全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(4): 557−564 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家转基因植物研究与产业化开发专项项目(JY-03-A-02); 国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2004AA212131)
作者简介: 安宝燕(1979−), 女, 硕士研究生, 植物发育专业。罗琰(1981−), 女, 硕士研究生生, 植物发育专业。∗∗ 共同第一作者。
*
通讯作者(Corresponding authors): 张宪省, 男, 教授, E-mail: zhangxs@sdau.edu.cn, Tel: 86-538-8249418; 高新起, 男, 副教授,
E-mail: gaoxq@sdau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-07-29; Accepted(接受日期): 2007-10-23.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00557
紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的
耐盐性
安宝燕1,2,** 罗 琰1,** 李加瑞2 乔卫华3 张宪省1,* 高新起1,*
(1山东农业大学生命科学学院 / 作物生物学国家重点实验室, 山东泰安 271018; 2美国堪萨斯州立大学植物病理系, 美国曼哈顿 66506;
3北京大学生命科学学院, 北京 100871)
摘 要: 以紫花苜蓿 (Medicago sativa)为材料 , 利用反转录PCR方法分离了NHX1 全长cDNA(命名为MsNHX1)。
Southern杂交结果表明, 在紫花苜蓿中存在一个小的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白基因家族。序列分析表明, 该基因所
编码的蛋白与拟南芥、水稻和棉花中液泡型Na+/H+逆向转运蛋白具有较高的同源性。在洋葱表皮细胞中瞬时表达
MsNHX1-GFP融合基因的结果表明, MsNHX1定位在液泡膜上。Northern杂交发现该基因的表达受高浓度NaCl诱导。
MsNHX1在盐敏感酵母突变体中表达可以提高转化子对NaCl的耐受性, 说明MsNHX1具有转运Na+的功能。在拟南芥
中表达MsNHX1 能显著提高植株耐受盐胁迫的能力; 而且在受到盐胁迫时, 转基因植株比野生型的渗透调节能力更
强, 生物膜受破坏程度降低, 光合能力增强。以上研究结果表明MsNHX1是一个液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白, 在植物
耐受盐胁迫过程中起重要作用。
关键词: 紫花苜蓿; Na+/H+逆向转运蛋白基因; 拟南芥; 耐盐性
Expression of a Vacuolar Na+/H+ Antiporter Gene of Alfalfa Enhances
Salinity Tolerance in Transgenic Arabidopsis
AN Bao-Yan1,2,**, LUO Yan1,**, LI Jia-Rui2, QIAO Wei-Hua3, ZHANG Xian-Sheng1,*, and GAO Xin-Qi1,*
(1 State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, Shandong, China; 2 Department
of Plant Pathology, Kansas State University, Manhattan 66506 KS, USA; 3 College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871, China)
Abstract: Plant Na+/H+ antiporters play an important role in salt tolerance. An alfalfa (Medicago sativa) full length cDNA
(named as MsNHX1) was isolated by RT-PCR according to the homologous region of plant Na+/H+ antiporter genes. Southern blot
analysis revealed that there was a small antiporter gene family in alfalfa genome. Sequence analysis indicated that MsNHX1
shared high homology with other vacuolar Na+/H+ antiporters. Transient transfection of MsNHX1-GFP fusion gene revealed that
MsNHX1 targeted to vacuolar membrane. The transcription of MsNHX1 was up-regulated after high salinity treatment.
Furthermore, the expression of MsNHX1 in yeast partly suppressed the salt-sensitive phenotype of yeast Na+/H+ antiporter mutant,
indicating that MsNHX1 was a functional Na+/H+ antiporter of alfalfa. The physiological analysis revealed that the expression of
MsNHX1 in Arabidopsis enhanced the resistance of transgenic plants to salt stress. These results suggest that MsNHX1 is a
vacuolar Na+/H+ antiporter and functions in salt tolerance of plants.
Keywords: Alfalfa; Na+/H+ antiporter gene; Arabidopsis; Salt tolerance
植物的生长发育受干旱, 高盐以及冻害等不良
环境因子的影响, 直接影响农作物的产量[1]。近几年
盐胁迫的危害日益突出, 高盐胁迫对植物的伤害主
要是离子毒害和渗透胁迫。离子毒害启动了膜质和
膜蛋白的过氧化作用, 造成膜损伤, 使质膜透性增
加, 植物表现盐害特征。渗透胁迫使土壤溶液的水
558 作 物 学 报 第 34卷

