全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(4): 565−570 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 农业部“发展棉花生产专项资金”项目; 国家高技术研究发展计划(863计划) (2003AA211050)项目
作者简介: 管敏(1981−), 女, 江苏溧阳人, 硕士研究生, 研究方向为植物基因工程。E-mail: guanmin1981@yahoo.com.cn。
*
通讯作者(Corresponding author): 郭三堆(1957–), 男, 山西晋城人, 研究员, 研究方向为植物基因工程。
E-mail: gsdui@mail.caas.net.cn
Received(收稿日期): 2007-06-15; Accepted(接受日期): 2007-10-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00565
棉花 arf1启动子驱动 Cry1A基因在烟草中特异性表达研究
管 敏 崔洪志 张 锐 郭三堆*
(中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081)
摘 要: 在新一代 Bt作物以及 Bt作物安全性研究方面, Bt毒蛋白在植物特定发育阶段的表达特性渐受关注。本研究
构建了植物表达载体 pGBI121.A1Bt, 其携带棉花 arf1 启动子驱动 Cry1A 基因的表达盒, 启动子后面有一个 Ω 序列;
对照载体 pGBI121.4AB携带 P2E35S启动子(增强子加倍的修饰 CaMV 35S启动子)驱动 Cry1A基因的表达盒, 在启动
子后面也有一个 Ω 序列。利用根癌农杆菌介导法, 将植物表达载体 pGBI121.4AB 和 pGBI121.A1Bt 转化烟草, 分别
获得 44株和 42株转基因烟草再生植株。ELISA检测表明, 在 pGBI121.A1Bt转基因烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶
中 Cry1A基因的平均表达水平分别为 pGBI121.4AB的 1.5、1.5、1.4和 0.3倍。棉花 arf1启动子在烟草中表达, 证明
了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性, 为 arf1启动子应用于转基因抗虫棉, 在棉花蕾铃中优势表达 Bt毒
蛋白, 提高转基因棉花蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究提供了依据。
关键词: arf1启动子; 转基因烟草; 抗虫
Specific Expression of Cry1A Gene Driven by Cotton arf1 Promoter in
Tobacco
GUAN Min, CUI Hong-Zhi, ZHANG Rui, and GUO San-Dui*
(Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract: The expression of Bt toxin in certain plant developmental period, certain quantity or certain organ in the transgenic
plant is an important study field both in new generation of Bt crops and biosafty of Bt crops. Promoter plays a key role to control
foreign gene’s expression feature. Previous study analyzed the function of a promoter, which is cotton ADP-ribosylation factor 1
(arf1) gene’s promoter, cloned in our laboratory. A plant expression vector pGBI121.A1Bt, which contained the Cry1A gene under
the control of cotton arf1 promoter and the Ω factor, was constructed. Used as control, another vector pGBI121.4AB, carryies
Cry1A gene driven by P2E35S promoter, which is modified CaMV 35S promoter with doubled enhancers and a Ω factor. By agro-
bacteria mediated transformation, tobacco was transformed by the two kinds of vector respectively. ELISA assay showed that the
average expression level of the Cry1A gene in the capsule, capsular hull, petal and leaf of pGBI121.A1Bt transgenic tobacco
plants was 1.5, 1.5, 1.4, and 0.3 times of the that of pGBI121.4AB transgenic tobacco plants. The results suggest that arf1 pro-
moter could drive foreign gene expression well in plant propagation organs. Therefore, we think arf1 promoter could be applied in
the development of new generation of Bt cotton, which has better cotton bollworm resistant effect for expressing more Bt toxin in
cotton boll.
Keywords: arf1 promoter; transgenic tobacco; Insect-resistance
虫害一直是棉花生产中的一大危害, 采取有效
措施至关重要。目前, 除普遍采用化学杀虫剂外, Bt
转基因抗虫棉已经在我国棉区普遍推广。苏云金芽
孢杆菌(Bacillus thuringiensis, 简称 Bt) 毒蛋白基
因是广泛应用的抗虫基因。本实验室人工合成了全
长 1 824 bp的 Cry1Ab和 Cry1Ac融合 GFM Cry1A
566 作 物 学 报 第 34卷

