全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(7): 1244−1252 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由河南省高校杰出人才创新工程项目(HAIPURT, 2007KYCX009)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 李锁平, E-mail: lisuoping@henu.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: susuya1981@163.com
Received(收稿日期): 2008-12-04; Accepted(接受日期): 2009-02-17.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01244
黄河中游粗山羊草三种 y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统
进化分析
苏亚蕊 张大乐 张 明 李锁平*
河南大学农业生物技术研究所, 河南开封 475001
摘 要: 粗山羊草(Aegilops tauschii, 2n = 2x = 14, DD)是六倍体普通小麦的祖先之一 , 其高分子量谷蛋白亚基
(HMW-GS)变异类型丰富, 是小麦品质改良的重要基因资源。利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
分析了黄河中游地区 161份粗山羊草的HMW-GS, 发现 3种编码序列未知的 y-型亚基, 即Dy10.5t、Dy10.4t和Dy10.5*t
亚基。通过 AS-PCR扩增、克隆、测序和氨基酸序列推导, 发现 3种未知序列均具有典型 HMW-GS的序列结构特征
且较为相似, 仅 Dy10.4t与 Dy10.5t亚基存在一个氨基酸重复单元的缺失, Dy10.5t与 Dy10.5*t亚基在信号肽部位有一
个氨基酸的替换(L−F)。通过对这 3种 HMW-GS与 32个已知氨基酸序列的 HMW-GS多序列比对和系统进化关系分
析, 证实 Dy10.5t、Dy10.4t和 Dy10.5*t亚基是 D基因组编码的高分子量谷蛋白 y-型亚基家族的新成员。
关键词: 粗山羊草; 高分子量谷蛋白; 分子克隆; 系统进化
Characterization, Molecular Cloning, and Phylogenetic Analysis of Three
y-Type High Molecular Weight Glutenin Subunit Genes from Aegilops tauschii
of the Middle Reaches of Yellow River
SU Ya-Rui, ZHANG Da-Le, ZHANG Ming, and LI Suo-Ping*
Institute of Agricultural Biotechnology, Henan University, Kaifeng 475001, China
Abstract: Aegilops tauschii (2n = 2x = 14, DD), an ancestral specie of Tiriticum aestivum (2n = 6x = 42, AABBDD), possesses
extensive allelic variation in high molecular weight glutenin subunits (HMW-GS). The elite genetic recourses are of great value in
quality improvement of T. aestivum. Ae. tauschii is distributed in the middle reaches of Yellow River, and its HMW-GS genes
have not been investigated in large scales. To detect HMW-GS genes in Ae. tauschii resources in this area and to understand its
structure and function by sequencing, 161 Ae. tauschii accessions collected in July 2006 were used in this study with Yumai 49 as
a control. Through sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) technique, three y-type subunits
were observed, named as Dy10.5t, Dy10.4t , and Dy10.5*t. Genes of the three subunits were amplified, cloned and sequenced by
allele-specific PCR. The results revealed that the deduced amino acid sequence had typical characteristics of HMW-GS and a
general resemblance to each other, but Dy10.4t had a repeated amino acid motif deletion to Dy10.5t, and Dy10.5*t had an amino
acid substitution sites in signal peptide domain to Dy10.5t (L−F). From multiple sequence alignment and phylogenetic analysis of
storage protein gene family, it is concluded that the subunits Dy10.5t, Dy10.4t, and Dy10.5*t from Ae. tauschii are similar to the
Glu-1 locus found in wheat and related species, and are new members of y-type HWM glutenin family.
Keywords: Aegilops tauschii; HWM-GS; Molecular cloning; Phylogenetic relationships
麦谷蛋白是小麦贮藏蛋白中的主要成分, 由高
分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亚
基(LMW-GS)两部分组成 , 其中高分子量麦谷蛋白
由 3 个基因位点(Glu-1A、Glu-1B 和 Glu-1D, 统称
Glu-1)编码[1]。每一个基因位点含有两个基因, 一个
编码分子量较高的 x-型亚基, 另一个编码分子量较
低的 y-型亚基, 它们与小麦的加工品质紧密相关[2]。
粗山羊草(Aegilops tauschii Cosson, 2n = 2x = 14, DD)
第 7期 苏亚蕊等: 黄河中游粗山羊草三种 y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统进化分析 1245


