全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(6): 1115−1120 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由广东省自然科学基金项目(S2011040001653)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 庄楚雄, E-mail: zhuangcx@scau.edu.cn, Tel: 020-85288399
第一作者联系方式: E-mail: lingyanzh@163.com, Tel: 020-89003167
Received(收稿日期): 2011-12-06; Accepted(接受日期): 2012-02-22; Published online(网络出版日期): 2012-03-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120329.1121.015.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01115
逆境处理下水稻叶角质层蜡质积累及其与蜡质合成相关基因 OsGL1
表达的关系
周玲艳 1,2 姜大刚 2 李 静 2 周 海 2 曹伟炜 2 庄楚雄 2,*
1仲恺农业工程学院生命科学学院, 广东广州 510225; 2华南农业大学生命科学学院, 广东广州 510642
摘 要: 植物角质层蜡质在抵抗各种生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用。本试验以水稻(Oryza sativa L.)幼苗
为材料, 分别以 200 mmol L−1 NaCl、12% PEG、1.0% H2O2、40℃高温和 8℃低温为逆境, 研究叶角质层蜡质的积累
情况以及其与水稻蜡质合成相关基因 OsGL1 表达的关系。扫描电镜观察以及叶角质层蜡质总量测定结果表明, 12%
PEG、1.0% H2O2和 8℃低温处理下水稻幼苗叶角质层蜡质的积累明显增加, 而 200 mmol L−1 NaCl和 40℃高温处理
下叶角质层蜡质覆盖量略有下降。RT-PCR 分析显示, 逆境处理下水稻蜡质合成相关基因 OsGL1 的表达量变化与水
稻幼苗叶角质层蜡质的积累存在相关性。
关键词: 水稻; 逆境处理; 角质层蜡质; OsGL1; 表达
Effect of Stresses on Leaf Cuticular Wax Accumulation and Its Relationship to
Expression of OsGL1-Homologous Genes in Rice
ZHOU Ling-Yan1,2, JIANG Da-Gang2, LI Jing2, ZHOU Hai2, CAO Wei-Wei2, and ZHUANG Chu-Xiong2,*
1 College of Life Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China; 2 College of Life Science, South China
Agriculture University, Guangzhou 510642, China
Abstract: The outermost surfaces of land plants are covered with a cuticular wax layer which plays a very critical role in defense
against biotic and abiotic stresses. GLOSSY1 (GL1) is a wax biosynthesis related gene and OsGL1 is a homologous gene of GL1.
In this study, we discussed the leaf cuticular wax accumulation and the relationship between the leaf cuticular wax accumulation
and the expression of OsGL1 in rice treated with stresses, including 200 mmol L–1 NaCl, 12% PEG, 1.0% H2O2, high temperature
and low temperature in their seedling stages. The scanning electron microscopy and the cuticular wax content analysis showed
that the cuticular wax accumulation on leaves significantly increased under 12% PEG, 1.0% H2O2 and low temperature treatments.
However, the cuticular wax accumulation on leaves declined slightly under NaCl and high temperature treatments. Results of RT-PCR
analysis suggested that the expression of OsGL1 under stresses was associated with the accumulation of cuticular wax on leaves.
