全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(6): 968−978 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2006CB10160)，国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A113)和引进国际先进
农业科学技术计划(948计划)项目(2006-Q04)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 栒李 , E-mail: lixun392007@163.com; Tel: 0731-84618782
第一作者联系方式: E-mail: gm7142005@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2009-10-10; Accepted(接受日期): 2010-03-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00968
利用基因芯片技术研究甘蓝型油菜油酸合成中差异表达基因
官 梅 李 栒 * 官春云
湖南农业大学油料作物研究所, 湖南长沙 410128
摘 要: 采用基因芯片技术对甘蓝型油菜高油酸(71.71%)和低油酸(55.6%)材料进行分析, 探索油酸的差异表达基
因。结果检测到差异表达基因 562个, 其中上调表达基因 194个, 下调表达基因 368个。以基因芯片中油菜上调基因
NM_100489和下调基因 NM_130183为材料, 用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果, 二者完全相符。根据基因芯
片的实验结果, 采用 Go注释系统和数据库查询对 562个差异表达基因进行功能注释表明, 主要为各种酶类、结合功
能、转录调控、代谢等, 还有的功能未知或与糖代谢及脂肪酸合成相关, 其中丙酮酸激酶、果糖二磷酸、酰基传递/
酰基 ACP硫脂酶、作用于酯键的水解酶、Δ9硬脂酰-乙酰载体蛋白去饱和酶(ADS1)、Δ9酰基-油脂减饱和酶 2 (ADS2)、
ω-3脂肪酸减饱和酶(fad3)等被鉴定为差异表达基因。
关键词: 基因芯片; 油菜; 油酸; 差异表达基因
Differentially Expressed Genes in Oleic Acid Synthesis of Brassica napus by
Detected Gene Chip
GUAN Mei, LI Xun*, and GUAN Chun-Yun
Oil Crops Research Institute, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: Oil from rapeseed with high oleic oil content is insensitive to oxidation and long shelf life. In daily diet with high oleic
acid oil can reduce low-density lipoprotein cholesterol levels in blood and prevent arteriosclerosis. In addition, high oleic acid
content in edible oil is an important fat indicator. Oleic acid can be effectively converted to methyl ester, which is beneficial to
produce biodiesel. Oleic acid content in conventional rapeseed is only 17%. However, oleic acid content in low erucic acid rape-
seed reaches around 60%. Differential expressed genes of oleic acid have been found in the high oleic acid line (71.71%) and low
oleic acid line (55.6%) of Brassica napus by gene chip technique. The results showed that there were 562 differential expressed
genes relating to high and low oleic acid contents in rapeseed, among them 194 were up-regulated genes and 368 were
down-regulated genes. The up-regulated gene NM_100489 and the down-regulated gene NM_130183 were then taken as the ma-
terials. Real time RT-PCR was further used to confirm the results of gene chip, and the results of real time RT-PCR analysis
agreed with the results by gene chip. According to the results of gene chip, 562 differentially expressed genes were annotated
functionally using Go Annotation System. The molecular function of differential expressed genes mainly included catalysis of
enzymes, binding, transcriptional regulation, metabolism and others with unknown functions. Some genes related to sugar me-
tabolism and fatty acid synthesis were identified as differential expressed genes. They are pyruvate kinase, fructose diphosphate,
acyl transfer/acyl-ACP S lipase, hydrolase acting on ester bond, Δ9 stearoyl acid-N-carrier protein desaturase (ADS1), Δ9
acyl-lipid desaturase 2 (ADS2), ω-3 fatty acid desaturation enzymes (fad3) and so on.
Keywords: Gene chip; Rapeseed; Oleic acid; Differential expressed genes
甘蓝型油菜籽油中油酸含量高是衡量油脂品质
的一个重要指标, 很多研究表明, 菜籽油中油酸含
量高有很多突出优点: (1) 当精炼、贮藏和煎炸时对
氧化作用不敏感, 货架期较长, 并在加热到较高温
度时油烟少。(2) 食用可降低血液中的低密度脂蛋白
胆固醇的含量。并且在阻止动脉血管硬化中, 具有
单不饱和脂肪酸的油酸比多不饱和脂肪酸更优越。
(3) 有杀死乳腺癌等癌细胞的作用。为了进一步提高
菜籽油的品质, 开展对油菜高油酸研究十分必要[1-11]。
油酸是一种单不饱和脂肪酸, 在低芥酸油菜中,
第 6期 官 梅等: 利用基因芯片技术研究甘蓝型油菜油酸合成中差异表达基因 969