是六倍体普通小麦(Tiriticum aestivum L., 2n = 6x =
42, AABBDD) D基因组的供体种。由于仅有特定区
域的少数粗山羊草基因型参与了普通小麦的起源 ,
其遗传变异类型远比普通小麦 D染色体组丰富[3-5]。
前人研究发现粗山羊草 HMW-GS 有众多变异类型,
且大多为普通小麦中尚未发现的新类型[6-10]。深入
研究粗山羊草 HMW-GS, 特别是对其编码基因的测
序, 对于进一步研究其结构功能以及在小麦品质改
良中的应用具有非常重要的意义[11]。黄河中游地区
自然分布着粗山羊草, 但尚未对其大规模深入研
究。本研究利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
泳(SDS-PAGE)对采自黄河中游地区的 161份粗山羊
草的 HMW-GS进行分离和鉴定, 发现 3种编码序列
未知的 y-型亚基, 通过等位基因特异 PCR(AS-PCR)
对其编码基因进行分子克隆、序列分析, 进而分析
高分子量谷蛋白亚基家族的分子进化关系, 为有效
利用这些材料提供了更多的资料, 并为研究小麦族
相关物种的起源和进化提供了信息。
1 材料与方法
1.1 试验材料
利用河南大学农业技术研究所 2006年 7月在黄
河中游地区野外采集的 161 份粗山羊草材料(表1),
分别对每份材料进行编号。以麦谷蛋白亚基标准品

表 1 161份供试粗山羊草的来源
Table 1 Origins of 161 accessions of Ae. tauschii used in the study
编号
Code
来源
Origin
编号
Code
来源
Origin
编号
Code
来源
Origin
编号
Code
来源
Origin
T002 Lingbao, Henan T042 Mengzhou, Henan T082 Fengqiu, Henan SX-6 Weinan, Shaanxi
T003 Lingbao, Henan T043 Mengzhou, Henan T084 Fengqiu, Henan SX-8 Weinan, Shaanxi
T004 Shanxian, Henan T044 Mengzhou, Henan T085 Changyuan, Henan SX-9 Weinan, Shaanxi
T005 Sanmenxia, Henan T045 Mengzhou, Henan T086 Changyuan, Henan SX-10 Weinan, Shaanxi
T006 Mianchi, Henan T046 Mengzhou, Henan T087 Changyuan, Henan SX-11 Xianyang, Shaanxi
T007 Mianchi, Henan T047 Mengzhou, Henan T088 Changyuan, Henan SX-12 Xianyang, Shaanxi
T008 Mianchi, Henan T048 Mengzhou, Henan T089 Puyang, Henan SX-13 Yanliang, Shaanxi
T009 Yima, Henan T049 Mengzhou, Henan T090 Puyang, Henan SX-14 Lantian, Shaanxi
T010 Yima, Henan T050 Wenxian, Henan T091 Puyang, Henan SX-15 Yanliang, Shaanxi
T011 Yima, Henan T051 Wenxian, Henan T092 Puyang, Henan SX-16 Pucheng, Shaanxi
T012 Lushi, Henan T052 Wenxian, Henan T093 Puyang, Henan SX-17 Pucheng, Shaanxi
T013 Lushi, Henan T053 Wenxian, Henan T094 Puyang, Henan SX-18 Yanliang, Shaanxi
T014 Lushi, Henan T054 Wenxian, Henan T095 Puyang, Henan SX-19 Pucheng, Shaanxi
T015 Lushi, Henan T055 Wenxian, Henan T096 Puyang, Henan SX-20 Yanliang, Shaanxi
T016 Lushi, Henan T056 Wenxian, Henan T097 Puyang, Henan SX-21 Yanliang, Shaanxi
T017 Luanchuan, Henan T057 Wenxian, Henan T098 Puyang, Henan SX-22 Pucheng, Shaanxi
T018 Luanchuan, Henan T058 Wenxian, Henan T099 Puyang, Henan SX-23 Pucheng, Shaanxi
T019 Luoning, Henan T059 Wenxian, Henan T100 Puyang, Henan SX-24 Yanliang, Shaanxi
T020 Luoning, Henan T060 Wenxian, Henan T101 Fanxian, Henan SX-25 Yanliang, Shaanxi
T021 Luoning, Henan T061 Wenxian, Henan T102 Fanxian, Henan SX-26 Jingyang, Shaanxi
T022 Yiyang, Henan T062 Wenxian, Henan T103 Fanxian, Henan SX-27 Jingyang, Shaanxi
T023 Luoyang, Henan T063 Wenxian, Henan T104 Taiqian, Henan SX-28 Sanyuan, Shaanxi
T024 Jiyan, Henan T064 Wenxian, Henan T105 Taiqian, Henan SX-29 Jingyang, Shaanxi
T025 Jiyan, Henan T065 Wenxian, Henan T106 Taiqian, Henan SX-30 Sanyuan, Shaanxi
T026 Jiyan, Henan T066 Wenxian, Henan T107 Taiqian, Henan SX-31 Sanyuan, Shaanxi
T027 Qinyang, Henan T067 Wenxian, Henan T108 Taiqian, Henan SX-32 Tongchuan, Shaanxi
T028 Qinyang, Henan T068 Wenxian, Henan T109 Taiqian, Henan SX-33 Tongchuan, Shaanxi
T029 Qinyang, Henan T069 Wenxian, Henan T110 Dongming, Shandong SX-34 Tongchuan, Shaanxi
T030 Qinyang, Henan T070 Wenxian, Henan T111 Dongming, Shandong SX-35 Chengxian, Shaanxi
T031 Qinyang, Henan T071 Wenxian, Henan T112 Dongming, Shandong SX-36 Huangling, Shaanxi
T032 Qinyang, Henan T072 Wenxian, Henan T113 Dongming, Shandong SX-37 Fengyuan, Shaanxi
T033 Wuzhi, Henan T073 Yuanyang, Henan T114 Dongming, Shandong SX-38 Chengcheng, Shaanxi
T034 Wuzhi, Henan T074 Yuanyang, Henan T115 Dongming, Shandong SX-39 Yongfeng, Shaanxi
T035 Wuzhi, Henan T075 Yuanyang, Henan T116 Lankao, Henan SX-40 Heyang, Shaanxi
T036 Mengzhou, Henan T076 Yanjin, Henan T117 Lankao, Henan SX-41 Chengcheng, Shaanxi
T037 Mengzhou, Henan T077 Yanjin, Henan SX-1 Lantian, Shaanxi SX-42 Yongfeng, Shaanxi
T038 Mengzhou, Henan T078 Yanjin, Henan SX-2 Lantian, Shaanxi SX-43 Chang’an, Shaanxi
T039 Mengzhou, Henan T079 Yanjin, Henan SX-3 Lantian, Shaanxi SX-44 Chang’an, Shaanxi
T040 Mengzhou, Henan T080 Fengqiu, Henan SX-4 Weinan, Shaanxi SX-45 Lintong, Shaanxi
T041 Mengzhou, Henan T081 Fengqiu, Henan SX-5 Weinan, Shaanxi SX-46 Lintong, Shaanxi
SX-47 Lintong, Shaanxi
1246 作 物 学 报 第 35卷

