全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(3): 549−555 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由湖南省科技计划重点项目(2010TP4004-1), 湖南省教育厅重点项目(09A042), 湖南农业大学人才引进科技资助项目(07YT03),
湖南省教育厅优秀人才项目(10B050)和省部共建国家重点实验室培育基地科学基金开放项目(10KFXW09)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 揭雨成, E-mail: ibfcjyc@vip.sina.com, Tel: 13874940038
第一作者联系方式: E-mail: jinghua06101@163.com
Received(收稿日期): 2011-06-25; Accepted(接受日期): 2011-10-12; Published online(网络出版日期): 2011-12-01.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20111201.0920.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00549
苎麻 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析
周精华 1 邢虎成 1,2 揭雨成 1,2,* 钟英丽 1,3 朱守晶 1 蒋 杰 1 王 亮 1
1 湖南农业大学苎麻研究所, 湖南长沙 410128; 2 湖南省种质资源创新与资源利用重点实验室, 湖南长沙 410128; 3 湖南农业大学生物
科学与技术学院, 湖南长沙 410128
摘 要: 以耐旱性较强的湘苎 3号为材料, 从苎麻转录组测序结果中获得了 1个与 P5CS基因高度相似的Unigene, 该
片段长 1 448 bp, 根据该序列设计 5′RACE和 3′RACE槽式 PCR引物, 利用 RACE结合 RT-PCR技术分别克隆得到
590 bp的 5′端和 293 bp的 3′端, 拼接获得该基因全长 cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析表明, 该基因全长
为 2 318 bp, 其中开放读码框为 2 154 bp, 编码 717 个氨基酸, 其编码蛋白质的等电点和分子量分别为 6.57 kD 和
77.56 kD, 与亚洲棉、麻风树、拟南芥和水稻的 P5CS 基因的核苷酸序列相似性分别为 81%、81%、75%和 72%, 蛋
白质序列的相似性分别为 86%、85%、78%和 77%, 说明该基因与 P5CS为同源, 被命名为 BnP5CS1。半定量 RT-PCR
分析表明, 该基因在苎麻的茎尖中表达量最高, 在根中其次, 且受干旱胁迫的诱导。P5CS 基因是植物体内合成脯氨
酸的关键酶基因, BnP5CS1基因的克隆将为苎麻的抗逆分子育种和进一步的功能分析鉴定基础。
关键词: 苎麻; P5CS; 脯氨酸; 干旱; 表达分析
Molecular Cloning and Expression Analysis of Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Syn-
thetase (P5CS) Gene in Ramie
ZHOU Jing-Hua1, XING Hu-Cheng1,2, JIE Yu-Cheng1,2,∗, ZHONG Ying-Li1,3, ZHU Shou-Jing1, JIANG Jie1,
and WANG Liang1
1 Institute of Ramie, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Hunan Provincial Key Laboratory of Corp Germplasm Innovation and
Utilization, Changsha 410128, China; 3 College of Bioscience and Biotechnology, Changsha 410128, China
Abstract: Proline is one of osmotic regulators in plant, which plays an important role in regulating ramie in response to drought
stress. The synthesis of proline has been reported to be restricted by the enzyme of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase (P5CS). In
this study, taking Xiangzhu 3 with drought tolerance as an experimental material, we obtained a ramie Unigene highly identified with
P5CS gene from the ramie transcription group sequencing, and the gene length was 1 448 bp. According to the known fragment, the
5 and 3 RACE PCR nest primers were designed, and a 590 bp 5′ terminal sequence and a 293 bp 3′ terminal sequence were ampli-
fied by RACE and RT-PCR, separately. The results of bioinformatics analysis showed that the full length of the P5CS gene was 2 318
bp, the open reading frame was 2 154 bp, coding 717 amino acids, the isoelectric point and the molecular weight of coded protein
were 6.57 and 77.56 kD, respectively. Nucleotide sequence Blast indicated that the Unigene of ramie shared an identity of 81%, 81%,
75% and 72% with P5CS genes of cotton, leprosy tree, Arabidopsis thaliana and rice, respectively, and the similarity in protein Blast
was 86%, 85%, 78%, and 77%, respectively. The result showed it was a homologous gene of P5CS in ramie, and named BnP5CS1.
Semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that the expression of BnP5CS1 had a higher level in stem tip than in root, and the gene
induced by the drought stress. P5CS is a key enzyme gene in the synthesis of proline in plants, so the cloning of BnP5CS1 gene might
lay a foundation for the adversity resistance molecular breeding of ramie and further function analysis.
Keywords: Boehmeria nivea; P5CS; Proline; Drought; Expression analysis
脯氨酸在植物体内有很多重要的功能, 其中之一是
作为一种结构物质即形成蛋白质, 另一种是在植物受到
环境胁迫时作为一种渗透调节物质, 维持细胞内水分、氧
化还原反应的平衡和亚细胞结构的稳定[1-2]。植物受到各
种胁迫(如干旱、高盐、低温)时, 体内大量积累脯氨酸作
为一种渗透调节物质参与环境胁迫下的应激代谢反应 ,
550 作 物 学 报 第 38卷