Keywords: Oryza sativa L.; Stress treatment; Cuticular wax; OsGL1; Expression
角质层包括蜡质和角质, 是覆盖于陆生植物表面与
外界环境接触的重要保护性障碍物。角质层蜡质在植物抵
抗各种生物和非生物胁迫中起着非常重要的作用, 如防
止水分的非气孔性丢失 [1], 抵抗病菌入侵和防止草食性
昆虫吞食 [2], 抵抗紫外辐射和霜冻等非生物逆境的影
响[3-5]等。
水分胁迫通常会导致蜡质积累的增加, 而且, 对水
分胁迫具有抗性的植物一般都有较厚的表皮蜡质。在棉
花 [6]、玫瑰 [7]、花生 [8]、豌豆 [9]、大豆 [10]、芝麻 [11]、烟
树[12]、拟南芥[13]等许多植物中均发现水分胁迫可增加单
位叶面积蜡质含量。其中, 一些植物对水分胁迫更敏感,
如烟树水分胁迫后, 叶蜡质含量甚至增加 150%[12]。而拟
南芥在水分胁迫后 , 蜡质总含量显著增加 , 增加的成分
主要是烷烃, 这也暗示着烷烃的合成在抵御水分胁迫中
起着非常关键的作用[13]。研究表明, 逆境诱导的蜡质含量
增加, 导致叶水分丧失的敏感性显著降低[14-16]。同时, 蜡
质含量的增加 , 同样可增加植物抗干旱的能力 , 在拟南
芥[17]、水稻[18]、苜蓿和冰草[19]以及转基因苜蓿[20-21]中均
发现蜡质含量增加与植物抗干旱能力增强正相关。此外,
其他非生物因素如温度、光照等以及生物因素也均影响角
质层蜡质的合成[1,22]。
目前, 植物角质层蜡质合成途径已基本清楚, 一批
1116 作 物 学 报 第 38卷
与蜡质合成相关的基因已从拟南芥[23-24]、玉米[23-24]、水
稻[18,25-27]等植物中成功克隆。关于逆境处理下蜡质总量和
组成成分的变化以及蜡质合成相关基因表达在拟南芥和
其他植物中也进行了广泛的研究[13,22,28]。
玉米 Glossy1 (GL1)突变后, 叶角质层蜡质几乎消失[29],
拟南芥中的 GL1 同源基因 CER1 和 WAX2 的缺失也导致
茎角质层蜡质含量明显下降[30-31], 说明 GL1 同源基因在
蜡质合成中有着非常重要的作用。Islam等[18]对水稻基因
组中的 GL1 同源基因进行了系统的分析, 并将该基因家
族命名为 OsGL1, 序列对比分析发现水稻基因组中存在
11 个 OsGL1, 分别命名为 OsGL1-1-OsGL1-11。目前, 已
克隆了 3 个 OsGL1 基因[18,25-27], 发现它们的缺失都导致
角质层蜡质含量明显下降, 说明该基因家族在水稻蜡质
合成中也起重要作用, 同时还发现这些基因的表达受一
些非生物逆境诱导[18]。但是, 逆境处理对水稻叶角质层蜡
质积累的影响, 以及叶角质层蜡质积累的变化与 OsGL1
之间的关系尚未见研究报道。
本研究分析逆境处理下水稻幼苗叶角质层蜡质的变
化, 发现不同逆境处理对叶质层蜡质积累的影响是不同
的。同时分析低温和高温处理下蜡质合成相关基因OsGL1
的表达变化, 试图了解它与叶质层蜡质积累之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试水稻品种 粳稻 (Oryza sativa L. ssp.
japonica)品种中花 11, 由华南农业大学遗传工程实验
室提供。
1.1.2 试剂 RNA 抽提试剂盒 TRIzol 购自 Invetrogen
公司; 反转录酶(AMV RTase)、RNase inhibitor、Taq DNA
聚合酶和 dNTP 等购自 TaKaRa 公司; 氯仿、异丙醇、戊
二醛等为国产分析纯。
1.1.3 引物 引物序列如表 1。
表 1 RT-PCR引物序列
Table 1 Primers for semiquantitative RT-PCR
基因名称
Gene name
基因位点
Gene locus
上游引物
Upstream sequence (5−3)
下游引物
Downstream sequence (5−3)
OsAct1 Os03g0718100 TCTGGGTCATCTTCTCACGA CGTCTGCGATAATGGAACTG
OsGL1-1 Os09g0426800 GTTCGTCTCGTCGATCCAAC CTCATCTCTTTATGTATCCAAC
OsGL1-2 Os02g0178800 GCACAAAACTGCAAGACGTG CACCAAATCCCACAAGATCG
OsGL1-3 Os06g0653000 AGTTCCAGCAGTATCTGGTC GTACGACGCTAGCTATCAAC
OsGL1-4 Os02g0621300 ATGGTCAGCTGCCATTCG ATCTGATTTTGCTGTGTTGC (v)
OsGL1-5 Os10g0471100 GATTGGATTGGGAGAAGGAA TACAGCCATTGCAGGAGTTG (v)
OsGL1-6 Os02g0814200 GGGATTCCGGCCATACGAC CAGAGAATTAACAATACAGCTTG
1.2 方法