种豫麦 49(1, 7+9, 5+10)和西安 8号(1, 6+8, 2+12)作
对照。
1.2 麦谷蛋白的提取和 SDS-PAGE
样品的提取以及SDS-PAGE 电泳技术参照孙
辉等[12]的方法。每份材料随机取3粒进行单粒种子的
HMW-GS组成分析。参照William等[4]、Gianibelli等[13]
和Yan等[14]文献命名亚基。
1.3 基因组 DNA提取和 PCR扩增
选择具有不同亚基类型的粗山羊草材料 T002、
T006 和 T054, 用 CTAB 法[15]提取基因组 DNA。
HMW-GS的N-端和C-端序列高度保守, 根据已知D
染色体组高分子量谷蛋白基因的序列, 运用 Primer
Premier 5.0软件设计一组引物, S1: 5-ATGGCTAAG
CGGTTA(G)GTCCTCTTTG-3; S2: 5-CTATCACTG
GCTG(A)GCCGACAATGCG-3(括号中为简并碱
基), 由大连宝生物公司合成。PCR体系为 50 μL, 含
2.5 U Ex Taq 酶(TaKaRa公司), 200 ng模板 DNA, 5
μL 10×Ex buffer, 0.4 mmol L−1 dNTP, 每条引物 0.5
μmol L−1。反应程序为 94℃预变性 3 min; 然后 94
℃变性 1 min, 65℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min, 35个
循环; 最后 72℃延伸 10 min。
1.4 目的基因的克隆、测序
PCR 产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分离 , 用
DNA 凝胶回收试剂盒 Ver2.0 (TaKaRa 公司)对目的
片段进行回收。将回收的 PCR 产物与 PMD-19T
vector (TaKaRa公司)连接, 转化大肠杆菌 DH-10B。
由 TaKaRa公司完成 DNA序列测定。
1.5 目的基因的体外表达
测 序 正 确 的 质 粒 pDy10.5t 、 pDy10.4t 和
pDy10.5*t经EcoR I/Xho I酶切后, 克隆入表达载体
pET32a, 构建重组表达质粒pET32a-Dy10.5t、pET32a-
Dy10.4t和pET32a-Dy10.5*t, 转化BL21DE3 (pLySs)。
挑取单克隆, 37℃培养过夜, 然后按2%接菌量转接
于5 mL LB培养液中, 继续培养至A600 = 0.6左右, 加
入IPTG至终浓度0.8 mmol L−1, 37℃培养3 h诱导表
达。收集表达菌体进行SDS-PAGE检测。
1.6 序列比对、功能预测和系统进化分析
采用生物学分析软件 Bioedit7.0, 对本研究中克
隆的亚基 Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t与已知序列的
21个 y-型、11个 x-型 HMW-GS的氨基酸序列(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行 ClustalW 多序列比较分
析。这 32 个亚基分别来自于六倍体普通小麦(T.
aestivum)、斯卑尔脱小麦(T. aestivum subsp. spelta)、
二倍体粗山羊草 (Ae. tauschii)、肥山羊草 (Ae.
crassa)、柱穗山羊草(Ae. cylindrica)、四倍体提莫非
维小麦(T. timopheevi)和四倍体圆锥小麦(T. turgi-
dum)[6,8,16-25]。利用 MEGA4.0 软件进行系统进化树
的构建, 用氨基酸 complete deletion 法计算遗传距
离, 邻近树法(neighbor joining)聚类, 序列自展次数
为 1 000次。
2 结果与分析
2.1 黄河中游地区粗山羊草高分子量谷蛋白组
成分析
SDS-PAGE 鉴定结果表明, 每份粗山羊草具有
1个或 2个 HMW-GS, 在 161份粗山羊草中共发现 3
种 x-型亚基, 根据迁移率被命名为 null、Dx6.2t 和
Dx5t; 3种 y-型亚基在 SDS-PAGE胶上的迁移率均较
Dy10 稍慢, 较 Dy9 稍快, 分别被命名为 Dy10.5t、
Dy10.4t和 Dy10.5*t(图 1)。3种 x-亚基和 3种 y-型亚
基共组成 3 种组合类型 , 即 5t+10.5t, 6.2t+10.4t,
null+10.5*t。这 3种亚基组合都未见报道。161份粗
山羊草中只有来自陕西阎良的 SX-13、陕西泾阳的
Sx-26、河南渑池的 T006和河南范县的 T103为 6.2t
+10.4t组合, 来自河南温县的 T054 为 null+10.5*t组
合, 其他均为 5t+10.5t组合。