杀虫基因, 对鳞翅目害虫如棉铃虫等具有特异的杀
虫活性, 在我国转基因抗虫棉的应用中发挥了重要
作用[1]。近年来, 大量文献报道转 Bt基因棉对棉铃
虫的抗性呈时空动态变化。普遍认为其根本原因是
Bt基因表达强度在不同器官中存在差异, 营养器官
高于生殖器官 [2-7]。而棉铃虫主要危害棉花的蕾铃,
因此, 如何调控 Bt 基因在花蕾等生殖器官中的高
表达强度是转基因抗虫棉研究的一个重要思路。
启动子在基因表达调控中起关键作用, 在很大
程度上决定目的基因表达的特性。采用特异性启动
子使外源基因能够定时、定点、定量地在植物中表
达是植物基因工程研究的重要内容, 这就需要分离
克隆诱导型启动子和组织特异性启动子[8-10]。
本实验室前期工作所构建的 Cry1A 杀虫基因
植物表达载体 pGBI121.4AB 中所用启动子为
P2E35S, 为增强子加倍的修饰 CaMV35S 启动子。
对 Cry1A 基因表达进行调控的其他表达调控序列
还包括 5端 Ω 序列、Kozak 序列 , 3端多联终止序
列、正确加工和切割序列、Poly(A)序列以及 Nos
终止子; 此外还分离到棉花腺苷酸核糖基化作用因子
1 (arf1)启动子, 构建了植物表达载体 pBIA1GUS[11-12],
并初步证明该启动子具有蕾铃优势表达的特性。
本研究利用 arf1 启动子构建了植物表达载体
pGBI121.A1Bt, 证明其在转基因烟草中具有生殖器
官优势表达的特性。为进一步将其应用于棉花抗虫
基因工程, 解决抗虫棉后期抗虫弱的生产问题提供
了理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 烟草(Nicotiana tobacum L.)品
种 NC89。用无菌培养的 4~5叶期幼苗的叶片作转化
的外植体。
1.1.2 菌株和质粒 大肠杆菌(Escherichia coli)
DH5α, 根癌农杆菌菌株(Agrobacterium tumefaciens)
LBA4404, 质粒 pBIA1GUS、pG4AB、pGBI121.4AB
均由本实验室构建或保存。
1.1.3 酶及有关试剂 各种限制性内切酶、DNA
修饰酶、T4 DNA 连接酶等均购自 Biolabs 公司或
Promega 公司; DNA 聚合酶购自北京天为时代公司;
ELISA 分析试剂盒由中国农业大学化学控制中心
制备。
1.2 方法
1.2.1 质粒 pGBI121.A1Bt的构建 用 BamH I酶
切质粒 pG4AB, Klenow大片段补平后, 再用 EcoR I
酶切, 回收约 2.3 kb的 GFM Cry1A片段; 用 Sma I
和 EcoR I双酶切质粒 pBIA1GUS, 回收约 11.3 kb的
载体片段; 把两个片段定向连接, 构建了植物表达
载体 pGBI121.A1Bt, 该载体携带 parf1-Ω-Cry1A-
Tnos结构。
1.2.2 烟草转化及再生 使用 BIO-RAD 公司的
电激仪将植物表达载体 pGBI121.4AB 和 pGBIA1Bt
按照产品说明书分别导入根癌农杆菌菌株
(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404中。以第 4~5
叶期的无菌培养烟草 NC89 叶片作为转化受体, 采
用叶盘法[13]转化烟草并再生获得转基因烟草。
1.2.3 转基因植株的PCR检测 采用CTAB方法[14],
分别从转化植株和非转化植株叶片中提取 DNA 模
板, CaMV35S启动子驱动 Cry1A基因表达的检测采
用 CaM35S 启动子序列 5′-GATATCTCCACTGAC
GTAAGGGATG-3′(35SFP)为上游引物, 基因特异序
列 5′-CCAATCAGCCTAGTAAGGTCGTTG-3′(BRP1)
为下游引物, 预期 PCR 扩增片段为 700 bp; 棉花
arf1 启动子驱动 Cry1A 基因表达的检测采用棉花
arf1 启动子序列 5′-TCCCTAATGATATTGTTCATG
TAATTAAGT-3′ (AFP)为上游引物, 基因特异序列
5′-TCTTTTGCACTGTGAATGATTAGAATAATT-3′
(BRP2)为下游引物, 预期 PCR扩增片段为 900 bp。
引物由上海生工公司合成。反应程序为: 94℃ 预变
性 10 min; 94℃ 45 s, 65℃~55℃退火 45 s, 72℃延伸
1 min, 每降 2℃重复 2个循环, 94℃ 45 s, 52℃退火
45 s, 72℃延伸 1 min, 重复 24个循环, 72℃保温 10
min, 用 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.2.4 样品采集和处理 各选取生长较旺盛的且
BT 试纸条检测为阳性的 20 株植株, 在陆续开花、
结果时(100 d)取样, 取每株同样部位(倒第 4叶和倒
第 5叶)烟草叶片, 去其叶脉称取 1.0 g, 加 2 mL提
取液研磨, 离心后取上清测定。对花进行标记, 尽量
取同一生长时期的花瓣, 称取 1.0 g, 加 2 mL提取液
研磨, 离心后取上清测定。取大致在同一生长时期
的蒴果, 称取 0.5 g, 加 1 mL提取液研磨, 离心后取
上清测定。剥下较成熟的烟草蒴果的壳, 称取 0.5 g,
加 1 mL提取液研磨, 离心后取上清测定。
1.2.5 Bt 毒蛋白的 ELISA(enzyme linked immu-
nosorbent analysis)检测 Bt毒蛋白标准品、Bt毒
第 4期 管 敏等: 棉花 arf1启动子驱动 Cry1A基因在烟草中特异性表达研究 567