1.2.1 材料处理 将种子置垫有湿润滤纸的培养皿中,
于 25℃, 光照强度 100~150 μmol m−2 s−1, 光照时间 14 h
d−1, 催芽及培养, 待小苗长至 14 d 进行逆境处理。高温
和低温处理时, 将小苗分别移栽土壤中, 于 8℃或 40℃光
照培养箱中培养, 光照强度为 100 μmol m−2 s−1, 光照时
间为 14 h d−1。PEG、H2O2和 NaCl处理时, 分别将 14 d
的小苗置含有 12% (m/V) PEG、1.0% (V/V) H2O2和 200
mmol L−1 NaCl的水溶液中培养, 每天换 1次水溶液, 种
植条件为 25℃, 光照强度 100~150 μmol m−2 s−1, 光照时
间 14 h d−1。不处理的同期温室下生长的水稻中花 11幼苗
作为对照。
1.2.2 逆境处理下叶角质层蜡质积累的扫描电镜分析
取逆境处理 4 d 后长约 3 mm 的叶片 2~3 片, 以 2.5%
(V/V)戊二醛固定, 保存于 4℃冰箱内, 按扫描电镜要求脱水,
临界点干燥仪干燥后, 将样品装载于涂有金粉的装载台, 于
XL-30-ESEM环境扫描电子显微镜下观察并拍照。
1.2.3 逆境处理下叶角质层蜡质含量变化测定 采用
热氯仿抽提法[32]提取叶角质层蜡质。取 2 g左右逆境处理
4 d后的幼苗叶片, 剪成小段置 30 mL加热至 60℃的氯仿
中, 振荡 30 s马上取出, 待提取液自然挥发后, 称取蜡质
质量。
1.2.4 蜡质合成相关基因 OsGL1 表达分析 8℃低温
处理分 7个时间段(0.5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 60 h),
40℃高温处理分 6个时间段(0.5 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h,
36 h), 对照(0 h)为不处理材料。每个时间段取水稻幼苗
0.12 g, 于预冷的研钵中加入液氮快速研磨成粉末状, 参
照 Li等[33]方法抽提 RNA。然后在 0.2 mL 的离心管中加
入总 RNA 1 μL (≤1 μg)、5×buffer 4 μL、dNTP (10 mmol
L−1) 2 μL、Oligo (dT)18 1 μL、RNase inhibitor 1 μL、AMV
RTase (5 U μL−1) 2 μL、DEPC-H2O 9 μL, 混匀, 室温静置
10 min, 42℃反应 1 h后冰水中放置 2 min, 反转录合成第
一链。在 OsAct1为内参的基础上, 以反转录得到的 cDNA
为模板, 以特定基因引物(表 1)进行 PCR 扩增, 分析逆境
处理下蜡质合成相关基因 OsGL1 表达情况。扩增反应体
系含 cDNA 1 μL、10×buffer 2.5 μL、dNTPs (10 mmol L−1)
0.25 μL、上游引物(10 μmol L−1) 1 μL、下游引物(10 μmol
L−1) 1 μL、Taq DNA聚合酶(5 U μL−1) 0.2 μL、dH2O 19.05
μL。扩增反应程序为, 预变性 94 5 ℃ min; 94 30 s, 58 ℃ ℃
30 s, 72 30 s; 72℃ ℃延伸 10 min, 扩增循环数为 26~33。
第 6期 周玲艳等: 逆境处理下水稻叶角质层蜡质积累及其与蜡质合成相关基因 OsGL1表达的关系 1117
2 结果与分析
2.1 逆境处理下水稻幼苗叶角质层蜡质的扫描电镜分析
为了考察逆境处理对水稻幼苗叶角质层蜡质积累的
影响, 本试验分别用 12% PEG、1.0% H2O2、8℃低温、40℃
高温和 200 mmol L−1 NaCl对培养 14 d的水稻幼苗进行处
理, 并用扫描电镜观察处理 4 d后的叶片。结果表明, 逆
境处理下叶角质层蜡质覆盖和蜡质晶体形状发生变化。与
对照(图 1-a)相比, 12% PEG 处理的叶片, 针状蜡质变粗,
图 1 逆境处理 4 d后幼苗叶片电镜扫描
Fig. 1 Electron microscopic scanning of seedling leaves treated by
stresses
a: 中花 11幼苗叶片; b: 12% PEG处理幼苗叶片; c: 1.0% H2O2处理
幼苗叶片; d: 8 ℃ 低温处理幼苗叶片; e: 40℃高温处理幼苗叶片;
f: 200 mmol L−1 NaCl处理幼苗叶片。Bar: 5 μm。
a: seedling leaf of Zhonghua 11; b: seedling leaf treated with 12% PEG;
c: seedling leaf treated with 1.0% H2O2; d: seedling leaf treated with
8 ; e: seedling leaf treated with 40 ; f: seedling leaf treated with 200 ℃ ℃
mmol L−1 NaCl. Bar: 5 μm.