势降低, 造成生理干旱[2]。受到盐胁迫时, 植物通过
将Na+运到液泡中或将Na+从胞质排出从而避免了过
多的Na+对细胞的毒害 , 维持细胞的渗透平 衡
[3-5]。将Na+转运到液泡中的区隔化作用是通过定位
于液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白完成的。最近研
究显示, Na+/H+逆向转运蛋白是植物耐盐的关键因
子之一。Apse等 [6]的研究结果表明过量表达Na+/H+
逆向转运蛋白基因的转基因拟南芥植株在 200 mmol
L−1 NaCl胁迫下能正常生长发育, 另外在Na+敏感的
酵母nhx1 突变体中表达AtNHX1 可部分抑制该突变
体的阳离子敏感表型[7]。除模式植物拟南芥外, 近年
来, 又有一些植物的Na+/H+逆向转运蛋白基因被陆
续分离, 其中包括玉米[8]、滨藜[9]和陆地棉[10]。这些
Na+/H+逆向转运蛋白基因都能在很大程度上提高转
基因植物的耐盐性。此外, 月季的液泡膜Na+/H+逆向
转运蛋白基因还能抑制潮霉素对酵母nhx1 突变体的
毒害, 表明这类基因应该和酵母液泡膜Na+/H+逆向
转运蛋白基因ScNHX1 功能相同, 是一个定位于内
膜上的转运蛋白, 在序列和功能上具有保守性[11]。
这些研究表明Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐过程
中具有重要作用。
紫花苜蓿是世界上产量最大, 营养价值最高的
优质牧草之一, 具有中度耐盐能力[12-13]。因此研究
紫花苜蓿的耐盐机制对农作物品质改良具有重要意
义。本研究首次从紫花苜蓿中分离出一个Na+/H+ 逆
向转运蛋白基因, 命名为MsNHX1。洋葱表皮细胞瞬
时表达MsNHX1-GFP融合基因后, 能够在液泡膜上
检测到较强的荧光信号。Northern杂交发现该基因的
表达受高浓度NaCl诱导。在酵母中表达MsNHX1 可
以部分互补酵母液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因突
变体的盐敏感表型。与野生型拟南芥相比 , 表达
MsNHX1 基因的转基因植株能够耐受更高浓度的盐
胁迫。本研究表明MsNHX1 是定位于液泡膜上的
Na+/H+逆向转运蛋白, 在通过遗传工程的方法提高
植物耐受盐胁迫的能力中有应用价值。
1 材料与方法
1.1 植物材料
紫花苜蓿种子(Medicago sativa L.)由山东农业
大学王洪刚教授惠赠。种子在(25±1)℃(16 h光照, 8
h黑暗)水培萌发。拟南芥的播种参照Clarke的方 法
[14]。
1.2 紫花苜蓿Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离
利用RNA提取试剂盒(Promega Corporation,
Madison, WI, USA)提取幼苗总RNA, 利用Promega
公司的cDNA合成Kit合成第 1条cDNA链, 并以其为
模板进行PCR扩增。根据拟南芥和水稻的液泡膜
Na+/H +逆向转运蛋白基因保守序列设计兼并引物:
5′-CA(T/C)TA(C/T)AC(C/T)TGGCA(C/T)AA(C/T)G
T-3′; 5′-CAT(G/C)AG(A/C/)CC(A/G/T)GCCCACC
(A/G/T)AT-3′。通过 PCR方法扩增获得 309 bp中间片
段, 测序结果显示该片段与其他 Na+/H+逆向转运蛋
白具有高度同源性。根据获得的中间片段设计 5′RACE
的特异性引物 5′-GGACAAGGTAGCAAAAGAAT
GCTT-3′, 采用 5′ RACE试剂盒克隆MsNHX1基因 5′
端序列。试剂盒内提供的锚定引物序列为 :
5′-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTA
C(G)-3′。具体步骤按照 BIBCO-BRL 公司的 RACE
试剂盒说明书进行。MsNHX1 基因 3′端序列利用
3′RACE 的方法获得, 以特异引物 5′-ACTTGACTA
AAAAATCACAACA-3′和含有 oligo-dT 的锚定引物
5 ′-GACTCGAGTCGACATCGA(T)-3 ′为引物进行
P C R 反应。将所有扩增片段连接到克隆载体
pGEM-T Easy Vector上, 转化大肠杆菌。经过筛选和
酶切鉴定, 进行 DNA序列测定。经过序列比对验证
体外拼接得到 MsNHX1基因全长 cDNA序列。根据
拼接结果设计特异引物: 5′-CTCTAGAGACAGCTC
AGAAACATAAATATCTGG-3′和 5′-CGTCGACATT
TCATGGCTTCTTTTCTCAA-3′进行 PCR扩增, 获得
含有 MsNHX1基因全长编码框的 cDNA序列。
1.3 pBI121-MsNHX1-GFP表达载体的构建以及
MsNHX1蛋白定位的 GFP荧光检测
根据已知序列设计特异引物 5′-GTGGATCCGA
CAGCTCAGAAACATAAATATCTGG-3′和 5′-GTGCC
TCGACCCCATTGATTACCATTGCGT-3′进行 PCR
扩增。将扩增得到的cDNA片段连接在BamH I线性化
的含有GFP基因的表达载体pBI121 上, 将去掉终止
密码子的MsNHX1 编码框连接在GFP蛋白的N末端,
构建pBI121-MsNHX1-GFP表达载体, 使之在 35S启
动子的驱动下表达。以农杆菌浸染的方法转化洋葱
表皮细胞[15], 在荧光显微镜下观察侵染后的洋葱表
皮细胞检测荧光(BX51, model 7.3, Olympus, Japan)。
1.4 Southern杂交分析
参照Delloporta等的方法用CTAB法提取紫花苜
蓿全基因组DNA[16]。取 10 µg DNA用限制性内切酶
EcoR I和EcoR V分别酶切, 37℃保温 8~12 h。1%的
琼脂糖凝胶电泳分离酶解产物, 转移到硝酸纤维素
膜上, 65℃过夜预杂交。以 3端 800 bp的非保守区片
第 4期 安宝燕等: 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性 559