图 1 粗山羊草 HMW-GS组成 SDS-PAGE分析
Fig. 1 SDS-PAGE analysis of HMW-GS compositions of Ae.
tauschii
1: 豫麦 49(对照); 2: 西安 8号; 3: T002; 4: T006; 5: T054。
1: Yumai 49 (control); 2: Xi’an 8; 3:T002; 4: T006; 5: T054.

2.2 3种 y-型亚基的分子克隆与序列分析
利用特异引物 S1和 S2, 以 T002、T006和 T054
的 DNA 作为模板, 扩增相应亚基的编码基因序列,
均在约 2 500 bp和 1 900 bp处获得两条扩增条带,
分别推测为 x-型亚基和 y-型亚基(图 2)。
分别将 1 900 bp处的目的条带回收纯化、克隆
测序, 得到了亚基 Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t的基
因编码序列, DNA序列全长分别为 1 968、1 959和
1 968 bp (GenBank登录号为 FJ499503、FJ499504和
第 7期 苏亚蕊等: 黄河中游粗山羊草三种 y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统进化分析 1247



图 2 T002、T054和 T006的 AS-PCR扩增
Fig. 2 AS-PCR amplification of HMW-GS genes from Ae.
tauschii accessions T002, T054, and T006
M: λ DNA/EcoR I+Hind III (Fermentas); 1: T002; 2: T054;
3: T006. Arrows show the amplified products of the x- and y-type
subunits, respectively.