这已成为一个研究热点, 并已取得较大的进展[3-4]。在植
物体内, 脯氨酸的合成是通过谷氨酸和鸟氨酸两条途径
进行的, 其中谷氨酸合成途径在渗透胁迫条件下占主要
地位 , 而 Δ1-吡咯啉 -5-羧酸合成酶 (P5CS, EC 2.7.2.11/
1.2.1.41)是脯氨酸在谷氨酸合成途径中的限制酶, 当植物
中 P5CS基因受到各种环境胁迫的诱导时, P5CS的反馈调
节在控制植物处于正常和胁迫条件下脯氨酸的水平起着
重要作用[5]。P5CS基因已在甜瓜[6]、甘蔗[7]、黑麦草[8]、
野生大豆[9]、普通菜豆[10]等高等植物中被克隆, 大量研究
表明, 过表达 P5CS 基因, 能够显著提高植物的耐旱和耐
盐性。Kavi Kishor等[11]通过转基因技术在植物体内过表
达 P5CS 基因, 能够比对照植株积累更多的脯氨酸, 且其
对氧化胁迫的耐受能力明显增强。陈吉宝等[10,12]从普通菜
豆克隆了 PvP5CS1 和 PvP5CS2 基因, 发现其都受干旱、
NaCl 和低温诱导, 在拟南芥中的过表达明显改善了转基
因植株的抗旱性和耐盐性。
苎麻是荨麻科(Urticaceae)苎麻属(Boehmeria)的多年
生宿根性韧皮纤维作物, 茎叶生长茂盛, 蒸腾量大, 需水
多。缺水严重影响苎麻的生长和发育, 最终影响产量和品
质。我国苎麻主要分布于长江流域, 一般一年收 3次, 种
植面积以山地、丘陵居多, 由于缺乏灌溉条件, 山地、丘
陵苎麻往往因夏、秋干旱而使二、三麻严重减产甚至失收,
如何改善和增强苎麻的抗旱性已成为苎麻栽培、育种研究
的重要课题。苎麻体内抗旱基因的克隆和遗传转化, 将提
高苎麻的耐旱性和抗逆性[13]。目前, 在苎麻上该基因的研
究还未见相关的报道, 本研究从苎麻转录组测序中搜寻
该基因, 克隆了其全长 cDNA序列, 并对该基因进行了干
旱胁迫表达分析, 这将为后期该基因的功能验证和苎麻
的抗逆性改良分子设计育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料和试剂
湘苎 3 号由湖南农业大学耘园实验基地提供。选用
株高 10 cm左右、茎粗和叶片数基本一致的大田幼苗, 在
培养室用自来水培养 10 d, 长出幼嫩的须根后用 20%
PEG6000模拟干旱胁迫处理, 分别在处理 0、2、4、6、8
h取样, 用液氮速冻保存, 以备提取总 RNA。RLM-RACE
试剂盒购自 ABI; Trizol 购自 Invitrogen 公司 ; DNA
Maker、Taq DNA聚合酶、Transfer-T1感受态细胞购自
TransGen Biotech; 反转录试剂盒购自 Fermentas; pMD
19-T 载体购自 TaKaRa 公司; 其余试剂均为国产分析纯
或者化学纯。
1.2 引物设计
根据苎麻转录组测序结果中 P5CS 基因的序列片段,
按照 RLM-RACE试剂盒要求, 经 Primer Premier 5.0分别
设计 5′和 3′RACE 巢式 PCR 引物, 引物由北京六合华大
基因公司合成, 引物序列 5′RACE outer primer为 5-GGCC
ACTATAGAGACCCTCTACATC-3, 5-RACE inner primer为
5-CCCAGAATATACCAGAAGCATCCTC-3, 3-RACE outer
primer为 5-CTCTTGAAAATTCCACAGGCACA-3, 3-RACE
inner primer为 5-CTGATTGCATTGTAGCAGAAGACC-3。
1.3 总 RNA提取
取在组织培养室培养的湘苎 3 号水培幼苗经 20%
PEG6000胁迫诱导 6 h的根和茎尖为材料(20% PEG6000
胁迫处理 6 h, 脯氨酸含量和 SOD活性均达到最高, 结果
未发表), 参照 Invitrogen公司的 Trizol试剂盒说明书提取
混合总 RNA, 然后用 1.0%的普通琼脂糖凝胶电泳检测提
取总 RNA的完整性和纯度。
1.4 BnP5CS1基因的克隆
参照 ABI公司的 RLM-RACE试剂盒说明书, 取经过
胁迫处理的根和茎 , 提取总 RNA 进行反转录合成
5RACE和 3RACE首链 cDNA, 以 1 μL反转录产物为模
板进行第一次 PCR, 反应体系含首链 cDNA 1 μL、上下游
引物(10 μmol L–1)各 1 μL、10×buffer 2.5 μL、dNTP 1 μL、
Taq酶 0.2 μL, 加 ddH2O至 25 μL, 反应程序为 94 2 min, ℃
94 30 s℃ 、60 30 s℃ 、72 1 min, 32℃ 个循环, 72 7 min℃
反应终止于 4℃。第 2次 PCR取第一次 PCR产物 1 μL为
模板, 反应程序和体系同第一次 PCR, 结束之后, 取 10
μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收纯化 PCR产物并
连接到 pMD19-T 载体上, 转化 Trans-T1, 经 M13 引物和
槽式引物验证阳性克隆, 送华大基因测序。对测序结果进
行分析, 将获得的序列与已知的序列拼接比对获得 P5CS
基因全长 cDNA序列。
1.5 BnP5CS1基因的生物信息学分析
将 RACE 测序结果和已知的序列用 SEQUENCHER
软件拼接得到的全长 cDNA 序列, 然后利用在线分析网
站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)预测 BnP5CS1
基因的开放读码框, 并通过美国国立生物技术信息中心
网站(NCBI)对 BnP5CS1基因核苷酸序列进行 Blastn比对,
对其推测的氨基酸序列进行 Blastp 比对和保守性功能域
预测 , 最后利用 (http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)
网站分析 BnP5CS1 基因编码蛋白质的等电点和分子量,
并利用 DNAstar软件生成 BnP5CS1基因氨基酸序列的进
化树, 分析该基因的进化关系。
1.6 BnP5CS1基因表达特征分析
在田间取茎粗、株高和叶数基本一致幼苗的地上部
分 , 在培养室用自来水培养成生根的水培幼苗 , 然后用
20% PEG6000胁迫处理, 在处理之前(0 h)及处理 2、4、6
和 8 h后分别取其根和茎尖, 以及从大田取处于营养生长
期苎麻的根、茎、叶和茎尖, 参照 1.1 总 RNA 提取方法
分别提取其总RNA, 合成首链 cDNA, 根据克隆获得的全
长 cDNA序列和其他序列比对结果, 在靠近 P5CS基因序
列的羧基端设计表达引物(P5CS BD F: 5-TTAATGAATACA
AGCAGTCTCAACGA-3, P5CS BD R: 5-GCTTGTACTC
ATTCCAACCTCTG-3), 以苎麻肌动蛋白基因为内参
(Actin-F: 5-GCTCCGTTGAACCCTAAG-3, Actin-R: 5-G
CTCCGATTGTGATGATTT-3), 用半定量 RT-PCR 分析
第 3期 周精华等: 苎麻 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析 551