蛋白抗体由中国农业大学化学控制中心制备[15]。按
王保民等方法[16]配制试剂, 进行 Bt毒蛋白的测定。
1.2.6 数据统计分析 应用 Excel 进行分析与作
图, 采用 SAS软件进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 植物表达载体的构建
用载体 pG4AB 上的 Cry1A 基因替换了
pBIA1GUS 上的 gus 基因, 从而构建成由棉花蕾铃
优势表达启动子 Parf1 和Ω序列驱动 Cry1A 基因表
达的植物表达载体 pGBI121.A1Bt (见图 1-B)。与对
照植物表达载体 pGBI121.4AB相比, 除使用 arf1启
动子替换了 P2E35S启动子外, 其他序列完全相同。
2.2 转基因烟草植株的获得
植物表达载体经叶盘法转化烟草后, 共获得 68
株转 pGBI121.4AB的转基因烟草和 61株转 pGBI121.
A1Bt 的转基因烟草, 移栽后成活数分别为 46 株和
50株, 移栽成活率分别为 67.64%和 81.97%。植株移

图 1 植物表达载体的结构
Fig. 1 Structure of plant expression vector
A: 对照质粒 pGBI121.4AB; B: 构建质粒 pGBI121.A1Bt。
A: control plasmid pGBI121.4AB; B: construct plasmid pGBI121.A1Bt.

栽后 100 d左右, 开始陆续开花、结果, 果实完全成
熟后收获种子。
2.3 转基因烟草的 PCR检测
对所获得的转基因烟草进行 PCR 分析, 重复 3
次。利用 CaMV35S 启动子序列设计正向引物
(35SFP)、GFM Cry1A基因设计反向引物(BPR1), 以
质粒 pGBI121.4AB 为阳性对照 , 对 46 株转
pGBI121.4AB 烟草植株进行 PCR 检测, 结果在 44
株转基因烟草中扩增到和阳性质粒一样约 700 bp的
特异性片段, 而作为阴性对照的非转基因烟草样品
未扩增出任何条带(部分检测结果见图 2)。同样, 正

图 2 部分转 pGBI121.4AB烟草植株的 PCR扩增分析
Fig. 2 PCR analysis of part transgenic tobacco plants trans-
formed with pGBI121.4AB
1: 阳性对照 pGBI121.4AB; 2: 非转化植株; 3~12: 转化植株。
1: positive control pGBI121.4AB; 2: nontransgenic plant; 3–12:
transgenic plants.
向引物(AFP)利用棉花 arf1启动子中的一段序列、反
向引物(BRP2)为 GFM Cry1A基因特异引物, 以质粒
pGBI121.A1Bt DNA为阳性对照, 在检测的 50株转
pGBI121.A1Bt 烟草植株中, 发现 42 株可扩增出和
阳性对照一致的约 900 bp 的特异性片段(部分检测
结果见图 3)。

图 3 部分转 pGBI121.A1Bt烟草植株的 PCR扩增分析
Fig. 3 PCR analysis of part transgenic tobacco plants trans-
formed with pGBI121.A1Bt
1: 阳性对照 pGBI121.A1Bt; 2: 非转化植株; 3~12: 转化植株。
1: positive control pGBI121.A1Bt; 2: nontransgenic plant; 3–12:
transgenic plants.

