全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 232−237 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRI0453); 四川省教育厅基金项目(2003A019)
作者简介: 许珂(1979−), 男, 山东菏泽人, 博士研究生, 研究方向：生物化学与分子生物学在玉米遗传育种上的应用。E-mail: xuke08@126.com
* 通讯作者(Corresponding author): 荣廷昭。E-mail: rongtz@sicau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-05-14; Accepted(接受日期): 2007-09-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00232
玉米 C型细胞质雄性不育系 C48-2及其保持系线粒体差异蛋白分析
许 珂 1 曹墨菊 1,2 朱英国 2 潘光堂 1 荣廷昭 1,*
(1四川农业大学玉米研究所/作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室, 四川雅安 625014; 2武汉大学植物发育生物学教育部重
点实验室, 湖北武汉 430072)
摘 要: 采用固相 pH梯度-SDS PAGE双向电泳, 对玉米 C型细胞质雄性不育系(C48-2)及其保持系(N48-2)单核期花
药线粒体蛋白质进行了分离, 经考马斯亮蓝染色, 得到重复性较好的双向电泳图谱。PDQUEST软件可识别约 260个
蛋白质点, 对其中 10个重复性比较好且差异表达在 2倍以上的蛋白质点, 采用基质辅助激光解析分离飞行时间质谱
进行肽指纹图谱分析, 然后用 Mascot 软件对 NCBI 数据库搜索, 其中 2 个蛋白质点被鉴定为谷氨酸脱氢酶(GDH)和
依赖电压阴离子通道蛋白-1(VDAC1)。GDH 的高表达会影响正常的氮代谢, 导致细胞的能量供应发生障碍, 有可能
导致雄性不育; VDAC1是线粒体外膜上控制细胞通透性的蛋白, 与植物的程序性死亡密切相关。
关键词: 玉米; C型细胞质雄性不育(C-CMS); 线粒体蛋白; 双向电泳
Analysis of Differential Expression of Mitochondrial Proteins between
C-Type Cytoplasmic Male Sterility Line C48-2 and Maintainer in Maize
XU Ke1, CAO Mo-Ju1,2, ZHU Ying-Guo2, PAN Guang-Tang1, and RONG Ting-Zhao1,*
(1 Maize Research Institute/Key Laboratory of Crop Genetic Resource and Improvement, Ministry of Education, Sichuan Agricultural University,
Ya’an 625014, Sichuan; 2 Key Laboratory of Ministry of Education for Plant Developmental Biology, Wuhan University, Wuhan 430072, Hubei,
China)
Abstract: Cytoplasmic male sterility (CMS) in maize (Zea mays L.) is categorized into T-CMS, C-CMS, and S-CMS types based
on the specific restoration of nuclear gene, in which C-CMS has a great application potential in maize hybrid breeding due to its
stable sterility and resistance to Helminthosporium maydis Nisik. The sterile mechanism of C-CMS is not fully understood for its
later discovery and utilization than these of T-CMS and S-CMS. The objective of the study was to give some evidences and ex-
planations to the sterility reason of C-CMS in maize by analyzing the differential expression of anther mitochondrial proteome
between a C-type sterile line (C48-2) and its maintainer (N48-2). The mitochondrial proteins in anthers of C48-2 and N48-2 were
separated firstly by two-dimensional electrophoresis with immobilized pI (3−10, non-linear) gradients and then by SDS-PAGE.
The coomassie brilliant blue-stained protein spots were analyzed using PDQUEST software, there were about 260 detectable spots
on each 2D-gel. With direct MALDI-TOF mass spectrometry analysis and protein database searching, only 2 out of 10 protein
spots were identified with significative data, which were up-regulated in mononuclear phase of C48-2. They were identified as
glutamate dehydrogenase (GDH) and voltage-dependent anion channel protein-1 (VDAC1), respectively. The GDH exists mainly
in mitochondria of higher plants and plays an important role in nitrogen metabolism. Once the GDH is up-regulated at any phase
of plant development, the normal supply of energy will be affected, probably leading to cytoplasmic sterility. The VDAC1 plays
an essential role not only in the permeability of the mitochondrial membrane, but also in apoptosis mediated by the mitochondrial
pathway. Overexpression of VDAC1 in a variety of cells induced apoptotic cell death, indicating VDAC1 as a conserved mito-
chondrial element of the death machinery. Our research suggests that the GDH and VDAC1 in mitochondria probably cause the
sterility in C-CMS in maize.