油酸含量既受硬脂酸的影响(因为油酸是硬脂酸经
减饱和后形成的), 又与油酸是否进一步减饱和, 转
化为亚油酸有关。若油酸的减饱和基因(fatty acid
desaturase gene, 简称 FAD)受到抑制或者发生突变,
油酸的含量就会大大提高。对拟南芥 FAD2 突变株
的研究发现, 其根、叶和种子中油酸的含量明显升
高, 而亚油酸与亚麻酸的含量明显降低[7], Taylor等[11]
利用甘蓝型油菜 FAD2 基因的 5′和 3′端的保守区设
计引物 , 通过 RT-PCR 从埃塞俄比亚芥 (Brassica
carinata)中克隆了 FAD2基因(AF124360)。其 mRNA
序列长 1 155 bp, 编码 384个氨基酸残基, 与甘蓝型
油菜(Brassica napus)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)
分别有 88.5%和 85.7%的同源性。据 Spiekermann研
究(转引自 Christian Mollers, 2002)[12], 在 DNA水平
上, FAD2 等位基因分别来自油菜的两个基因组, 一
个来自甘蓝 Brassica oleracea 基因组, 一个来自白
菜 Brassica rapa基因组。在叶绿体中的 FAD6基因
也能促进油酸的减饱和作用, 进而在胞质的内质网
中进行甘油三酯的合成。Hitz 等[13]通过对Δ12 油酸去
饱和酶反义抑制, 使油菜油酸含量上升到 83%, 这
种转基因油菜和一种突变体油菜(其油酸含量 78%)
杂交, 结果培育出油酸含量达 87%的油菜新材料。
Stoutjesdijk 等[14]通过构建携带油酸脱氢酶的共抑制
质粒并转化甘蓝型油菜和芥菜型油菜品种, 通过使
其内源油酸脱氢酶基因沉默而使其油酸含量分别升
高到 89%和 73%。Javidfar 等[15]使用 TO99-5318-20
和 DH12075 杂交的双单倍体群体, 利用 RAPD 和
ISSR 标记和 BSA (bulked segregant analysis)方法,
发现有 6 个标记是与油酸性状相关[16-17]。基因芯片
技术是目前生物技术中最先进的技术之一。用该技
术可以同时分析成千上万个基因 , 获得海量数据 ,
这是其他方法无法比拟的, 目前已得到广泛应用。
本文旨在利用基因芯片手段, 检测甘蓝型油菜高油
酸和低油酸性状的基因差异表达, 并探讨油酸代谢途
径中的重要基因, 为油菜品质改良提供新的途径。
1 材料与方法
1.1 试验材料
高油酸(high oleic acid, 简称 HO)材料, 为湘油
15经 EMS [甲基磺酸乙酯(ethylmesylate), 原液浓度
为 10 mol L–1, 处理浓度为 1.5%]处理获得油酸含量
为 71.71%的突变材料。经 6 代自交和选择, 油酸性
状均能真实遗传。对照材料为低油酸(low oleid acid,
简称 LO)材料, 系未经处理的湘油 15 自交系, 油酸
含量为 55.6%。以上油菜种子均由湖南农业大学油
料作物研究所提供[6,8]。油酸含量均采用气相色谱法
测定。晶芯 29K 拟南芥全基因组寡核苷酸芯片的
Oligo DNA, 购自美国的 Operon 公司, 由北京博奥
生物芯片公司提供。
1.2 总 RNA的提取与纯化
是参照安比奥 (Ambiogen)公司的 plant total
RNA试剂盒提取授粉 27 d的种子中的总RNA, 用于
基因芯片分析。取 5 μL RNA样品用 1.0%琼脂糖凝
胶进行电泳, 以检测 RNA样品的质量。用分光光度
计检测 RNA 的含量和浓度, 总 RNA 的 A260/A280比
值接近 2.0。
1.3 对样品 RNA进行荧光标记
采用博奥公司晶芯 cDNA 扩增标记试剂盒, 对
样品 RNA进行荧光标记。其基本原理是利用标记分
子在特定的波长范围内激发出荧光这一特点, 对含
有标记分子的样本进行检测。本研究使用花青素
(cyanine) Cy3、Cy5进行双色荧光标记, 其激发波长
和发射波长分别为 550 nm/570 nm 和 649 nm/670
nm)。芯片由北京博奥生物芯片公司制备。
1.3.1 cDNA 的合成和纯化 反转录合成第一链
cDNA, 再合成第二链 cDNA; 使用 Nucleospin Ex-
tract II (Cat. No. MN-740609.250)试剂盒纯化 cDNA。
1.3.2 体外转录合成 cRNA 使用 Nucleospin
RNA Clean-up (Cat. No. MN-740948.250)试剂盒纯化
cRNA。
1.3.3 cRNA 定量 取少量 cRNA 使用紫外分光
光度计进行定量。cRNA在 260 nm处有特征吸收峰,
A260 = 40 ng µL–1。
1.3.4 反转录、纯化定量反转录产物 使用
Nucleospin Extract II (Cat. No. MN-740609.250)试剂
盒。此时使用紫外分光光度计定量纯化后的 DNA溶
液。DNA溶液在 260 nm处有特征吸收峰, A260=40 ng
µL–1。一般 2 µg cRNA反转录可得到近 1 µg的DNA。
1.3.5 标记 将纯化后反转录得到的 DNA 真空
浓缩到 14 µL。加入 4 µL Random Primer, 混匀。95℃
反应 3 min, 冰浴 5 min; 依次加入试剂 5×Klenow
buffer 5 µL, Cy5-dCTP (或 Cy3-dCTP) 1 µL, Klenow
Fragment 1.2 µL, 混匀, 37℃反应 1.5 h, 70℃反应 5
min, 冰浴 5 min。反应结束后, 准备纯化。
使用 Nucleospin Extract II (Cat. No. MN-740609.
250)试剂盒: ①定量纯化后产物。产物中核酸在 260
nm 处有特征吸收峰, A260=40 ng µL–1, 一般可得到
1.7 µg左右的核酸。②掺入荧光物质量。Cy3-dCTP
970 作 物 学 报 第 36卷