FJ499502), 以 ATG 起始密码子开始, 双终止密码子
TGATAG结束, 分别编码 656、653和 656个氨基酸残
基。推导的氨基酸序列由 21个氨基酸的信号肽、104
个氨基酸的 N-端、六肽 (PGQGQQ)和九肽 (GYYP
TSLQQ)构成的中央重复区和 42个氨基酸的C-端 4个
部分组成。3个亚基都含有 7个半胱氨酸残基, 5个分
布在 N-端, 1 个出现在靠近 C-端区的重复区, 最后 1
个在C-端区, 其中第 3个和第 4个半胱氨酸残基相邻。
3 个亚基基因编码序列相似度比较高, 全序列一致性
达 99%以上(图 3)。Dy10.4t与 Dy10.5t亚基基因仅核苷
酸序列第 13位由 C→T转换, 因为这个突变位于三联
体密码的第 3 位, 未引起翻译氨基酸的改变, 所以为
无义突变; 重复序列 1 183~1 191位发生缺失, 从而引
起一个氨基酸重复单元 IGQ 的缺失。Dy10.5t 和
Dy10.5*t是 2个具有相同迁移率的亚基, 均包括 1 968
bp, 且重复序列区域完全相同, 仅在第 24 位 T→A 转
换(亮氨酸→苯丙氨酸)为有义突变, 而 Dy10.5*t 核苷
酸序列(信号肽区)第 13位 C→T转换, 21位 C→A转
换, 1 956位 C→T转换, 均为无义突变。


图 3 高分子量谷蛋白基因 Dy10.5t、Dy10.4t 和 Dy10.5*t的氨基酸序列
Fig. 3 Amino acids of HMW-GS gene Dy10.5t, Dy10.4t , and Dy10.5*t

2.3 3种 y-型亚基的体外表达
IPTG 诱导 3 h 后, 在细菌 BL21(DE3)pLySs中
分别表达出 Dy10.5t、Dy10.4t和 Dy10.5*t 3个亚基,
其大小与种子中的 y-型 HMW-GS 分子量大小相同,
进一步验证克隆基因的正确性(图 4)。
2.4 与已知 HMW-GS 亚基编码基因的序列比对
和系统进化分析
亚基序列比对结果显示(表 2), Dy10.5t、Dy10.4t
和 Dy10.5*t与其他 HMW-GS 的重复单位在氨基酸
的组成上十分相似, 均包括 4个区域, 即信号肽, 非
重复的 N-端和 C-端区, 及高度重复的中部区, 这与
前人的研究结果一致[26]。Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t
与已知 Glu-1 亚基全编码序列一致性比较结果显示,
这 3个亚基与所有的 y-型亚基的一致性高于与 x-型
亚基的一致性, 其中与来自 D 染色体组 y-型亚基全
编码序列一致性均达到 90%以上, 而与来自其他染
色体组亚基的氨基酸序列差别较大。
分析已知 y-型 HMW-GS 重复区域的氨基酸序
列(表 3), 结果显示, 所有 y-型HMW-GS中部重复区
以六肽(PGQGQQ)和九肽(GYYPTSLQQ)为基本重
1248 作 物 学 报 第 35卷


图 4 y-型亚基基因 Dy10.5t (A)、Dy10.4t (B)和 Dy10.5*t (C)在大肠杆菌中表达的 SDS-PAGE分析
Fig. 4 Expression of cloned Dy10.5t (A), Dy10.4t (B), and Dy10.5*t (C) genes in Escherichia coli and SDS-PAGE analysis of expressed products
表达载体分别为 pET32a-Dy10.5t、pET32a-Dy10.4t和 pET32a-Dy10.5*t。1: IPTG诱导表达蛋白; 2: 诱导前蛋白; 3: 种子蛋白。
Expression plasmids are pET32a-Dy10.5t, pET32a-Dy10.4t, and pET32a-Dy10.5*t, respectively. 1: IPTG induction; 2: IPTG uninduction; 3: subunits
of the Ae. tauschii variety.