Keywords: Maize; Cytoplasmic male sterility; Mitochondrial proteins; 2-DE
第 2期 许 珂等: 玉米 C型细胞质雄性不育系 C48-2及其保持系线粒体差异蛋白分析 233


细胞质雄性不育 (cytoplasmic male sterility,
CMS)是雄性不育中最重要的一种类型, 在高等植物
中普遍存在。细胞质雄性不育容易实现不育系、保
持系和恢复系的配套, 是当前玉米育种中利用的主
要类型。玉米细胞质雄性不育的研究和利用已成为
玉米育种学的重要内容。依据核基因对育性恢复的
专效性, 将玉米 CMS分为 T-CMS、C-CMS和 S-CMS
三大类型。其中, T型不育系育性高度稳定, 但是对
玉米小斑病(Helminthosporium maydis Nisik) T小种
表现高度的专化感染; S型不育系属于配子体不育类
型, 育性稳定性较差; 而 C 型不育系兼具前两者的
优势, 因此在玉米育种中具有重要的意义。然而, 由
于 C型不育系发现较迟, 利用研究较晚, 与 T型和 S
型相比, 其不育机制研究的还不够深入。
各类型CMS的产生都和线粒体基因组的改变有
密切的联系[1]。线粒体基因组分子间重组产生正向
或反向重复序列是产生不育相关基因的直接原因。
这些嵌合基因往往产生异常的转录本和翻译产物 ,
从而干扰线粒体正常功能的发挥, 并最终导致雄性
不育。Dewey等 [2]在 1991 年发现了C-CMS线粒体
DNA中atp9-c、coxII-c和atp6-c 3 个嵌合基因, 其中
atp6-c由atp9 基因的 5′端区段、未知来源的 441 个
碱基的阅读框和截短了的atp6 基因 3 部分组成, 其
转录可能受atp9 的启动子控制, 转录的融合蛋白与
正常的atp6 相比, N端少 23 个氨基酸。由于C-CMS
线粒体中没有其他的atp6 拷贝, 所以认为atp6-c可
能编码功能蛋白, 并与C组CMS的胞质育性有关[2]。
迄今 , 对与CMS有关的多肽知之甚少 , Dewey[3]、
Levings[4]和Korth[5]等对玉米的T-urf13 蛋白与CMS
的相关性进行了分析, 但这些多肽导致CMS的原因
仍然不清楚。
双向电泳在蛋白质组学分析中应用较多, 但由
于分辨率低和重复性较差, 在分离线粒体蛋白质时
受到限制。近几年, 由于实验技术的提高, 双向电泳
可以同时展示 1 000多条多肽, 并且有较好的重复性,
完全可以应用在植物细胞质雄性不育的研究上, 已
在拟南芥[6]、水稻[7]和玉米[8]的线粒体蛋白质组学研
究上得到应用。但上述研究多是对整体的线粒体蛋
白质做分析和鉴定, 尚未见到对玉米不育系及可育
系线粒体差异蛋白质组学的报道。由于线粒体与
CMS有密切关系[1], 而玉米 C型 CMS为孢子体不育,
其败育时期是单核期[9], 以玉米单核期花药为材料,
可以富集线粒体蛋白质、提高双向电泳的分辨率 ,
从而有可能分离鉴定出与玉米 C-CMS 相关的蛋白
质。本研究旨在从蛋白质组学角度比较不育系和可
育系线粒体蛋白质的差异, 以期找到与细胞质雄性
不育相关的蛋白质, 为阐明细胞质雄性不育机制提
供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选用玉米 C型细胞质雄性不育系(C48-2)及其保
持系(N48-2), 其中不育系是与保持系回交 7 代转育
而成, 除育性外其他田间性状均与保持系一致。经
镜检确定雄穗的小孢子发育时期, 选择单核期的雄
穗, 剥取其中部花药。
1.2 方法
1.2.1 线粒体的纯化 参照 Mignouna 等[10]的方
法分离和纯化线粒体。每克植物材料加 10 mL匀浆
液(含 0.4 mol L−1甘露醇, 50 mmol L−1 Tris-HC1, pH
7.5, 1.0 mmol L−1 Na2EDTA, 5.0 mmol L−1 KCl, 0.1%
BSA, 2 mmol L−1 β-巯基乙醇), 在组织捣碎机上高
速捣碎 4次, 每次 10 s, 用 4层纱布过滤, 收集滤液,
并于 4℃下 1 300×g离心 15 min, 取上清液于 4℃下
10 600×g离心 30 min, 弃上清液。沉淀用缓冲液 A
(含 0.4 mol L−1甘露醇, 50 mmol L−1 Tris-HC1, pH 7.5,
1.0 mmol L−1 Na2EDTA, 5.0 mmol L−1 KCl )悬浮后,
1 300×g离心 15 min; 再取上清液于 4℃下 10 600×g
离心 30 min, 沉淀即为粗制线粒体。
蔗糖梯度分别为 20%、36%、52%和 60%, SW28
