PhyB基因的研究具有可行性。
选择合适的干扰片段是 RNAi载体构建成功的关键。
有文献表明, 基因片段短至 23 bp, 长至 1 kb都能得到很
好的效果[21]。又有研究表明, 基因干涉效率有长度依赖性,
dsRNA越长效果越明显: 400~500 nt>200~300 nt>50~100
nt, 内源性基因片段越短越能耐受 dsRNA[29]。其实, 实际
运用中发现, 采用 RNAi 技术, 在干涉片段的选择上存在
很大的可塑性 , 因为 120~1 000 bp的片段都可以抑制靶
标基因的表达[19], 也可同时沉默 2个或 2个以上同源性很
低的基因。载体的外源基因片段太短不利于构建操作, 并
且太短的 dsRNA不能很好地被 DICER酶识别; 而太长的
片段在构建操作中容易引起重组, 并且太长的 dsRNA 结
构上不太稳定。因此, 所选最适片段长度应该在 200~600
bp 左右[30], 这将有利于遗传转化和外源基因在转基因植
株中的稳定遗传。因此, 本研究以紫花苜蓿 PhyB 基因为
靶基因, 设计选取 333 bp 的干涉片段, 目的是有效抑制
靶标基因的表达。
本试验中所选择的中间载体 pHANNIBAL及植物双元
表达载体 pART27是专门用于植物 RNA干扰的载体[21-22]。
其中 pHANNIBAL的启动子为 CaMV35s, 终止子为 OCS,
PCR 产物可以直接插入 PDK 内含子的两侧, 在转录时会
自发回折成互补双链, 内含子会自动被植物内的核酸酶切
除, 这样就形成了能引发 RNAi反应的双链核酸结构[31]。
外源基因在植物中的成功表达有赖于植物表达载体
中的表达调控元件 , 即启动子和转录终止信号 , 为便于
转化植物组织和再生植株的筛选, 一般还需带上选择标
记基因或报告基因。作物植物遗传转化的载体必须是能进
入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。本试验中使用
的植物双元表达载体 pART27 带有卡那抗性的植物选择
基因和链霉素抗性的细菌选择基因。含有 Nos promoter、
Nos terminator, 可确保 PhyB的正反向片段在植物细胞中
得以表达。在其转化大肠杆菌及农杆菌后可以根据卡那或
者链霉素抗性初步筛选重组子, 为后续检测转基因植株
提供便利。
目前正在对 PhyB基因的 RNA干扰载体进行紫花苜
蓿的遗传转化 , 希望培育出有价值的突变植株 , 以便于
进行该基因功能的研究以及后期深入的分析。
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