蜡质分布密度增加 , 但乳突没有明显增加(图 1-b); 1.0%
H2O2 处理的叶片, 针状蜡质更粗, 叶乳突数量也明显增
加, 从而增加了叶角质层蜡质的覆盖量(图 1-c); 8℃低温
处理的叶片, 针状蜡质形状、大小没有发生改变, 但针状
蜡质分布密度以及叶乳突数量均明显增加(图1-d); 40℃高
温处理的叶片 , 针状蜡质变粗 , 但叶表面乳突上的蜡质
晶体部分崩溃(图 1-e); NaCl 处理的叶片, 针状蜡质覆盖
量有所增加, 但针状蜡质比对照要小(图 1-f)。
2.2 逆境处理下水稻幼苗形态和叶角质层蜡质含量的变
化
为了进一步分析逆境处理对水稻幼苗叶角质层蜡质
积累的影响, 观察了逆境处理 4 d后水稻幼苗的生长状态,
并用热氯仿法测定了叶角质层蜡质含量。结果表明, 不同
逆境处理对水稻幼苗生长状态和叶角质层蜡质含量均有
较大的影响, 12.0% PEG处理 4 d的水稻幼苗株高生长受
到一定的抑制 , 叶尖端出现一定程度的黄化 , 叶角质层
蜡质含量增加 23.4 %; 8℃冷处理 4 d的水稻幼苗矮而壮实,
叶角质层蜡质含量增加 51.6 %; 1.0% H2O2处理 4 d的水稻
幼苗较高 , 略发黄 , 叶角质层蜡质含量增加 70.4%; 而
200 mmol L−1 NaCl和 40℃高温处理 4 d的水稻幼苗叶出
现了不同程度黄化, 且高温处理出现了叶萎焉现象, NaCl
和高温处理下叶角质层蜡质含量分别下降 5.9%和 11.9%
(表 2)。
2.3 逆境处理下蜡质合成相关基因 OsGL1的表达分析
采用半定量 RT-PCR 的方法分析 2 种温度条件下幼
苗中 OsGL1-1-OsGL1-6 表达变化表明, 8℃低温处理时,
OsGL1-1的表达量在处理 0.5~6.0 h之间没有明显变化, 12
h 以后表达水平有所增加 ; OsGL1-2 的表达量在处理
0.5~12.0之间明显增加, 而处理 24 h以后显著下降, 恢复
到接近对照水平; OsGL1-3的表达量在处理 3 h之内变化
不大, 当处理时间达 6 h时, 表达量开始增加, 36 h达到最
高, 之后又有所下降, 但仍高于对照; OsGL1-4 的表达量
从处理 30 min后呈现上升趋势, 36 h达到最高, 之后又有
所下降, 但仍高于对照; OsGL1-5表达量在处理 30 min时
即开始有所增加, 直至 60 h均维持在较高水平; OsGL1-6
表 2 逆境处理对水稻幼苗叶角质层蜡质含量的影响
Table 2 Effects of stresses on the leaf cuticular wax content of rice seedlings
处理
Treatment
角质层蜡质含量
Content of cuticular wax (mg g−1)
角质层蜡质变化率 1)
Change rate of cuticular wax 1) (%)
幼苗生长状态
Seeding performance
对照 Control 8.51 高、茂盛 High and lush
12.0% PEG 10.5 23.4 2) 中等程度伤害 Moderate injury
1.0% H2O2 14.5 70.4 2) 黄、矮 Dwarf and yellow
8℃ 12.9 51.6 2) 矮、壮 Dwarf and strong
40℃ 7.5 11.9 3) 黄、矮、萎焉 Dwarf, yellow, and wilt
200 mmol L−1NaCl 8.0 5.9 3) 黄、矮 Dwarf and yellow
1) 角质层蜡质变化率(%) = (逆境处理下幼苗的角质层蜡质含量−对照幼苗的角质层蜡质含量)/对照幼苗的角质层蜡质含量×100%; 2) 角
质层蜡质含量增加率; 3) 角质层蜡质含量减少率。
1) Change rate of wax = (Cuticular wax content of seedlings under stresses–Cuticular wax content of control seedlings)/Cuticular wax content of
control seedlings ×100%; 2) The increment rate of wax; 3) The descent rate of cuticular wax.