水平转头 4 , ℃ 100 000×g超速离心 2 h后, 吸取 38%~
52%界面的部分, 溶于 5 倍体积的缓冲液 A, 并于
4℃下 12 800×g离心 20 min, 沉淀即为纯净完整的线
粒体。
1.2.2 线粒体蛋白的提取 ①每 100 mg 线粒体
加 1 mL蛋白提取试剂 1(含 10% TCA, 0.07%巯基乙
醇, 90%丙酮), 涡旋混合后于−20℃放置 1 h; 4℃下
20 400×g离心 30 min, 弃上清液。②以 5 mL g-1的
比例加入预冷蛋白提取试剂 2(含 0.07%巯基乙醇的
丙酮), 悬浮、振荡, −20℃放置 1 h, 悬浮、振荡, 离
心同步骤①, 弃上清液。重复步骤②3次。③以 5 mL
g−1的比例加入 80%预冷丙酮, −20℃放置 1 h 以上,
离心同步骤①, 弃上清液, 将沉淀风干。④线粒体蛋
白质干粉 1 mg与 20 μL裂解液[含 7.0 mol L−1尿素,
2.0 mol L−1 硫脲, 9.0 mmol L−1 DTT, 0.8% ampho-
teric electrolyte (ampholine), 4% CHAPS]充分混合,
悬浮、振荡 2 min。⑤在液氮与 35℃水浴中交替冻融
3次, 每融一次涡旋振荡 2 min。⑥于 24℃下 20 200×g
234 作 物 学 报 第 34卷

离心 10 min。取上清液适量分装, 于−80℃保存。 排净气泡后用 1%琼脂糖凝胶封闭, 16℃循环水冷却,
用每块胶 15 mA的恒流电泳 30 min, 再换用每块胶
24 mA 的恒流电泳, 直至溴酚蓝指示剂到达距胶底
边约 1 cm处停止。采用考马斯亮蓝染色法, 脱色至
背景消失。
1.2.3 第一向固相 pH梯度等电聚焦 按 Bio-rad
公司等电聚焦系统说明进行。取出经 Bradford 法测
定浓度的 500 μg蛋白质, 加入 IPG等电聚焦槽, 将
IPG非线性 pH 3~10的干胶条去掉保护膜胶面朝下,
轻轻置于蛋白质溶液表面, 覆盖适量矿物油, 盖好
聚焦槽盖子 , 置等电聚焦仪的电极板上 , 依照
Porubleva等[11]的方法设置等电聚焦的电压, 最终总
电压时间积为 90 000 V h, 其中水化步骤在 50 V低
电压下进行 12 h, 然后经过 250 V 1 h、1 000 V 3 h、
10 000 V 5 h, 最后稳定在 10 000 V 6 h。
1.2.5 凝胶图像分析、蛋白质点的胶内酶解和肽指
纹图谱分析 考马斯亮蓝染色的凝胶经扫描仪
UMAX2100 扫描获取图像, 透射扫描, 光学分辨率
为 300 dpi, 对比度与亮度用软件默认值。用
PDQUEST 8.0分析软件对图像进行背景消减、斑点
检测、匹配和获取斑点位置坐标等。参照廖翔等[12]
的方法进行差异蛋白点的胶内酶解, 将最后获得的
抽干样品送中国军事医学科学院国家生物医学分析
中心进行肽指纹图谱分析。将质谱结果在 NCBInr
数据库(http://www.matrixscience.com)上用 MASCOT
软件进行肽指纹图谱检索。
1.2.4 第二向垂直板 SDS-PAGE电泳 等电聚焦
结束后, 迅速取出样品的 IPG胶条分别于 10 mL平
衡液 A(50 mmol L−1 Tris-HC1, pH 8.8, 6 mol L−1 尿
素, 30%甘油, 2% SDS, 200 mg DTT)和 10 mL平衡液
B(50 mmol L−1 Tris-HC1, pH 8.8, 6 mol L−1尿素, 30%
甘油, 2% SDS, 250 mg碘乙酰胺)中平衡 15 min; 然
后 IPG胶条移至 1 mm厚的连续 12%均匀分离胶上 2 结果与分析
图 1显示, 在 pI 3~10、分子量 8~85 kD范围内平 端, 并在其一端的外侧加 SDS 标准蛋白质 Marker,



图 1 保持系和不育系花药线粒体蛋白质双向电泳图谱
Fig. 1 Two-dimensional electrophoregrams of proteins isolated from mitochondrial extracts
from anther of N- and C-cytoplasm versions of the inbred line 48-2
A：N48-2; B: C48-2; C: 图 1-A中方框区域的放大图; D: 图 1-B中方框区域的放大图。
A: N48-2; B: C48-2; C: enlargement of the framed area in Fig. 1-A; D: enlargement of the framed area in Fig. 1-B.