断为探针进行Southern杂交(包括编码区和非编码区
序列)。65℃杂交 24 h。弃去杂交液, 依次用洗液
2×SSC加 0.2%SDS和 0.2×SSC加 0.2%SDS洗膜。
−70℃放射自显影。
1.5 Northern杂交分析
水培 3 周后的紫花苜蓿幼苗, 以 200 mmol L−1
NaCl处理 0、3、12、24、48 h, 分别取叶和根, 液氮
冷冻 , 保存于−70℃。总RNA提取方法如上所述。
Northern杂交方法参照Sambrook等[17]。探针合成所
用模版与Southern杂交相同。
1.6 在酵母中 MsNHX1的功能分析
用特异引物 5′-GTGGATCCGACAGCTCAGAA
ACATAAATATCTGG-3′和 5′-CTCTAGAATTTCAT
GGCTTCTTTTCTCAA-3′扩增MSNHX1 全长编码区,
连接酵母表达载体pYES2。用乙酸锂转化法[18-19]转
化 酵 母 nhx1 突 变 体 ATX3 (enal::HIS3::ena4,
nhal::LEU2, nhxl::TRP1, ura3-1)。对转化子进行抗性
检测, 选取OD600=0.8 的酵母YOD液体培养液(1%酵
母提取物, 2%蛋白胨和 2%葡萄糖)取 2 µL并依次稀
释 10倍, 点在添加 50 mmol L−1 NaCl的固体培养基
上 30℃培养 48 h[7]。
1.7 拟南芥表达载体的构建以及农杆菌介导的
转化
用Xba I和Sal I双酶切含有MsNHX1 的pGEM-
T Easy载体和植物表达载体 pBI121。将回收的
MsNHX1 cDNA片段和pBI121 载体片段连接。构建
好拟南芥表达载体pBI121-MsNHX1, 转化农杆菌菌
株GV3101, 然后利用花序浸染法转化拟南芥[20]。
1.8 转基因拟南芥的分子鉴定
利用特异引物 5′-CTCTAGAGACAGCTCAGAA
ACATAAATATCTGG-3′和 5′-CGTCGACATTTCAT
GGCTTCTTTTCTCAA-3′对T1代卡那霉素抗性植株
进行分子水平检测。用 RNA提取试剂盒 (BBI,
Shanghai Sangon, China)提取各个转基因株系和野生
型拟南芥总RNA。
1.9 转基因拟南芥的耐盐试验
将野生型与转基因株系TL1的T3代种子分别播
种于含 0、100和 200 mmol L−1 NaCl的GM培养基
上, 20 d后计算各自的萌发率。GM培养基中萌发的
TL1株系的T3代卡那霉素抗性幼苗和野生型幼苗移
栽到填满基质的营养钵中 , 正常生长 15 d后浇灌
200 mmol L−1 NaCl溶液, 每 5 d浇灌 1次, 浇灌 5
次。
1.10 转基因拟南芥生理指标的测定
TL1 株系的T3代植株和野生型植株分别用 200
mmol L−1 NaCl处理 0、1、2和 3 d后测定相关生理
指标。依照Walker[21]的方法 , 用Clarke-type氧电极
(Hansatech, Kings Lynn, UK)测定光合放氧量。拟南
芥叶片的饱和渗透势(ψs100)由美国VESCOR公司的
蒸汽压渗透压计测定(5520; VESCOR, INC, USA),
测定方法参照Verslues等[22]。丙二醛(MDA)含量的测
定参照赵世杰等的方法[23]。
2 结果
2.1 紫花苜蓿 MsNHX1基因全长 cDNA的分离
紫花苜蓿幼苗用 200 mmol L−1 NaCl处理 12 h后
提取总RNA, 以反转录产物为模板, 根据体外拼接
序列设计特异引物 , 利用RT-PCR方法扩增获得 1
840 bp的cDNA片段。序列分析显示MsNHX1基因含
有 1 623 bp的开放阅读框, 编码一个由 541个氨基酸
残基组成的蛋白MsNHX1。该蛋白的氨基酸序列与
棉花、拟南芥和水稻的液泡型Na+/H+逆向转运蛋白
序列有较高的同源性, 同源性分别为 77.3%、75.7%
和 72.7%(图 1-A)。而与拟南芥质膜Na+/H+逆向转运
蛋白的序列同源性非常低 , 只有 8.2%。此外 ,
MsNHX1与OsNHX1和GhNHX1的N-端结构域一样,
都含有 12 个跨膜片段, 包括液泡膜Na+/H+逆向转运
蛋 白 非 常 保 守 的 氨 氯 吡 嗪 咪 结 合 位 点
(84LFFIYLLPPI93)[8,10]。进化树分析结果也显示
MsNHX1 与液泡型Na+/H+逆向转运蛋白亲缘关系比
与质膜Na+/H+逆向转运蛋白更近(图 1-B)。这些结果
显示MsNHX1 为紫花苜蓿的一个液泡型Na+/H+逆向
转运蛋白。为进一步研究MsNHX1 在细胞中的定位
情况, 构建pBI121-MsNHX1-GFP融合表达载体, 利
用农杆菌介导的方法转化洋葱表皮细胞[15], 用荧光
显微镜检测MSNHX1::GFP融合蛋白的表达。如图 2
所示, 成熟的洋葱表皮细胞的液泡占了细胞的绝大
部分体积; 与对照细胞相比, 侵染后细胞的液泡膜
能够检测到较强的绿色荧光(图 2)。本研究结果进一
步证实MsNHX1为液泡型Na+/H+逆向转运蛋白。