在 550 nm处有特征吸收峰, 掺入量(pmol) = A550×洗
脱体积(µL)/0.15, 一般可以得到近 80 pmol。Cy5-
dCTP 在 650 nm 处有特征吸收峰, 掺入量(pmol) =
A650×洗脱体积(µL)/0.25, 一般可以得到近 70 pmol。一
般标记产物中荧光物质的量在70~80 pmol左右即可满
足 75 mm×25 mm点阵的杂交。可以根据杂交芯片点
阵的实际面积取不同量的 cRNA做反转录和标记。
1.4 基因芯片杂交
将标记的 DNA 溶于 80 µL 杂交液 (3×SSC,
0.2%SDS, 5×Denhart’s 液中, 25%甲酰胺)于 42℃杂
交过夜; 杂交结束后, 先在 42℃左右含 0.2%SDS,
2×SSC的液体中洗 5 min, 而后在 0.2×SSC中室温洗
5 min, 玻片甩干后即可用于扫描。
1.5 基因芯片扫描
用 LuxScan 10KA 双通道激光扫描仪(CapitalBio
公司)对芯片进行扫描。实验组和对照组的基因表达
差异直接从两种染料的比值中得到。使用的双色荧
光标记, Cy3 用绿色图像表示(激发波长为 532 nm),
Cy5 用红色图像表示(激发波长为 635 nm)。样品油
菜高油酸用 Cy3 标记, 低油酸用 Cy5 标记。每个基
因点的最终色彩由两种颜色的比率而决定。红色为
下调基因, 绿色为上调基因; 如果最终基因点的颜
色为黄色, 则该基因在两种样本的表达量相同, 该
基因没有显著变化。
1.6 实时荧光定量分析
以基因芯片中油菜上调基因 NM_100489 和下
调基因 NM_130183为材料, 用实时荧光定量分析来
验证基因芯片的结果(由博奥生物芯片有限公司制
备)。提取样本 Total RNA并进行 Total RNA质检。
以 DNase I消化基因组 DNA。纯化 Total RNA, 验证
Total RNA纯化效果, 用纯化后的 Total RNA作为模
板对看家基因进行 PCR, 需做阴性对照(不加模板)
和阳性对照(已知的 cDNA)。进行 RNA 逆转录和
Real-time PCR。本实验使用的是晶芯 SuperGreen荧
光定量 PCR通用试剂盒 II。
1.7 生物信息学分析
差异表达基因的功能注释, 登录 http://bioinfo.
capitabio.com/mas/, 对差异表达基因相关生物学信
息进行分析, 以确定该位点的基因功能。利用 http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/进行数据库查询 , 找到与脂
肪酸密切相关的差异表达基因。
2 结果与分析
2.1 油菜总 RNA的质检
在基因芯片杂交中, RNA 的质量直接影响标记
效率和实验的成功率, 要获得高质量的 RNA, 样本
的选择十分重要, 样本必须保持新鲜, 且具有代表
性。本研究是取油菜授粉后 27 d的种子, 分别提取
高油酸油菜和低油酸油菜的总 RNA。其质量都较为
理想, RNA电泳条带清晰, 28S比 18S rRNA条带亮
度大于 1∶1, A260/A280的吸光度比值在 1.9~2.1之间,
RNA的质量和数量完全符合后续芯片实验要求(表 1
和图 1)。