1118 作 物 学 报 第 38卷
表达量在处理 3 h 之内没有太大变化, 随处理时间的延长,
其表达量逐渐增加, 当处理时间达 60 h 时, 其表达量明
显增加(图 2)。
在 40℃高温处理下, OsGL1-1 的表达量在处理 24 h
之前变化不明显 , 处理达 36 h 时 , 表达量有所下降 ;
OsGL1-2 的表达量在处理后略有下降, 36 h 时明显下降;
OsGL1-3的表达量在处理开始时急剧下降, 当处理达 24 h
时 , 表达量略有增加 , 36 h 时 , 其表达量又开始下降 ;
OsGL1-4 的表达量在处理 30 min 时略有增加, 此后表达
水平与对照相当; OsGL1-5的表达量在处理达 24 h时有所
增加, 处理 36 h时增加明显; OsGL1-6的表达量处理后 24
h都略有增加, 36 h时明显下降(图 3)。
图 2 8℃低温处理下蜡质合成相关基因 OsGL1的表达
Fig. 2 Expression of wax biosynthesis related genes OsGL1 under
8 ℃ low temperature treatment
图 3 40℃高温处理下蜡质合成相关基因 OsGL1的表达
Fig. 3 Expression of wax biosynthesis related genes OsGL1 under
40 high℃ temperature treatment
3 讨论
植物叶角质层蜡质积累是一个重要的生理过程 [34],
角质层蜡质的合成往往受植物外部的非生物因素如水分、
温度、光照等以及生物因素的影响[1,22]。水分胁迫下可导
致叶角质层蜡质含量增加[6-13]。低温处理导致根系吸水能
力下降, 在植物体内形成水分胁迫[35]; 低浓度的 H2O2 能
模拟冷驯化[36]; PEG可用来人为模拟水分渗透胁迫[37]。因
此, 上述 3种处理都可以造成水分胁迫, 将可能提高角质
层蜡质积累。本试验显示, 8℃冷处理 4 d后, 叶角质层蜡
质分布密度和乳突数量明显增加(图 1-d), 1.0% H2O2处理
后针状蜡质更粗, 叶乳突数量大大增加(图 1-c), 12% PEG
处理后叶乳突增加不多, 但叶蜡质分布密度增加(图 1-b)。
8℃冷处理、1.0% H2O2和 12% PEG处理均能导致叶角质
层蜡质含量增加(表 2)。这进一步证实水分胁迫可增加叶
角质层蜡质的积累。
全球变暖使得高温成为影响植物生理生长的一个重
要的环境因子。有研究者发现高温条件下蜡质组分中脂肪
酸和通过酰基还原途径产生的产物增多 [38-39], 而高温处
理对蜡质覆盖影响鲜见报道。本试验发现, 40℃高温处理
4 d下叶乳突上的蜡质晶体崩溃(图 1-e), 叶表面角质层蜡
质含量下降(表 2)。说明高温胁迫下可造成叶角质层蜡质
结构的改变和角质层蜡质覆盖减少, 导致非气孔性失水
增加, 这可能既是一种保护, 也是一种伤害, 因为短期的
失水增加可以降低高温胁迫对植物的伤害, 而长期的失
水增加可导致植物因缺水而致死。
植物角质层结构、角质层蜡质含量以及组成成分影
响植物抗逆性 [17-18,40-42]。Kosma 等 [13]发现拟南芥在 150
mmol L−1 NaCl处理下叶蜡质总量增加, 但角质厚度没有