BnP5CS1 基因耐旱表达特征和在不同组织中的表达特异
性。反应体系含首链 cDNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、dNTP
1 μL、上下游引物(10 μmol L–1)各 1 μL, Taq酶 0.2 μL, 加
ddH2O至 25 μL。反应程序为 94 2 min; 94 30 s, 58 ℃ ℃ ℃
30 s, 72 40 s, 30℃ 个循环, 72 7 min℃ 反应终止于 4 , ℃ 反
应完成之后, 取 10 μL产物经 1.5%的琼脂糖凝胶电泳, 用
凝胶成像软件量化图片中的 PCR产物。
2 结果与分析
2.1 苎麻根和茎尖总 RNA的提取
按照 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂盒说明书提取经
20% PEG6000胁迫处理 6 h的根和茎尖混合总 RNA, 用
1.0%普通琼脂糖凝胶电泳检测提取总 RNA的完整性。从
电泳图谱上看到 RNA条带清晰, 可见 28S、18S和 5S三
条带, 且 28S 条带的亮度是 18S 的两倍(图 1), 表明 RNA
基本无降解且没有蛋白质的污染。
2.2 BnP5CS1基因的克隆
以苎麻转录组中P5CS基因片段序列为基础, 设计特
异引物应用槽式 PCR进行 5′RACE和 3′RACE, 分别获得
了长度为大约 600 bp (图 2)和 300 bp的条带(图 3), 将 PCR
产物纯化回收并连接到 pMD19-T载体上, 转化 Trans-T1,
经 M13 引物和槽式引物验证阳性克隆, 送华大基因公司
测序。将测序结果和已知的序列比对拼接获得了全长的
cDNA序列, 通过 Blast比对发现, 其与 P5CS类基因高度
相似, 将其命名为 BnP5CS1, 在 GenBank 中的登录号为:
JN852975。