560 作 物 学 报 第 34卷


图 1 Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的同源比对
Fig. 1 Amino acid sequence analysis of Na+/H+ antiporters
A: 不同植物来源的Na+/H+逆向转运蛋白序列的同源比对。NHX1的序列来源分别为: 紫花苜蓿MsNHX1(AY513732); 棉花的
GhNHX1(AF515632); 拟南芥的AtNHX1(NM_122597); 水稻的OsNHX1(AB021878)。相同的氨基酸序列用黑色框起。序列中的原点代
表缺少的氨基酸。
B: 紫花苜蓿推测的Na+/H+逆向转运蛋白与不同来源的Na+/H+逆向转运蛋白聚类分析。序列来源如下: 紫花苜蓿MsNHX1 (AY513732,
框出); 拟南芥AtNHX1(NM_122597), AtNHX2 (AC009465), AtNHX3 (AC011623), AtNHX4 (AB015479), AtNHX5 (AC005287),
AtNHX6(AC010793), AtSOS1(AF256224); 水稻OsNHX1 (AB021878), OsNHX2 (AAQ63678), OsNHX3 (ABA95118), OsNHX4
(BAD61599); 小麦TaNHX1 (AY040245); 棉花GhNHX1 (AF515632)。
A: alignment of amino acid sequences of NHX1 from several plant species. The accession numbers and sources of the NHX1 are as follows:
MsNHX1 (AY513732), Medicago sativa; GhNHX1 (AF515632), Gossypium hirsutum; AtNHX1(NM_122597), Arabidopsis thaliana; OsNHX1
(AB021878), Oryza sativa. Dark shading with white letters reflect 100% sequence conservation. The putative transmembrane domains are
boxed and indicated by roman letters.
B: a phylogenetic tree of putative Na+/H+ antiporter proteins. MsNHX1 (AY513732, boxed), Medicago sativa; AtNHX1(NM_122597),
AtNHX2 (AC009465), AtNHX3 (AC011623), AtNHX4 (AB015479), AtNHX5 (AC005287), AtNHX6 (AC010793) and AtSOS1 (AF256224)
from Arabidopsis thaliana; OsNHX1 (AB021878), OsNHX2 (AAQ63678), OsNHX3 (ABA95118) and OsNHX4 (BAD61599) from Oryza
sativa; TaNHX1 (AY040245), Triticum aestivum; GhNHX1 (AF515632), Gossypium hirsutum. The phylogentic tree was generated by using
DNAMAN Version 4 (Lynnon biosoft, USA).
第 4期 安宝燕等: 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性 561


图 2 MsNHX1-GFP融合蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达
Fig. 2 Vacuolar membrane localization of pBI121-MsNHX1::GFP
transient expression in onion epidermal cell
A和 B: 表达 pBI121-MsNHX1-GFP蛋白的成熟的洋葱表皮细胞。
C: 只表达 pBI121-GFP蛋白的洋葱表皮细胞。标尺为 50 µm。
A and B: vacuolar membranes (Vm) of epidermal cells expressing
pBI121-MsNHX1-GFP construct. GFP expression was concentrated
to the tonoplast. C: an onion epidermal cell expressing pBI121-GFP
only as the control. Bar = 50 µm.