表 1 高油酸油菜和低油酸油菜的总 RNA
Table 1 Total RNA of high oleic acid rapeseed (H) and low oleic acid rapeseed (L)
样品编号
Sample No.
样品状态
Sample state
A260 A260/A280 A260/A230
总量
Total (μg μL–1)
浓度
Concentration (μg)
电泳结果
Electrophoresis results
H 75% ethanal 30.564 2.00 2.12 1.22 36.1 RNA available
L 75% ethanal 36.551 1.91 1.67 1.46 43.3 RNA available



图 1 高油酸油菜和低油酸油菜的总 RNA电泳图
Fig. 1 Electrophoretic image of total RNA for rapeseed varie-
ties with high oleic acid and low oleic acid
1: 高油酸油菜; 2: 低油酸油菜; M: 电泳对照(Hela细胞 RNA)。
1: high oleic acid rapeseed; 2: low oleic acid rapeseed; M: CK
(Hela RNA).
2.2 杂交芯片图像
杂交芯片显示共有 31 200 个点, 平均每个区
(block)约 650个点, 包括样品点、阳性对照点和阴性
对照点, 芯片上所有样点的位置是由 block、row、
column三个坐标决定的(图 2)。
2.3 杂交芯片信息提取和差异表达基因的筛选
对芯片扫描后的图像采用 LuxScan3.0图像分析
软件, 把图像信号转化为数字信号。根据这些原始
信号值进行后续的数值分析。为了校正 Cy5、Cy3
标记体系间的系统误差, 还要将所得的数据通过软
件进行归一化处理, 其中 Ratio 值为 Lowess 归一化
第 6期 官 梅等: 利用基因芯片技术研究甘蓝型油菜油酸合成中差异表达基因 971




图 2 基因芯片杂交伪色图
Fig. 2 Pseudo-color map of gene chip hybridization
整个点阵分成 48个亚阵, 每个亚阵有 25列、26行。图中共显示 31 200个点, 红色点为下调基因(Ratio<0.5), 绿色点为上调基因
(Ratio>2.0), 黄色点则为基因在油菜高油酸和低油酸两样本的表达量相同, 基因没有显著变化。
The entire array is divided into 48 subarrays. Each subarray is in 25 columns and 26 rows. A total of 31 200 points are displayed in the figure.
The red point represents down-regulated gene (Ratio<0.5). The green point represents up-regulated gene (Ratio>2.0). The yellow point rep-
resented that the gene has the same expression in high oleic acid and low oleic acid in rapeseed.
972 作 物 学 报 第 36卷

以后的结果。获得了油菜高油酸和低油酸“all data”
的数据共 31 200个(Ratio=H/L), “Checked genes”是
检测到的有效基因共 10 243个, 删除了荧光信号弱
的基因以及芯片上的阳性对照、阴性对照、外标等
冗余数据。筛选表达差异基因的方法是倍数法, 比
值(Ratio=实验组基因荧光强度值 /对照组基因荧光
强度值)大于 2.0 或者小于 0.5 即认为是表达有差异,
大于 2.0的是上调表达的基因, 小于 0.5的是下调表
达的基因。结果表明, 差异表达基因共 562个, 其中
上调表达基因共 194个, Ratio=14.595的 1个; Ratio=
11.2852的 1个; Ratio=9.728的 1个; Ratio值为 5~8
的 12个, Ratio值为 3~4的 36个, Ratio值在 2.0013~
2.9595的 139个, 下调表达基因共 368个, Ratio值均
分布在 0.0713~0.4996之间。
从图 3 可以比较直观地看出在两个样品之间基
因表达的差异。其中 X轴和 Y轴分别为两个样品的
荧光信号强度, 图中每一个数据点代表芯片上一个
基因点的杂交信号, 红色标记和绿色标记分别表示
B/A的 Ratio值≥2.0和≤0.5的数据点, 属于表达有
差异的基因, 黑色标记表示 B/A的 Ratio值在 0.5和
2.0之间, 表达基本无差异。
2.4 实时荧光定量分析(Real-time PCR)的验证
任意取上调基因 NM_100489 和下调基因 NM_
130183来进行实验, 其结果如图 4~图 7和表 2。
图 8 说明从电泳图结果可以看出 , Real time