2.4 Cry1A基因在转基因烟草中的表达情况
用 BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测条对 PCR阳性
植株进行 Bt蛋白表达情况检测, 并在两类转基因烟
568 作 物 学 报 第 34卷

草中各选取 20株检测结果为阳性, 且长势正常、较
均一的植株, 对花进行挂牌标记, 尽量取植株同一
生长时期的蒴果、蒴果壳、花瓣和叶子进行 ELISA
分析。计算 20 株转基因烟草不同部位 Bt 毒蛋白含
量的平均值, 结果发现, 转 pGBI121.A1Bt 烟草在蒴
果 , 蒴果壳和花瓣中的 Bt 表达量要高于转
pGBI121.4AB 的烟草 , 而在叶中的情况恰好相反
(图 4)。

图 4 不同启动子在烟草各组织中驱动 GFM Cry1A基因表达的
ELISA定量分析
Fig. 4 ELISA quantification analysis of the GFM Cry1A ex-
pression level in different transgenic tobacco tissues
图中数据为 20株转基因烟草中不同部位 Bt毒蛋白平均表达量。
The data is the average Bt protein contents of 20 transgenic tobacco
plants in the different tissues.

2.4.1 不同转基因烟草叶中 Bt毒蛋白表达量比较
不同的转基因植株叶中 Bt蛋白的表达量存在差
异, 20株 pGBI121.4AB转基因烟草叶中 Bt毒蛋白的
平均表达量为 298.76 ng g−1, 转 pGBI121.A1Bt烟草
叶中 Bt毒蛋白的平均表达量为 84.60 ng g−1, 是对照
转 pGBI121.4AB 烟草的 0.3 倍; 转 pGBI121.A1Bt
和转 pGBI121.4AB中的最高表达量分别为 266.28 ng
g−1和 609.59 ng g−1, 前者是后者对照的 0.4倍。
2.4.2 不同转基因烟草花瓣中 Bt 毒蛋白的表达情
况比较 20 株对照 pGBI121.4AB 转基因烟草花
瓣中 Bt 毒蛋白平均表达量为 216.54 ng g−1, 转
pGBI121.A1Bt 烟草花瓣中的平均表达量为 313.32
ng g−1, 是对照的 1.4 倍 ; 转 pGBI121.A1Bt 和转
pGBI121.4AB中的最高表达量分别为 810.06 ng g−1
和 544.31 ng g−1, 前者是对照的 1.6倍。
2.4.3 不同转基因烟草蒴果中 Bt 毒蛋白的表达情
况比较 20 株对照 pGBI121.4AB 转基因烟草蒴
果中 Bt 毒蛋白平均表达量为 558.02 ng g−1, 转
pGBI121.A1Bt烟草蒴果中的平均表达量为 1 325.38
ng g−1, 是对照的 2.4 倍 ; 转 pGBI121.A1Bt 和转
pGBI121.4AB 中的最高表达量分别为 2 625.53 ng
g−1和 1 109.58 ng g−1, 前者是对照的 2.4倍。
2.4.4 转化不同载体的烟草蒴果壳中 Bt 毒蛋白的
表达情况比较 15 株对照 pGBI121.4AB 转基因
烟草蒴果壳中 Bt毒蛋白平均表达量为 359.41 ng g−1,
转 pGBI121.A1Bt 烟草蒴果壳中的平均表达量为
531.81 ng g−1, 是对照的 1.5倍; 转 pGBI121.A1Bt和
转 pGBI121.4AB中的最高表达量分别为 1 335.54 ng
g−1和 866.28 ng g−1, 前者是对照的 1.5倍。
2.4.5 差异显著性分析 对 P2E35S 启动子和
arf1 启动子分别驱动外源杀虫基因在烟草中表达的
组织特异性差异进行了显著性分析, 从表 1 可以看
出, 在烟草蒴果中, 两者差异极显著; 在蒴果壳中, 两
者差异显著; 在烟草花瓣中, 两者差异显著; 在烟草
叶中, 两者差异极显著。结果表明, 与 P2E35S启动子
相比, 棉花 arf1启动子驱动GFM Cry1A基因在烟草的
蒴果、蒴果壳、花瓣中表达量较高, 而在叶中较低。