The arrows show spots analyzed by MALDI-TOF/MS.
第 2期 许 珂等: 玉米 C型细胞质雄性不育系 C48-2及其保持系线粒体差异蛋白分析 235


均识别出约 260 个蛋白点。通过严格一致的操作,获
得了重复性很高的 2D 电泳图谱, 不育系 C48-2 和保
持系N48-2花药线粒体蛋白的 2D电泳图谱十分接近,
蛋白质大部分分布在分子量 25~85 kD、pI 4~8之间。
通过对不育系和保持系花药线粒体蛋白 2D 图
谱分析, 发现在C48-2和N48-2之间有差异, 包括量
的差异和有无的差异。将量度差异大于 2 倍的点的
差异视为量的差异; 低于 2倍的差异视为系统误差。
按照以上标准共选取了 10个重复性较好的点, 其中
点 8是仅在 N48-2中表达的点; 点 1、2、3、6、7、
9 和 10 在 C48-2 中上调表达, 点 4 和点 5 在 N48-2
中上调表达。蛋白质点 1 (spot 1)的肽指纹图谱共有
22个肽段, 经与 NCBInr数据库比对, 匹配的为 7 个
(图 2), 匹配率为 32%, 说明得到的鉴定结果是可信
的。采用 MALDI-TOF/MS 技术鉴定出 10个蛋白质
点(表 1), 点 1 和点 2 的分值(score)大于阈值 68, 而



图 2 C48-2双向电泳图谱中蛋白质点 1的肽指纹图谱
Fig. 2 Peptides mass fingerprinting of protein spot 1 in C48-2 2-DE map
从 2D胶上切下蛋白质点用胰蛋白酶消化后对酶解片段进行质谱分析, 用 Mascot软件在 NCBInr数据库中进行搜索,
该蛋白质为谷氨酸脱氢酶。※表示数据库中能匹配上的肽段。
The protein excised from gels was digested with trypsin and the resulting peptides were analyzed. Database searching using
MASCOT software against NCBInr database identified the protein as glutamate dehydrogenase.
※ indicates matched peptides by using MASCOT software against NCBInr database.
表 1 差异蛋白点的肽指纹图谱鉴定结果
Table 1 Maize anther mitochondrial proteins by peptides mass fingerprinting
表达情况 b)
Expression b)
编号
No.
登录号
Accession No.
分子量/等电点 a)
MW/pI a) N C
分值
Score
匹配蛋白
Product
所属物种
Species
1 gi|1931631 44000/5.96 + ++ 77/68 glutamate dehydrogenase Zea mays
2 gi|5929930 29630/ 7.88 + ++ 70/68 voltage-dependent anion channel protein 1b Zea mays
3 gi|115456623 48393/ 6.04 ++ + 59/68 Os03g0851100 Oryza sativa
4 gi|3063722 5355/ 9.68 ++ + 52/68 AtMYB40 Arabidopsis
5 gi|23495765 13245/ 10.51 ++ + 44/68 hypothetical protein Oryza sativa
6 gi|34394615 21983/ 7.59 + ++ 42/68 hypothetical protein Oryza sativa
7 gi|4115358 40019/ 5.18 + ++ 52/68 hypothetical protein Arabidopsis
8 gi|30685869 43869/ 6.31 + − 57/68 ATP binding ligase Arabidopsis
9 gi|2738023 20320/ 8.83 + ++ 48/68 putative ethylene receptor Brassica
10 gi|121676 59071/ 7.14 + ++ 46/68 Glutathione reductase Green plants
a)匹配蛋白质的分子量和等电点; b)－表示蛋白质点缺失, ＋表示蛋白点出现, ＋＋表示表达量增加 2倍以上。
a)Molecular weight and pI of matched protein; b)－indicates the absent protein spot, + indicates the present spot, ++ indicates the spot
with more than tow-fold expression.