图 3 样品 A和 B的比较分析散点图
Fig. 3 Scatter plots of comparison of sample A and B
横轴(X轴)表示低油酸的荧光信号强度, 纵轴(Y轴)表示高油酸
的荧光信号强度, 红色标记和绿色标记表示表达有差异的基因,
黑色标记表示这些基因表达基本无差异。
“Intensity_L” on the X-axis represents the fluorescence intensity of
low oleic acid. “Intensity_H” on the Y-axis represents the fluores-
cence intensity of high oleic acid. The red points and the green
points represent differentially expressed genes. The black points
represent gene expression almost indifferently.

RT-PCR反映特异性都很好, 说明 Real time RT-PCR
与表达谱芯片结果完全相符。
2.5 差异表达基因的功能注释
根据基因芯片的实验结果, 采用 Go 注释系统
和数据库查询对油菜油酸 562 个差异表达基因进行


图 4 目标基因 NM_100489-Q扩增曲线图
Fig. 4 Amplification curves of target gene NM_100489-Q
横轴 Cycle number 表示 Real time RT-PCR反应的循环数, 纵轴 Florescence(F1)表示对应循环的实时荧光强度, 颜色与标识图中曲线的
颜色一一对应。
Amplification curves of target gene NM_100489-Q. “Cycle number” on the X-axis represents the number of reaction cycles for real time
RT-PCR. “Florescence (F1)” on the Y-axis represents the Real-time fluorescence intensity relevant to the reaction cycle. The colors in the left
column correspond to those of the curves.
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图 5 目标基因 NM_100489-M溶解曲线图
Fig. 5 Dissolved curves of target gene NM_100489-M
横轴 Temperature表示 Real time RT-PCR产物的 Tm值, 纵轴 Florescence-d(F1)/dT表示升温时实时荧光强度的变化。曲线一个波峰表
示一个 PCR产物。不同颜色对应于不同的 PCR反应。曲线的颜色与标识图曲线的颜色一一对应。若出现多个明显的波峰, 则表示可
能有非特异性扩增, 一个波峰说明没有非特异性扩增。
Dissolved curves of target gene NM_100489-M. “Temperature” on X-axis represents the melting temperature (Tm) of the product, and “Fluo-
rescence-d(F1)/dT” on the Y-axis represents the speed of fluorescence intensity change with increasing temperature. Each peak of curves
represents one PCR product. Each PCR reaction was marked with a different color. More than one obvious peak suggests the occurrence of
non-specific amplification. In the present study, only one peak was observed, indicating that non-specific amplification did not occur. The
colors in the left column correspond with those of the curves.


图 6 目标基因 NM_130183-Q扩增曲线图
Fig. 6 Target gene NM_130183-Q amplification curves
纵、横轴的意义同图 4。The meaning of the X-axis and the Y-axis is the same as Fig. 4.

功能注释。差异表达基因的分子功能主要为各种酶
类、结合功能、转录调控、代谢功能。还筛选出一
些尚未在 GenBank 上登录的序列, 推测是未知的新
基因, 这些基因在油菜油酸形成过程中所起的作用
还需进一步研究。说明油酸基因的表达不是某个基因
孤立、单一的, 而是多方面、多层次共同作用的结
果[1-10]。在表 3中列出了一些与糖代谢以及脂肪酸合
成相关的重要基因 [18-21], 如丙酮酸激酶、果糖二
磷酸、酰基传递/酰基 ACP 硫脂酶、Δ9 减饱和酶
(ADS1)、作用于酯键的水解酶、Δ9 酰基-油脂减饱
和酶 2(ADS2)、ω-3 脂肪酸减饱和酶(FAD3)等被鉴
定为重要差异表达基因。而 FAD2 基因在本研究表
现无差异, 但硬脂酸(18:0)减饱和形成油酸的 FAD1
基因在表达时明显上调, 即 Δ9 硬脂酰-乙酰载体蛋
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图 7 目标基因 NM_130183-M溶解曲线图
Fig. 7 Target gene NM_130183-M dissolved curves
纵、横轴的意义同图 5。The meaning of the X-axis and the Y-axis is the same as Fig. 5.