图 1 苎麻根和茎尖总 RNA电泳图
Fig. 1 Electrophoresis analysis of total RNA of ramie’s root and
stem tip

2.3 BnP5CS1基因生物信息学分析
通过拼接比对, 该基因全长为 2 318 bp, 包含一个长
度为 92 bp的 5′非翻译区和 73 bp的 3′非翻译区, 其中开
放阅读框为 2 154 bp, 推测其编码一个含 717个氨基酸的
蛋白质(图 4), 推测其分子量和等电点分别为 77.567 kD
和 6.57。将该基因进行 Blast 比对分析, 发现其与亚洲棉
(EU417651.2)、麻风树(GU358610.1)、拟南芥(D32138.1)

图 2 苎麻 P5CS基因 5′RACE电泳图
Fig. 2 Electrophoresis profile of 5RACE of P5CS gene in ramie

图 3 苎麻 P5CS基因 3′RACE电泳图
Fig. 3 Electrophoresis profile of 3RACE of P5CS gene in ramie

和水稻(D49714.1)的 P5CS 基因的核苷酸序列相似性分别
为 81%、81%、75%和 72%, 蛋白质序列的相似性分别为
86%、85%、78%和 77%。对获得的 BnP5CS1开放读码框
内氨基酸序列进行保守功能域分析表明, BnP5CS1基因编
码 1 个双功能的酶, N 端含有 1 个谷氨酸激酶(G5K)的功
能域, 在 C 端有 1 个谷氨酰半醛脱氢酶(G5PR)的功能域,
G5K 功能区受脯氨酸反馈抑制 , 并能将磷酸化基团的
ATP转运到谷氨酸的 γ碳基团上, 具有一个ATP结合区和
一个谷氨酸激酶区(glu-5-kinase domain)(如图 4阴影部分
标记), 属于氨基酸激酶超家族[amino acid kinases (AAK)
superfamily]。C端的谷氨酰半醛脱氢依靠于 NADHP反应,
具有一个 NADHP结合区[NAD(P)H binding site]和 1个氨
酰半醛脱氢酶功能区(GSA-DH domain), 这些结构域说明
BnP5CS1可能在多年生苎麻脯氨酸合成中起作用。
用 BnP5CS1基因推测的氨基酸序列与具有代表性的
亚洲棉 (EU41765.2)、麻风树 (GU358610.1)、拟南芥
(D32138.1)和水稻(D49714.1)的 P5CS 基因的氨基酸序列
比对分析表明, BnP5CS1 与其氨基酸长度相近, 参比的 5
个物种间, 除亮氨酸功能区(leucine domain)外, 其他功能
区 ATP 结构域(ATP binding site)、谷氨酸激酶区(Glu-5-
kinase domain)、NAD(P)H结构域(NAD(P)H binding site),
谷氨酸半醛(GSA)结构域(GSA-DH domain)均较保守(图
5)。
采用 ClustalW分析 BnP5CS1基因推测的氨基酸序列
与亚洲棉 ( A B Z 7 9 4 0 7 )、麻疯树 ( A D K 3 7 7 5 8 )、水稻
(BAA19916)、甘蓝型油菜(AAK01360)、拟南芥(AAL87255)
552 作 物 学 报 第 38卷


图 4 BnP5CS1基因核苷酸序列和其推导的氨基酸序列
Fig. 4 Nucleotides sequence and predicted amino acids sequence of BnP5CS1 gene
阴影部分代表的 6个保守的功能域依次是 ATP结构域、亮氨酸功能域、谷氨酸激酶结构域、NAD(P)H结构域、亮氨酸功能域和谷氨酸半醛(GSA)
结构域。
The shaded part is six conservative function domains including ATP binding site, leucine domain, Glu-5-kinase domain, NAD(P)H binding site,
putative leucine domain, and GSA-DH domain.