表 2 Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t与已知亚基全编码序列一致性比较
Table 2 Identities of Dy10.5t, Dy10.4t, and Dy10.5*t with other Glu-1 genes
全序列一致性 Identity (%) 基因序号
Code of gene
亚基类型
Type of subunit
来源
Origin Dy10.5t Dy10.5*t Dy10.4t
X12929 Dy10 T. aestivum 95.5 95.5 95.3
AY695379 Dy10.1 T. aestivum 96.8 96.8 96.5
X03041 Dy12 T. aestivum 97.0 97.0 96.7
EU266533 Dy12* T. aestivum cv. Trebisovka 94.8 94.8 94.5
U39229 Dy12t Ae. tauschii 95.0 95.0 94.9
AY248704 Dy12.1t Ae. tauschii 94.9 94.9 94.7
DQ681078 Dy12.1*t Ae. tauschii 94.9 94.9 94.7
AY424274 Dy12.4t Ae. tauschii 66.9 66.9 67.4
AY174159 Dy13t Ae. tauschii 90.9 90.9 90.8
AJ306974 Dy Ae. cylindrica 98.8 98.8 98.5
AF354289 Dy Ae. crassa 89.4 89.4 89.3
X03042 Ay T. aestivum 75.1 75.1 75.6
AY303766 Ay1s T. aestivum subsp. spelta 75.4 75.4 75.4
AJ306977 Ay T. timopheevi 76.6 76.6 77.0
AY245797 By8 T. turgidum 82.4 82.4 82.2
X61026 By9 T. aestivum 84.3 84.3 84.0
DQ086215 By15 T. aestivum 81.8 81.8 81.5
EF540765 By16 T. aestivum 79.9 79.9 79.7
AJ306973 Cy Ae. cylindrica 76.7 76.7 77.2
AJ314783 Ry T. aestivum 75.7 75.7 75.8
AF216869 R1y T. aestivum 75.9 75.9 76.0
AF480486 Dx2.1t Ae. tauschii 57.5 57.3 57.3
AF480485 Dx2t Ae. tauschii 56.2 56.1 56.1
X13927 Bx7 Ae. tauschii 58.9 58.8 58.9
AJ437000 Bx20 T. turgidum 59.8 59.6 59.7
EF540764 Bx13 T. aestivum 58.9 58.8 58.9
AY367771 Bx14 T. aestivum 60.1 60.0 60.1
AJ306975 Dx Ae. cylindrica 56.0 55.9 55.9
EF051701 Dx1.1t Ae. tauschii 54.7 54.6 54.6
AY594355 Dx1.5t Ae. tauschii 57.2 57.1 57.1
DQ857243 Dx1.6t Ae. tauschii 56.3 56.2 56.2
X12928 Dx5 T. aestivum 56.9 56.7 56.7
第 7期 苏亚蕊等: 黄河中游粗山羊草三种 y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统进化分析 1249


复基元。Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t与其他 21 种 y-
型亚基的重复单位在氨基酸的组成上十分相似, 无论
六肽还是九肽, 重复单位各位氨基酸的组成都没有显
著增加和减少。重复基元六肽、九肽不同位点变异频
率不同, 其中六肽的1位和4位变异频率较高, 变异的
氨基酸种类最多, 而且没有偏向性; 九肽变异多发生
于 2位、5位和 7位, 第 2位易被组氨酸(H)替换, 第 5
位易被丙氨酸(A)替换, 第 7 位易被脯氨酸(P)或者谷
氨酰胺(Q)替换。亚基 Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t与
来自小麦的 Dy10 亚基相比, 重复基元每一个位置的
变异较为相似, 重复基元相对变异率均较低, 表明这
些亚基的重复基元更接近于一致序列。