2.2 MsNHX1基因的表达分析
将水培三周的紫花苜蓿用 200 mmol L−1 NaCl分
别处理 0、3、12、24和 48 h, 分别提取不同处理时
间叶和根的总RNA, 以MsNHX1较不保守的 3端 800
bp片段为模板合成探针, 进行Northern杂交。结果表
明, 该基因在叶和根中皆有表达, 说明其在紫花苜
蓿中的表达没有组织特异性。但是我们发现NaCl处
理后该基因在叶和根中的表达都有不同程度的上调
(图 3-A)。在根中, NaCl处理 3 h后, MsNHX1基因表
达量明显提高; 而且在叶中, 该基因的表达量增加
更加明显。表明MsNHX1在叶中的功能可能更强。
为了弄清MsNHX1基因在苜蓿基因组中的情况,
我们进行了Southern杂交。首先提取苜蓿的基因组
DNA, 然后分别用EcoR I和EcoR V酶切, 以MsNHX1较
不保守的 3′端 800 bp片段为模板合成探针。结果表
明, 通过放射自显影观察到至少有 4 条带(图 3-B),
说明在紫花苜蓿基因组中可能存在一个小的Na+/H+
逆向转运蛋白基因家族。
2.3 MsNHX1互补酵母突变体ATX3盐敏感缺陷型
酵母nhx1突变菌株ATX3部分丧失了Na+转运能
力, 因此在含有NaCl的培养基中生长受到明显的抑
制。将MsNHX1 全长cDNA连接到酵母表达载体
p Y E S 2 上 , 用乙酸锂转化法转入酵母突变体
ATX3(enal::HIS3::ena4, nhal::LEU2, nhxl::TRP1,

图 3 MsNHX1基因的表达分析
Fig. 3 Molecular analysis of MsNHX1 gene
A: 200 mmol L−1 NaCl处理后紫花苜蓿叶和根中MsNHX1基因的
诱导表达。B: MsNHX1基因的Southern杂交分析。
A: upregulated expression of MsNHX1 mRNA at the indicated time
after treatment with 200 mmol L-1 NaCl in the leaves and roots.
Total RNA (20 µg per well) was isolated from leaves and roots of
10-day-old water-cultured alfalfa at indicated time after 200 mmol
L-1 NaCl treatment. The isolated RNA was hybridized with
32P-labeled 3′ fragment of MsNHX1. B: southern blot analysis of
MsNHX1 in alfalfa genome. Genomic DNAs from Medicago sativa
leaves (15 µg) was digested with EcoRⅠ and EcoR , respectively Ⅴ
and hybridized with 32P-labeled 3′ fragment of MsNHX1.

ura3-1)。MsNHX1在ATX3中的表达可以明显促进转
化子在含有 50 mmol L−1 NaCl的YPD培养基上的生
长(图 4), 表明MsNHX1与酵母Na+/H+逆向转运蛋白
ScNHX1具有一定的功能相似性[25]。

图 4 在酵母Na+/H+逆向转运蛋白突变体中表达MsNHX1能抑
制突变体对盐的敏感性
Fig. 4 Expression of MsNHX1 in yeast nhx1 mutant
MsNHX1连入酵母表达载体pYES2并被转入酵母突变体ATX3, 未
转化的以及转入空载体的酵母突变体作为对照。2 µL酵母菌液依次
稀释 10倍点在添加和没有添加 50 mmol L−1 NaCl的YPD培养基(1%
酵母提取物, 2%蛋白胨和 2% D-葡萄糖)上, 30℃培养 48 h以上。
The complete MSNHX1 was subcloned into pYES2. The pYES2
empty vector and pYES2-MsNHX1 construct were transformed into
ATX3 (∆nhx1). The mutant strain ATX1 is used as the control. 2
µL saturated yeast solutions or 10-fold serial dilutions were spotted
onto YPD (1% Yeast extract, 2% Peptone and 2% D-Galactose)
plates with or without 50 mmol L−1 NaCl. The plates were grown at
30 for 48 h.℃

2.4 异源表达 MsNHX1 提高转基因拟南芥的耐
盐能力
为了研究MsNHX1 在植物体中的功能, 我们构
建了表达载体pBI121-35S-MsNHX1并转化拟南芥。
对转基因T1代植株进行基因组PCR检测, 有 6 个转

562 作 物 学 报 第 34卷

基因株系可以扩增出目的片段(1.84 kb)(图 5-A), 而
野生型拟南芥中检测不到相应条带。设计特异引物
利用RT-PCR方法进一步检测外源基因的表达情况。
如图 5-B所示, 其中转基因株系TL1、TL4 和TL6 中
能检测到较强的表达信号, 说明MsNHX1 在这 3 个
转基因株系中的表达水平较高。