明显变化。而本试验发现水稻幼苗经 200 mmol L−1 NaCl
处理后叶角质层蜡质积累量略有下降 (表 2)。这与拟南
芥[13]在 150 mmol L−1 NaCl处理下叶蜡质总量增加的结果
不一致的可能原因是, 本试验 NaCl处理浓度为 200 mmol
L−1, 高浓度的 NaCl 可能对水稻幼苗造成了伤害, 影响了
角质层蜡质的合成。再者, 可能不同植物对同一逆境处理
的反应不一样, 本试验中水稻幼苗叶角质层蜡质含量虽
略有下降, 但蜡质形态改变, 如针状蜡质比对照小, 也可
能因此而增加抗逆性。
蜡质含量和形态与环境变化密切相关[43]。本实验表
明, 8℃冷处理、1.0% H2O2和 12% PEG处理下叶角质层
蜡质覆盖量增加(表 2)。12% PEG和 8℃冷处理下针状蜡
质分布密度增加(图 1-b, 1-d), 1.0% H2O2处理下针状蜡质
增粗(图 1-c), 同时, 1.0% H2O2和 8℃冷处理下叶乳突数量
大大增加(图 1-c, 1-d)。说明水稻在不同的逆境下, 可以通
过不同的途径来增加叶质层蜡质的覆盖量。
不同逆境处理下诱导表达的基因不一样。Islam等[18]
和高国斌等 [47]发现不同 OsGL1 对不同胁迫响应存在差
别。本试验表明, 不同基因对温度响应速度和持续时间不
一样。8℃低温处理下, OsGL1-2 和 OsGL1-5 响应时间较
早, 但OsGL1-2在处理后期表达量下降, 而OsGL1-5则一
直保持较高表达量, 其他几个基因则在处理后期才响应
低温胁迫(图 2)。40℃高温处理下, 除 OsGL1-5 处理后期
明显增加外, 其他几个基因表达量增加不明显或略有下
降(图 3)。这也进一步说明植物逆境响应和蜡质积累是一
个复杂的, 需要多基因协同参与的过程。同时, 8℃低温处
理下 OsGL1 的表达量均增加(图 2), 而 40℃高温处理下,
除 OsGL1-5 表达量略有增加, 其他几个 OsGL1 基因的表
达量变化不明显或有所下降(图 3)。而低温下叶角质层蜡
质积累增加, 高温下叶角质层蜡质积累减少(表2)。这一结
果表明水稻叶角质层蜡质积累与 OsGL1 表达量变化存在
相关性。
近年来, 人们正在研究利用蜡质相关基因提高作物
产量和抗旱性, 发现过表达拟南芥 CER1提高了植物抗逆
性[17], 过表达水稻蜡质合成相关基因 OsGL1-2 增加植株
第 6期 周玲艳等: 逆境处理下水稻叶角质层蜡质积累及其与蜡质合成相关基因 OsGL1表达的关系 1119
叶角质层蜡质晶体数量, 增强植株抗干旱能力[18]。而将蜡
质合成相关的转录因子 WXP1 转入苜蓿中, 转基因植株
叶的单位面积蜡质含量增加 , 抗旱性提高 [20], WXP1 及
WXP2 转化拟南芥同样提高了其蜡质含量和抗水分胁迫
的能力[21]。从我们的研究结果看, OsGL1-5在低温和高温
条件都诱导表达 , 因此 , 我们认为该基因在抗逆中可能
起重要作用, 可以作为候选基因应用于抗逆育种。同时,
我们的结果也显示 , 水稻应对逆境是一个复杂的过程 ,
因此 , 将多个基因组合转化水稻 , 更有利于提高其抗逆
性。
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