和小麦(BAD97364) P5CS基因氨基酸序列的进化关系(图
6)表明, 所选的 P5CS 基因聚成 3 组。单子叶植物水稻、
小麦等聚在同一个组群(I); 十字花科的甘蓝型油菜和拟
南芥聚在同一个组 (II), BnP5CS1 与亚洲棉、麻疯树的
P5CS基因聚在同一个组群(III)。在这些组内 BnP5CS1与
亚洲棉的距离最近, 而与拟南芥、甘蓝型油菜的距离最
远。
2.4 BnP5CS1基因表达特征分析
分别提取大田生长的湘苎 3 号苎麻根、茎、叶片和
茎尖中的总 RNA (图 7), 并以水培苗经干旱胁迫处理 0、
2、4、6和 8 h的苎麻根和茎尖中提取总 RNA, 及肌动蛋
白做内参, 进行半定量 RT-PCR, 分析 BnP5CS1在干旱胁
迫下表达特征和在不同组织中表达的特异性。结果表明,
BnP5CS1在苎麻的根、茎、叶和茎尖中均有表达, 在茎尖
中的表达量最高 , 其次是根在中表达量较高(图 8)。在干
旱胁迫下 , BnP5CS1 基因受干旱胁迫的诱导(图 9), 在根
和茎尖中表达都上调, 但是在根中表达上调的时间早于
茎尖。
第 3期 周精华等: 苎麻 Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)基因的克隆和表达分析 553



图 5 BnP5CS1基因氨基酸序列和其他物种 P5CS基因比较分析
Fig. 5 Comparison of the deduced amino acid sequences of BnP5CS1 with other plants


图 6 BnP5CS1和其他 P5CS基因进化树分析
Fig. 6 Phylogenetic tree of BnP5CS1 and other P5CS genes


图 7 苎麻根、茎、叶和茎尖总 RNA电泳图
Fig. 7 Electrophoresis profile of total RNA of root, stem, leaf, and
stem tip of the ramie


图 8 BnP5CS1基因在苎麻根、茎、叶和茎尖表达量分析
Fig. 8 Transcription expression of BnP5CS1 in root, stem, leaf,
and stem tip of the ramie
554 作 物 学 报 第 38卷


图 9 20% PEG6000胁迫下苎麻 BnP5CS1表达特性
Fig. 9 Expression patterns of BnP5CS1 in ramie under 20%
PEG6000 stresses

3 讨论
大量研究表明, 脯氨酸是植物在受到各种非生物胁
迫时(如干旱和盐胁迫)在体内大量积累维持渗透压稳定
和氧化还原反应平衡的一种重要的物质[1,14-16]。本课题组
通过RT-PCR结合RACE技术在苎麻体内克隆到该基因的
全长 cDNA 序列, 通过保守性功能域预测和 ClustalW 多
重比对发现, 该基因推测的氨基酸序列与其他物种 P5CS
基因氨基酸序列在蛋白质结构上很类似, 且在 ATP 结合
位点、NADPH结合位点、谷氨酰激酶(GK)结构域和谷氨
酸半醛(GSA)结构域均较为的保守, 但在亮氨酸结构域差
异较大, 这与其他人的研究结果相一致[8], 也进一步证明
该基因在物种进化过程中保守性很高。
半定量 RT-PCR分析表明, BnP5CS1与 OsP5CS1[17]、
OsP5CS2[17]、 Sc-P5CS[7]基因组织表达特异性不同 ,
OsP5CS1普遍存在于生长器官和生殖器官, OsP5CS2只在
分裂细胞存在, Sc-P5CS 在茎和叶的表达基本没有差异,
在根中表达量极低, 这可能因不同物种不同组织的 P5CS
基因表达特征存在差异, 或与供试材料所处的生长发育
期和生长环境有关; 但是 BnP5CS1 和 MeP5CS 组织表达
特异性很相似[6], 在茎尖和根 2 个部位表达较高, 脱水时
该基因可能对维持根的正常吸水和分裂较旺盛细胞的结
构起很重要调节作用。
目前, 对于已克隆的植物 P5CS基因, 基本证实是植
物相应盐胁迫和干旱胁迫过程中合成脯氨酸的 1 个关键
限速酶基因[18-19], 我们发现 BnP5CS1 受干旱胁迫的诱导,
在根和茎尖中表达均上调, 但是在根中表达上调的时间
早于茎尖 , 这表明根首先感应脱水信号 , 合成相关的渗
透调节物质并将信号传递到地上部分, 诱导合成相关的
抗旱物质; 转 P5CS基因的植物能增强其在盐胁迫和干旱
胁迫条件下脯氨酸的含量 , 增强其耐受能力 [20-21], 本研
究获得的基因与上述已证明功能的基因同源性非常高 ,
将该基因转到植物中能否真正提高其耐盐和耐旱能力尚
待进一步验证。
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