236 作 物 学 报 第 34卷

其他点均未达到该阈值, 说明只有点 1 和点 2 的鉴
定结果是可信的, 而对于其他的点由于玉米线粒体
蛋白质数据库数据的不完善, 未能鉴定出有意义的
结果。
3 讨论
本试验得到的蛋白质点 1 经数据库鉴定为玉米
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase, GDH)。高等
植物的GDH主要存在于线粒体基质中, 它既能催化
铵与 α-酮戊二酸合成谷氨酸, 又能催化谷氨酸的氧
化同时释放出铵, 在植物氮代谢中起着重要作用。
GDH在不育系 C48-2中的表达量是保持系 N48-2的
2 倍以上, 说明在不育系中的 GDH 的高表达或许会
影响细胞内氮代谢的正常进行, 使细胞正常发育所
需的能量供应不足。一般认为, 在不育系中, 线粒体
功能失调 , 不能提供小孢子发育所需的足够能量 ,
导致花粉败育 [13]。本研究中不育系花药线粒体中
GDH 的高表达有可能与细胞质雄性不育的发生相
关联; 也有可能是因为花药败育引起大量蛋白质的
降解, 从而释放大量的铵, GDH 由于可以解除或缓
解植物铵中毒而被诱导表达。
蛋白质点 2 在不育系中上调表达, 被鉴定为玉
米依赖电压阴离子通道蛋白(voltage-dependent an-
ion channel protein), 和文李等[14]在水稻上的研究结
果一致。VDAC有 VDAC1、VDAC2和 VDAC3, 但
作用各不相同[15]。本研究得到的差异蛋白为 VDAC1
型。VDAC 是一种广泛分布于所有真核生物线粒体
外膜上的蛋白, 其闭合可以抑制线粒体功能, 导致
线粒体膜通透性发生改变, 释放蛋白, 如细胞色素
C、细胞凋亡因子等, 最终导致凋亡[16-17]。VDAC与
各种代谢产物如 ATP、ADP、还原型烟酰胺腺嘌呤
二核苷酸(NADH)以及阴离子、阳离子的跨线粒体外
膜转运有关 , 对线粒体及细胞功能的调节非常重
要[18]。在水稻[19]、小麦[20]、玉米[21]中已经有许多的
VDAC被分离、测序和鉴定。Li等[22]证明红莲型水
稻花粉败育过程是细胞程序化死亡(programmed cell
death, PCD)的过程。PCD过程首先也是线粒体失去
功能, 植物线粒体在 PCD 中起着介导细胞死亡信号
的作用, 线粒体膜完整性消失, 细胞色素 C 释放, 乃
至核膜完整性消失、液泡膜破裂, 最后水解酶释放
到细胞质中, 引起细胞死亡等。VDAC蛋白恰恰可以
通过控制线粒体膜的通透性来达到释放细胞凋亡因
子的作用, 从而在细胞 PCD过程中起重要作用[23]。
过量表达的 VDAC1 蛋白在老鼠[24]、人[25]和水稻[25]
中均已经被证明可以导致凋亡细胞的死亡。VDAC1
还可以独立介导细胞凋亡的发生[26]。本试验结果表
明, 玉米 C 型雄性不育系中线粒体内的 VDAC1 的
高表达可能与花粉 PCD过程有关。差异蛋白质究竟
是导致细胞质雄性不育的原因还是结果 , 尚难定
论。我们将在利用同一核背景不育系和保持系的基
础上, 增加恢复系材料, 进一步研究差异蛋白质的
表达, 以探明导致雄性不育的真正原因。目前仍有
一些二维电泳技术无法根本解决的难题, 如：低丰
度蛋白质点的检测、极酸和极碱性蛋白质的提取、
高分子质量区蛋白的分离、膜蛋白的提取和有效分
离等; 加之玉米线粒体蛋白质数据库数据的不完备,
所获得的一些差异表达蛋白质不能被鉴定出有意义
的结果。所以差异蛋白质与细胞质雄性不育关系的
研究, 尚有待于相关技术的改进和玉米线粒体蛋白
质组学基础研究的进一步深入。
4 结论
首次利用差异蛋白质组学技术, 对玉米 C 型不
育系及保持系的单核期花药线粒体蛋白质进行分析,
发现谷氨酸脱氢酶和依赖电压阴离子通道蛋白在单
核期不育系的增强表达同 CMS密切相关。这一初步
结果还无法解释 CMS的不育机机制, 但为进一步开
展玉米 C型 CMS不育机制的研究打下了基础。
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