表 2 油菜差异表达上调基因NM_100489和下调基因NM_130183 Real time RT-PCR的数据分析
Table 2 Data analysis of Real time RT-PCR for differentially expressed genes from rapeseed
编号
No.
样品名
Name
Crossing
point
ΔCP
(内参基因-目标基因)
ΔCP (references
genes-target gene)
目标基因相对于内参基因的
表达丰度及平均值
The abundance of target gene
relative to the reference gene
expression (%) and average
SD Ratio=H/L P-value
1 L-ACT2 26.93
2 L-ACT2 26.95
3 L-ACT2 26.88
4 H-ACT2 26.60
5 H-ACT2 26.50
6 H-ACT2 26.45
7 L-NM_100489 27.72 –0.79 57.83
8 L-NM_100489 27.75 –0.80 57.43 56.53 1.92
9 L-NM_100489 27.76 –0.88 54.33
10 H-NM_100489 26.29 0.31 123.97
11 H-NM_100489 26.10 0.40 131.95 124.13 7.74 2.20 0.00013
12 H-NM_100489 26.23 0.22 116.47
13 L-NM_130183 31.07 –4.14 5.67
14 L-NM_130183 30.96 –4.01 6.21 5.89 0.28
15 L-NM_130183 30.99 –4.11 5.79
16 H-NM_130183 32.25 –5.65 1.99
17 H-NM_130183 32.39 –5.89 1.69 1.74 0.23 0.295 3.7E–05
18 H-NM_130183 32.46 –6.01 1.55
Crossing point (CP): 反应的实时荧光强度显著大于背景值时的循环数; ΔCP: 内参基因–目标基因, 例如: 26.93–27.72= –0.79; SD:
标准差; Ratio=H/L, 如: 124.13/56.53=2.20, 上调基因 NM_100489; 1.74/5.89=0.30, 下调基因 NM_130183。
Crossing point (CP): number of cycle when Real-time fluorescence intensity was significantly greater than the background value; ΔCP:
reference genes-target gene, for example: 26.93–27.72= –0.79; SD: standard deviation, Ratio=H/L, for example: 124.13/56.53=2.20,
up-regulated genes NM_100489; 1.74/5.89=0.30, down-regulated genes NM_130183.
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图 8 Real time RT-PCR产物检测
Fig. 8 Detection of Real time RT-PCR Products
1~2: ACT2基因; 3~4: NM_100489基因; 5~6: NM_130183基因。
M: DL2000, 条带大小(从下至上 100、250、500、750、1000和
2000 bp)。
1–2: ACT2 gene; 3–4: NM_100489 gene; 5–6: NM_130183 gene.
M: DL2000, band size (from bottom to top): 100, 250, 500, 750,
1000, and 2000 bp)。