表 3 y-型高分子量谷蛋白亚基重复单位变异
Table 3 The repeat unit variations of y-type HMW-GS
六肽变异 Hexapeptide variants 九肽变异 Nanopeptide variants 亚基
Subunit P G Q G Q Q V/T G Y Y P T S L Q Q V/T
V/T%
Dy10.5t 16 4 2 12 2 3 27/49 1 10 2 1 7 0 10 0 2 15/19 61.76
Dy10.5*t 16 4 2 12 2 3 27/49 1 10 2 1 7 0 10 0 2 15/19 61.76
Dy10.4t 15 4 2 11 1 3 26/48 1 10 2 1 7 0 10 0 2 15/19 61.19
Dy10 14 5 2 11 3 4 25/48 1 8 2 1 7 0 9 0 2 16/19 61.19
Dy10.1 16 4 4 12 3 5 30/49 1 10 2 1 6 0 10 0 2 16/19 67.65
Dy12 17 5 3 12 4 4 30/49 1 10 2 1 7 0 10 0 2 15/19 66.18
Dy12* 17 5 3 13 4 5 31/50 1 11 2 1 8 0 10 0 2 16/20 67.14
Dy12t 15 4 2 11 4 5 28/48 1 10 2 1 8 3 9 0 2 16/19 65.67
Dy12.1t 15 4 2 11 3 4 26/48 1 10 2 1 7 2 9 0 2 18/19 65.67
Dy12.1*t 15 4 4 11 4 4 29/48 1 11 2 1 7 0 9 0 2 17/19 68.66
Dy12.4t 12 3 2 8 1 3 18/29 1 1 1 0 0 0 5 0 1 6/8 64.86
Dy13t 16 5 3 12 2 4 29/47 1 9 2 0 5 0 7 0 2 15/19 66.67
Dy 17 4 2 13 2 3 29/49 1 10 2 1 7 0 10 0 2 15/19 64.71
Ay 17 7 2 15 4 5 31/46 1 5 2 2 5 1 3 1 2 12/14 71.67
Ay1s 17 7 3 16 4 5 31/47 0 5 2 2 4 2 4 1 3 11/14 68.85
Ay_ 18 6 2 14 4 4 29/45 0 5 2 1 5 1 2 1 1 10/13 67.24
By8 26 6 2 9 6 3 36/57 1 10 1 3 11 0 12 1 1 20/21 71.79
By9 26 5 1 9 6 3 34/56 1 9 1 3 10 0 11 1 1 19/20 69.74
By15 23 7 1 12 5 3 37/55 2 11 1 3 11 0 11 1 1 19/21 73.68
By16 28 8 1 9 6 4 36/60 1 10 1 3 10 0 12 1 1 20/21 69.14
Cy 18 4 2 16 4 6 31/54 0 6 5 2 7 2 10 1 2 15/16 65.71
Ry 15 7 3 15 7 9 31/60 1 11 1 2 5 1 9 2 0 16/17 61.04
R1y 15 7 3 15 6 9 30/60 1 11 1 2 5 1 9 2 0 16/17 59.74
y 18 5 3 12 3 5 27/46 2 10 2 1 8 0 9 1 2 14/18 64.06

为了进一步探讨不同染色体组编码的 HMW-
GS基因间的遗传进化关系, 将本试验中克隆的 3个
新的 Dy 亚基和已克隆的 32 个 HMW-GS 基于全编
码序列构建系统进化关系树(图 5)。所有的 x-型高分
子量谷蛋白亚基与 y-型高分子量谷蛋白亚基分开,
分别聚类为一支。其中 y-型亚基被分为 3 大类, 第
一大类包括所有的 By 亚基; 第二大类包括柱穗山
羊草的 Cy亚基、提莫非维小麦的 Ay亚基、普通小
麦的 Ay亚基、斯卑尔脱小麦的 Ay1s亚基及小麦的
两个 Ry 亚基, 其中来自小麦的两个 Ry 亚基单独聚
为一亚类; 第三大类包括所有的 Dy 亚基。而对于
x-型亚基, 所有 Bx 亚基与 Dx 亚基完全分开, 形成
两类。因此, 该系统进化关系树整体表现为不同亚
基类型、不同基因组来源的亚基间的分化比较明显。
从系统关系树可以看出 , Dy10.5t、Dy10.4t、
Dy10.5*t 3个亚基间的遗传距离较小 , 亲缘关系较
近, 聚在一小类中, 这可能与材料处于同一地理分
布区, 来源单一有关。此外, 相对其他 D 组亚基,
Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t 与来自普通小麦的 Dy
亚基亲缘关系相对较远, 而与同样来自粗山羊草的
1250 作 物 学 报 第 35卷

Dy12.4t亚基和来自柱穗山羊草的 Dy 亚基的亲缘关
系更近。来自柱穗山羊草的 Dx 亚基与来自粗山羊草
的 Dx亚基也在进化树中聚在一起。因此, 柱穗山羊草
的高分子量谷蛋白与粗山羊草的高分子量谷蛋白整体
表现为关系密切。而来自肥山羊草的 Dy 亚基单独与
其他来源的 Dy亚基区分开来, 亲缘关系较远。

图 5 Glu-1位点基于全编码区氨基酸序列的系统进化关系
Fig. 5 Phylogenetic tree generated from the nucleotide se-
quence alignment of Glu-1 based on neighbor-joining method