图 5 转基因拟南芥的 PCR和 RT-PCR检测
Fig. 5 PCR and RT-PCR analysis of transgenic Arabidopsis plants
A: 以T1代转基因植株和野生型对照的叶片基因组为模板进行基
因组PCR检测。P, 阳性对照, 含有 0.1 µg pBI121-MsNHX1表达
载体; TL1~TL6, 不同的转基因株系 1~6; WT, 野生型拟南芥为
阴性对照; M, DNA marker DL-2000。B: 转基因拟南芥的RT-PCR
分析。分别从T1转基因及非转基因植株中提取总RNA反转录作为
PCR分析的模板。
A: Genomic DNA as templates for PCR analysis was extracted from
leaves of T1 transgenic and non-transgenic plants. P, Positive
control, 0.1 µg expression vector PBI121-MsNHX1; TL1–TL6, the
transgenic lines 1–6; WT, Wild-type Columbia plants as negative
control; M, DNA marker DL-2000. B: RT-PCR analysis of MsNHX1
expression in transgenic plants. Total RNA was isolated from T1
transgenic and non-transgenic.

将TL1(转基因株系 1)株系T3代纯合系的转基因
种子和野生型种子一起播种在含不同NaCl浓度的
GM培养基上, 在短日照放置 20 d左右观察它们的
生长情况。在不含NaCl的GM培养基上, 转基因和野
生型植株生长状况良好。在含 100 mmol L−1 NaCl的
GM培养基上 , 野生型植株生长较弱而转基因植株
生长良好。在含 200 mmol L−1 NaCl的GM培养基上,
野生型植株在 20 d左右大部分已死亡, 转基因植株
虽然生长较弱但仍能继续生长(图 6-A)。
将转基因的种子和野生型种子播种在GM培养
基上, 7 d后选择生长健壮的幼苗移栽至盛满基质的
营养钵中, 浇灌 200 mmol L−1 NaCl溶液, 约 1个月
后 , 野生型植株生长都逐渐停止 , 叶片黄化 , 植株
矮小, 最终枯萎死亡。而转基因植株能够开花结果,
完成正常的生活史(图 6-B)。

图 6 转基因和野生型拟南芥植株耐盐性分析
Fig. 6 Salt tolerance analysis of the wild-type and transgenic
Arabidopsis plants overexpressing MsNHX1
A: T3代的纯合系转基因拟南芥和野生型拟南芥种子在含 0、100
和 200 mmol L−1 NaCl的GM培养基上生长 20 d; B: 200 mmol L−1
NaCl溶液处理转基因和野生型拟南芥植株 30 d。
A: The seed germination of the wild-type Arabidopsis (WT) and T3
generations of TL1 (T) after 20 days on GM medium containing 0,
100, and 200 mmol L−1 NaCl. B: The growth of T3 generation
transgenic plants (T) and wild-type plants (WT) irrigated with 200
mmol L−1 NaCl for 30 days.

2.5 盐胁迫处理对转基因和野生型拟南芥生理
指标的影响
为了检测盐胁迫对转基因植株光合机构的影响,
我们测定了盐胁迫下TL1 株系T3代的转基因植株和
野生型植株的放氧活性。盐胁迫处理前转基因和野
生型植株的放氧活性并没有显著的差别。NaCl处理
后, 转基因和野生型植株光合速率都下降但野生型
下降的更明显(图 7-A), 表明在盐胁迫下TL1转基因
株系的光系统Ⅱ受到更好的保护。
渗透调节能力大小是反映植物耐逆能力的一项
重要指标, 对于细胞膨压的维持具有重要意义[26-27]。
NaCl处理 3 d后, 我们发现与野生型对照相比TL1转
基因株系具有更强的渗透调节能力(图 7-B)。
丙二醛(MDA)作为膜质过氧化作用的主要产物
之一, 在盐胁迫条件下有大量积累[28]。胁迫处理后
细胞内的MDA水平直接反应了细胞的抗氧化活性。
NaCl处理 24 h和 48 h后, 野生型和转基因拟南芥的
MDA含量皆有增加 , 但是转基因植株的MDA含量
增加缓慢(图 7-C)。
3 讨论
高盐胁迫是影响植物生长和农作物产量的主要
非生物逆境之一。为了减轻盐胁迫的伤害, 植物进
化出不同的机制来限制Na+的摄取, 或者将过量的
第 4期 安宝燕等: 紫花苜蓿 Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的耐盐性 563


图 7 盐胁迫处理对TL1转基因株系和野生型植株生理指标的影响
Fig. 7 Physiological analysis of TL1 and wild-type plants under
salt treatment
A: 200 mmol L−1 NaCl处理对TL1转基因株系和野生型植株放氧
活性的影响; B: 200 mmol L−1 NaCl处理对TL1转基因株系和野生
型植株叶片的渗透调节能力的影响; C: 200 mmol L−1 NaCl处理
对TL1转基因株系和野生型植株MDA含量的影响; 图中的数据
为 5个重复的平均值±SE。
A: photosynthetic oxygen evolution of the TL1 and wild-type plants
treated with 200 mmol L−1 NaCl; B: leaf osmotic adjustment capa-
city of the TL1 and wild-type plants treated with 200 mmol L−1 NaCl;
C: the MDA contents of the TL1 and wild-type plants treated with 200
mmol L−1 NaCl. Each value is the mean of five measurements ±SE.