表 1 不同启动子驱动外源杀虫基因在烟草中表达的差异显著性分析
Table 1 Significance and difference of Bt proteins in different transgenic tobacco plants
显著水平 Level of significance 器官
Tissue
启动子
Promoter
平均 Bt毒蛋白含量
Average Bt protein contents (ng g−1) 0.05 0.01
CaMV35S 558.02 B B
蒴果 Capsule
arf1 1325.38 A A
CaMV35S 359.41 B A
蒴果壳 Capsular hull
arf1 531.81 AB A
CaMV35S 216.54 B A
花瓣 Petal
arf1 313.32 AB A
CaMV35S 298.76 A A
叶 Leaf
arf1 84.60 B B

第 4期 管 敏等: 棉花 arf1启动子驱动 Cry1A基因在烟草中特异性表达研究 569


3 讨论
目前在植物基因工程中广泛应用的启动子是组
成型启动子, 例如, 绝大多数双子叶转基因植物均
使用 CaMV35S 启动子, 单子叶转基因植物主要使
用来自玉米的 Ubiquitin 启动子和来自水稻的 Actin
启动子。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用,
同时又可减少对植物的不利影响, 对组织、器官特
异表达启动子的研究就显得尤为重要。Mariani等将
烟草花药绒毡层特异启动子 TA29 与核酸酶基因
Barnase, RnaseT1融合后转化植物, 核酸酶基因在花
药中特异表达, 破坏绒毡层, 获得了雄性不育烟草
和油菜[17-18], 开创了基因工程创造雄性不育系的先
河。目前对双子叶植物启动子研究最多的是番茄 ,
其中最深入的是 E4、E8、PG(多聚半乳糖醛酸酶)和
2A12 基因的启动子。毛自朝等[19]用 PCR 方法获得
了番茄果实专一性启动子(2A12), GUS 组织化学活
性分析表明, 2A12启动子具有严格的果实表达专一
性。本实验室分离到棉花生殖器官优势表达的 arf1
启动子, 通过 GUS 组织化学分析, 以 35S 启动子为
对照, 在棉花的生殖器官中, arf1 启动子的活性是
35S启动子的 5.0倍, 而在棉花叶中, 35S启动子的活
性是 arf1启动子的 6.3倍[12]。
本研究发现不同转基因植株个体之间杀虫蛋白
表达水平存在明显差异。尽管分子检测证明外源基
因均整合到烟草的基因组中, 但转化同一表达载体
所获得不同转化事件的转基因植株之间目的基因表
达水平差异很大。一般认为, 外源抗虫基因在宿主
细胞基因组中的整合情况不同是其差异表达的最根
本原因。对拷贝数一致的不同转化事件进行表达水
平比较, 以及对不同表达水平个体的整合位点分析
有助于进一步分析造成这种表达差异的原因。
将构建好的植物表达载体导入模式植物烟草中
进行研究, 可为以后在棉花基因工程中的应用奠定基
础。本试验 ELISA检测表明, arf1启动子可驱动杀虫
基因在转基因烟草植株的蒴果、蒴果壳和花瓣中比
P2E35S启动子表达更高, 而在叶中较低。由于棉铃虫
对棉花产量的主要威胁来自对花、蕾和铃等生殖器官
的危害, 因此利用植物表达载体 pGBI121.A1Bt 应用
于抗虫转基因棉花研究值得尝试。
4 结论
成功构建了由 arf1 启动子驱动杀虫基因表达的
植物表达载体, 在烟草中验证了 arf1 启动子的生殖
器官优势表达特性: 转化 Parf1-Cry1A表达盒的烟草
在蒴果中的 Bt 蛋白表达量是 P2E35S-Cry1A 对照的
2.4 倍, 差异极显著; 在蒴果壳中是对照的 1.5 倍,
差异显著; 在花瓣中是对照的 1.4 倍, 差异显著; 而
在叶中是对照的 0.3倍, 差异极显著。
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