3 讨论
本研究克隆得到 3 个 HMW-GS 基因 Dy10.5t、
Dy10.4t和 Dy10.5*t, 并通过蛋白体外表达验证了克
隆基因的真实性。通过序列测定与结构比较, 发现
这 3 个亚基的核苷酸、氨基酸序列均不相同。其中
氨基酸序列表现为 Dy10.4t与 Dy10.5t亚基一个氨基
酸重复单元的缺失, 这可能导致面粉加工品质的差
异; Dy10.5t与 Dy10.5*t亚基信号肽部位一个氨基酸
的替换(L−F), 推测它们细胞膜的识别部位会出现一
些差别。3个亚基的共同结构特点是, N-端非重复区
氨基酸数量均为 104 个 ; 重复区域序列 , 均起始于
两个长的重复区域, 均结束于 1 个三肽 GYD, 且未
出现 x-型高分子量麦谷蛋白亚基所特有三肽(GQQ)
结构 ; 整个编码区含有 7个半胱氨酸残基 , 存在位
置保守; 且全序列与所有的 y-型亚基全编码序列一
致性较高。这些特点均为典型的 y-型高分子量麦谷
蛋白亚基特征 , 进一步证明 Dy10.5t、Dy10.4t、
Dy10.5*t这 3个亚基确为 Dy亚基。同时, 比对显示
这 3个谷蛋白亚基与已知亚基序列均不一致 , 是 3
个完全不同的新型 HWM-GS亚基。
亚基 Dy10.5t、Dy10.4t和 Dy10.5*t编码基因与
已知 y-型亚基编码基因的比较分析表明, 所有的 y-
型亚基都有极为相似的重复区排列方式, 且同一染
色体组上的亚基间相似性更高, 推测这些 y-型亚基
可能是由共同祖先进化而来的。所有的 y-型亚基同
时也具有一定的差异, 这主要是由重复区域重复单
元的变化造成的。重复基元每一个位置的变异显示,
Dy10.5t、Dy10.4t、Dy10.5*t与来自小麦的优质亚基
Dy10 具有类似的重复单元的缺失和氨基酸代换类
型, 这可能对面包加工品质共同起作用[27]。这 3个
y-型亚基和来自小麦的优质亚基 Dy10 对加工品质
的影响是否相似, 以及它们在小麦加工品质改良中
的潜在利用价值还有待进一步研究。
粗山羊草染色体组不仅是普通小麦 D 组的供体,
而且是另外几个多倍体物种的关键性染色体组, 其
中它与尾状山羊草杂交产生柱穗山羊草、与顶芒山
羊草(Ae. comosa, 2n = 2x = 14, MM)杂交产生四倍体
肥山羊草[28]。而系统进化聚类结果显示, 柱穗山羊
草的 x-型和 y-型 HWM-GS 均与粗山羊草的 x-型和
y-型 HWM-GS 分别聚在一起, 表现亲缘关系较近,
从一定程度上验证了粗山羊草是柱穗山羊草亲本之
一的事实[28]。来自肥山羊草的 Dy 亚基单独与来源
于小麦的 Dy 亚基在系统进化聚类图上区分开来,
因此推测作为肥山羊草的 D组供体的粗山羊草与作
为小麦 D 组供体的粗山羊草遗传差异较大, 可能不
属同一支。这与 Kimber等[29]对染色体组种间杂种的
染色体配对研究结果相吻合, 即粗山羊草、普通小
麦和柱穗山羊草的 D 染色体组几乎没有发生变异,
而肥山羊草的 D染色体组出现少许变异。该系统进
化聚类图从一定程度上印证和推测了一些小麦族物
第 7期 苏亚蕊等: 黄河中游粗山羊草三种 y-型高分子量谷蛋白亚基的鉴定、克隆及系统进化分析 1251


种的进化关系和来源。
4 结论
从黄河中游地区的 161 份粗山羊草中鉴定出 3
个未知序列的 y-型亚基, 即 Dy10.5t、Dy10.4t 和
Dy10.5*t, 其全长编码区分别为 1 968、1 959和 1 968
bp, 氨基酸序列具有典型的 y-型高分子量麦谷蛋白
亚基特征, 归属为 Dy 亚基家族。这些亚基与 32 个
已知的 HMW-GS 的氨基酸序列的系统进化关系分
析, 为研究小麦族相关物种的起源和进化提供遗传
信息。
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