白去饱和酶 (ADS1)在表达时明显上调 , Ratio 为
3.7227, 这个基因可催化硬脂酰 -ACP 形成油酸
(18:1Δ9), 增加油酸含量, 推测这一途径在油菜中与
高油酸这些差异表达基因将在油酸合成中也发挥重
要作用。
3 讨论
基因表达分析的基础是基因在生命活动过程中
有许多变化, 由于基因表达与功能特异性一致, 因
而能够根据基因功能在某个特定生理阶段的上调和
下调变化来推导基因功能[2]。本研究采用基因芯片
技术构建油酸基因表达谱数据库。获得了差异表达
基因 562个, 其中上调表达基因 194个, 下调表达基
因 368 个。并用实时荧光定量方法验证了基因芯片
的结果, 其结果与基因芯片一致。
油菜油酸合成中差异表达基因中的重要基因 ,
如丙酮酸激酶(NM_115439)在表达时的上调(Ratio
值为 2.0421)是很有意义的。因为油酸合成的主要碳
源是蔗糖, 在糖酵解的代谢过程中, 丙酮酸激酶催
化磷酸烯醇式丙酮酸生成 ATP 和丙酮酸, 控制着丙
酮酸的外流量。而后丙酮酸生成乙酰 CoA, 这是脂
肪酸合成的前体, 在乙酰 CoA 羧化酶作用下生成丙
二酰 CoA, 这是脂肪酸合成中的第一个关键步骤。
因此, 丙酮酸激酶的基因上调, 将影响整个脂肪酸
代谢过程。在拟南芥中, 有 14个已鉴定的基因编码
丙酮酸激酶, 这在很大程度上增加了调控丙酮酸激
酶基因的表达和活性的多样性[22]。丙酮酸激酶主要
参与两大代谢的调节, 一是糖酵解途径; 二是遗传
物质代谢, 催化磷酸基团的互换。Schwender 等[23]
通过稳定同位素标记蓖麻胚胎证明有 90%葡萄糖通
过糖酵解转化成丙酮酸, 印证了糖酵解途径在植物
体中的重要性。又如酰基-ACP硫脂酶(NM_100724)
是脂肪酸代谢途径关键酶, 主要决定游离脂肪酸的
种类和链长, 表达时上调(Ratio 值为 4.8057), 它是
一种终止脂肪酸合成的酶。基本功能是将 acyl-ACPs
水解成游离脂肪酸和 ACP, 从而终止脂肪酸从头合
成途径中脂肪酸链的延长。脂酰-酰基载体蛋白硫酯
酶具有不同的底物特异性, 直接决定细胞油脂中的
脂肪酸的种类和数量 , 其产物主要是硬脂酸(18:0)
和棕榈酸(16:0), 与油酸合成密切相关。因此该酶在
脂肪代谢中就有着极为重要的作用, 可利用该酶直
接决定脂肪酸从头合成途径中脂酰基链的长度, 通
过基因工程改造油菜脂肪酸组成[24]。差异表达基因
FAD3 (fatty acid desaturase)属于 ω-3类, 位于内质网
上 , 在脂肪链中引入第 3 个双键 , 在表达时下调
(Ratio 值为 0.4865), 会引起亚油酸含量增加, 亚麻
酸含量减少, 所以这个基因对决定脂肪酸组成是很
重要的。del Rio-Celestino等[25], 用高油酸 L-2890X
标准系 C101 的埃塞俄比亚芥的 F2群体分析与其他
脂肪酸的关系表明, 油酸含量与亚油酸 C18:2 含量
呈正相关(r = 0.81, P＜0.01)。说明油酸含量增加, 亚
油酸含量也增加, 并不如前所说亚油酸含量减少。
所以 FAD3 在表达时下调, 也有利于油酸含量的提
高。而 FAD2 基因在本研究表现无差异, 但硬脂酸
(18:0)减饱和形成油酸的 FAD1基因在表达时明显上
调, 即 Δ9 硬脂酰-乙酰载体蛋白去饱和酶(ADS1)在
表达时明显上调, Ratio 为 3.7227, 这个基因可催化
硬脂酰-ACP形成油酸(18:1Δ9), 增加油酸含量, 推测
这一途径在油菜中与高油酸形成关系更大。这一问
题还有待进一步研究。
本研究结果显示改善糖代谢和脂肪酸代谢, 特
别是关键酶, 对提高油酸的生物合成是十分重要的,
这也为利用基因工程方法改良油菜脂肪酸组成提高
油酸含量提供了重要信息。因此, 基因芯片技术是研
究油菜油酸的高效途径。
4 结论
检测到甘蓝型油菜油酸差异表达基因 562个, 其
中上调表达基因 194 个, 下调表达基因 368 个。差
异表达基因的分子功能主要为各种酶类、结合功能、
转录调控、代谢等, 还有些功能未知或与糖代谢及
976 作 物 学 报 第 36卷