Na+转移到到液泡中。从而避免过多Na+在胞质内的
积累, 维持渗透平衡。Na+/H+逆向转运蛋白在这一过
程中起关键作用。紫花苜蓿作为一类重要的豆科牧
草是具有中度的耐盐能力, 因此研究紫花苜蓿的耐
盐机制对耐盐育种工作具有重要的指导意义。本研
究首次从紫花苜蓿中分离到一个液泡型Na+/H+逆向
转运蛋白基因。序列分析表明, MsNHX1与拟南芥质
膜型Na+/H+逆向转运蛋白AtSOS1[24]的序列同源性
很低, 不同来源的Na+/H+逆向转运蛋白的聚类分析
结果说明MsNHX1 可能是液泡型Na+/H+逆向转运蛋
白[6,8,10]。进一步的研究发现, MsNHX1 与绿色荧光
蛋白的融合蛋白定位在洋葱表皮的液泡膜上, 这可
以进一步地确认MsNHX1 是液泡膜Na+/H+逆向转运
蛋白。
Northern 杂交结果显示, MsNHX1 基因的表达
受盐诱导而且其表达模式与水稻、拟南芥和棉花液
泡膜Na+/H+逆向转运蛋白相似[6,10,30], 据此推测该蛋
白可能与紫花苜蓿的耐盐能力有关。MsNHX1 可以
部分互补酵母nhx1 突变体的盐敏感表型 , 说明
MsNHX1 的确参Na+的运输并且在植物的耐盐过程
中起重要作用。此外, 在拟南芥中表达MsNHX1可以
明显提高转基因植株的耐盐能力。生理指标测定结
果表明表达MsNHX1 可以提高转基因植株在盐胁迫
下渗透调节能力, 降低膜质的过氧化作用。以上研
究结果充分显示MsNHX1 是紫花苜蓿耐盐过程中一
个重要的功能蛋白。
4 结论
本研究首次从紫花苜蓿中分离到一个液泡
Na+/H+逆向转运蛋白基因MsNHX1, 具有Na+转运活
性。MsNHX1的表达受到盐胁迫的诱导, 在拟南芥中
表达该基因可以提高转基因株系的耐盐能力。

致谢: 感谢西班牙 Consejo Superior de Investigaciones
Científcas的 José M. Pardo博士提供了酵母 AXT3突变
体。感谢山东农业大学王洪刚教授惠赠紫花苜蓿
(Medicago sativa)种子。本研究得到了国家转基因植物
研究与产业化开发专项项目(JY-03-A-02)和国家高技
术研究发展计划(863 计划)项目(2004AA212131)的
支持。
References
[1] Vinocur B, Altman A. Recent advances in engineering plant
tolerance to abiotic stress: achievements and limitations. Curr
Opin Biotechnol, 2005, 16: 123−132
[2] Zhu J K. Plant salt tolerance. Trends Plant Sci, 2001, 2: 66−71
[3] Blumwald E, Aharon G S, Apse M P. Sodium transport in
plant cells. Biochim Biophys Acta, 2000, 1465: 140−151
[4] Hasegawa P M, Bressan R A, Zhu J K, Bohnert H J. Plant
cellular and molecular responses to high salinity. Annu Rev
Plant Physiol Plant Mol Biol, 2000, 51: 463−499
[5] Xiong L, Zhu J K. Salt tolerance. In: Somerville C,
Meyerowitz E. The Arabidopsis Book. American Society of
Plant Biologists, Rockville, MD, DOI: 10.1199/tab.0009,
2002, http://www.aspb.org/publications/arabidopsis/
[6] Apse M P, Aharon G S, Snedded W A, Blumwald E. Salt
tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+
antiporter in Arabidopsis. Science, 1999, 285: 1256−1258
[7] Yokoi S, Quintero F J, Cubero B, Ruiz M T, Bressan R A,
Hasegawa P M, Pardo J M. Differential expression and
function of Arabidopsis thaliana NHX Na+/H+ antiporters in
the salt stress response. Plant J, 2002, 30: 529−539
[8] Fukuda A, Nakamura A, Tanaka Y. Molecular cloning and
expression of the Na+/H+ exchanger gene in Oryza sativa.
Biochim Biophys Acta, 1999, 1446: 149−155
[9] Hamada A, Shono M, Xia T, Ohta M, Hayashi Y, Tanaka A,
Hayakawa T. Isolation and characterization of a Na+/H+
antiporter gene from the halophyte Atriplex gmelini. Plant

564 作 物 学 报 第 34卷

Mol Biol, 2001, 46: 35−42
[10] Wu C A, Yang G D, Meng Q W, Zheng C C. The cotton GhNHX1
gene encoding a novel putative tonoplast Na+/H+ antiporter
plays an important role in salt stress. Plant Cell Physiol, 2004,
45: 600−607
[11] Kagami T, Suzuki M. Molecular and functional analysis of a
vacuolar Na+/H+ antiporter gene of Rosa hybrida. Genes
Systems, 2005, 80: 121−128
[12] Yang Q-C(杨青川 ), Sun Y(孙彦 ), Kang J-M(康俊梅 ).
Research on the advancement of salt gene in Alfalfa. Acta
Agrectir Sin(草地学报), 2005, 13(3): 253−256 (in Chinese
with English abstract)
[13] Yang Q-C(杨青川), Sun Y(孙彦), Su J-K(苏加楷), Geng
H-Z(耿华株 ), Guo W-S(郭文山 ). The proceedings of
studying on alfalfa salt tolerant breeding and genitic basis.
Grassland China(中国草地), 2001, 23(1): 59−62 (in Chinese
with English abstract)
[14] Clarke M C, Wei W, Lindsey K. High-frequency
transformation of Arabidopsis thaliana by Agrobacterium
tumefaciens. Plant Mol Biol Rep, 1992, 10: 178−189
[15] Zhao X Y, Liu M S, Li J R, Guan C M, Zhang X S. The wheat
TaGIL, involved in photoperiodic flowering, encodes an
Arabidopisis GI ortholog. Plant Mol Biol, 2005, 58: 53−64
[16] Delloporta S L, Wood J, Hicks J B. A plant DNA
minipreparation: version II. Plant Mol Biol Rep, 1983, 4:
19−21
[17] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd edn. New York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989
[18] Elble R. A simple and efficient procedure for transformation
of Yeast. Biotechniques, 1992, 13: 18−20
[19] Nass R, Rao R. The yeast endosomal Na+/H+ exchanger,
NHX1, confers osmotolerance following acute hypertonic
shock. Microbiology, 1999, 145: 3221−3228
[20] Steven J, Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified
method for Agrobacterium-mediated transformation of
Arabidopsis thaliana. Plant J, 1998, 16: 735−743
[21] Walker D A. The Use of Oxygen Electrode and Fluorescence
Probes in Simple Measurements of Photosynthesis. Robert
Hill Institute, University of Sheffield, Sheffield, UK, 1990. pp
163−196
[22] Verslues P E, Bray E A. LWR1 and LWR2 are required for
osmoregulation and osmotic adjustment in Arabidopsis. Plant
Physiol, 2004, 136: 2831−2842
[23] Zhao S-J(赵世杰), Dong X-C(董新纯). Laboratory Manual of
Plant Physiology(植物生理学实验指导 ). Beijing: China
Agriculture Press, 1998(in Chinese)
[24] Shi H Z, Ishitani M, Kim C, Zhu J K. The Arabidopsis
thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+
antiporter. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, 2000, 97: 6896−6901
[25] Quintero F J, Blatt M R, Pardo J M. Functional conservation
between yeast and plant endosomal Na+/H+ antiporters. FEBS
Lett, 2000, 471: 224−228
[26] Bajji M, Lutts S, Kinet J M. Water deficit effect on solution
contribution to osmotic adjustment as a function of leaf
ageing in three durum wheat (Triticum durum Desf) cultivars
performing differently in arid conditions. Plant Sci, 2001, 160:
669−681
[27] Shangguan Z P, Shao M G, Dyckmans J. Interaction of
osmotic adjustment and photosynthesis in winter wheat under
soil drought. J Plant Physiol, 1999, 154: 753−758
[28] Hodges D M, DeLong J M, Forney C F, Prange R K.
Improving the thiobarbituric acid-reactive-substances assay
for estimating lipid peroxidation in plant tissues containing
anthocyanin and other interfering compounds. Planta, 1999,
207: 604−611
[29] Bartels D, Sunkar R. Drought and salt tolerance in plants. Crit
Rev Plant Sci, 2005, 24: 23−58
[30] Fukuda A, Nakamur A, Tagiri A, Tanaka H, Miyao A,
Hirochika H, Tanaka Y. Function, intracellular localization
and the importance in salt tolerance of a vacuolar Na+/H+
antiporter from rice. Plant Cell Physiol, 2004, 45: 146−159