表 3 甘蓝型油菜油酸差异表达基因功能注释(仅选部分列出)
Table 3 Function of differentially expressed genes in rapeseed (only some listed)
上调基因 Up-regulated genes
二磷酸尿核苷磺基异鼠李糖合成酶 UDP sulfoquinovose synthase
activity
蛋白质磷酸化给合氨基酸 Protein phosphorylated amino acid
bind
磷酸氨基咪唑羧化酶 Phosphoribosylaminoimidazole carboxylas 钠离子结合 Sodium ion binding
丙酮酸脱羧酶 Pyrurate decaboxylase activity 甲基-CpG结合 Methy1-CpG binding
转酮酶 Transketolase 蛋白质域特异位点结合 Protein domain specific biding
磷酸化酶 Thosphorylase activity 金属离子结合 Metal ion binding
3-含氢硫基丙酮酸硫转移酶 3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase 鸟苷三磷酸结合 Dan GTPase binding
磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 Phosphopantetheinyltransferase activity 特异序列 DNA结合 Sequence-specific DNA binding
鸟苷酸激酶 Quanylate kinase activity 染色质结合 Chromatin binding
硫代硫酸盐硫转移酶 Thiosulfate sulfurtransferase activity 辅酶结合 Coenzyme binding
乙醛裂合酶 Aldehyde-lyase activity 阳离子结合 Cation binding
1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸-还原酶
1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoi
镁离子结合 Magnesium ion binding
泛酸激酶 Pantothenate kinase activity ATP结合 ATP binding
L-乳酸脱氢酶 L-lactate dehydrogenase 电子载体 Electron carrier activity
肉桂醇脱氢酶 Cinnamyl-alcohol dehydrogenase activity 血红素结合 Heme binding
(胞嘧啶-5)-甲基转移酶 (Cytosine-5)-methyltransferase act 跨膜受体行为 Transmenbrane receptor activity
激酶 Kinase activity 核苷三磷酸盐行为 Nucleoside-trphosphatase activity
氧化还原酶 Oxidoreductase activity acting 催化行为 Catalytic activity
肽酶 Peptidase activity 运输行为 Transporter activity
磷酸葡萄糖酸盐脱氢酶 Phosphogluconate dehydrogenase 加单氧酶行为 Monooxygenase activity
β-呋喃果糖苷酶 β-fructofuranosidase activity 核酸结合 Nucleic acid binding
假尿苷酸合成酶 Pseudouridylate synthase activity 铁离子结合 Iron ion binding
脂肪酶 Lipase activity GTP结合 GTP binding
作用于酯键的水解酶 Hydrolase activity acting on ester bon DNA结合 DNA binding
羧基酯水解酶 Carboxylic ester hydrolase activity 蛋白质结合 Protein binding
蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶 Protein serine/threonine kinase activity 核酸结合 Nucleotide binding
酰基传递/酰基 ACP硫脂酶 Carrier/acyl-ACP thioesterase 锌离子结合 Zinc ion binding
Δ9减饱和酶(ADS1), 氧化还原酶(ADS1) Δ9
desaturase 1,oxidoreductase(ADS1)
钙离子结合 Calcium ion binding
脂肪酶 3类家族蛋白 Lipase class 3 family protein RNA结合 RNA binding
丙酮酸激酶 Pyravate kinase 水解酶行为 Hydrolase activity
下调基因 Down-regulated genes
肉桂醇脱氢酶 Cinnamyl-alcohol dehydrogenase activity 核苷二磷酸激酶活性 Nucleoside diphosphate kinase
醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase activity 脂肪酰-辅酶 A硫酯酶活性 Acyl-COA thioesterase activity
ΔDNA聚合酶 ΔDNA polymerase activity 纤维素合成酶(VDP形成)活性 Cellulose synthase (VDP-forming)
activity
亮氨酸-tRNA连接酶 Leucine-tRNA ligase activity 钾离子转运活性 Potassium ion tansporter activity
果糖二磷酸酶 Fructose-bisphosphatase activity β-呋喃果糖苷酶活性 β-fructofuranosidase activity
tRNA-内含子核酸内切酶 tRNA-intron endonuclease activity 双链 RNA结合 Double-stranded RNA binding
核酮糖-1,5-二磷酸盐羧化酶 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase 核糖核酸酶活性 Ribonuclease activity
Δ9酰基-油脂减饱和酶 2(ADS2) Δ9 acyl-lipid desaturase 2 转录共激活 Transcription coactivator activity
ω-3脂肪酸减饱和酶(FAD3) ω-3 fatty acid desaturase activity (FAD3) 半乳糖基转移酶活性 Galactosyltransferase activity
组蛋白甲基转移酶活性 Histon methyltransferase activity NADH脱氢酶(辅酶 Q) NADH dehydrogenase (vbiquinone)
activity
天冬氨酰类型内切酶活性 Aspartic-tipe endopeptidase activity 转录阻遏活性 Transcription repressor activity

第 6期 官 梅等: 利用基因芯片技术研究甘蓝型油菜油酸合成中差异表达基因 977


(续表 3)
下调基因 Down-regulated genes
二氨基庚二酸扑脱羧酶活性 Diaminopimelate decarboxylase activity 纤维素合成酶活性 Cellulose synthase activity
酶调节活性 Enzyme vequlator activity ATP依赖解螺旋酶活性 ATP-dependent helicase activity
镁鏊合酶活性 Magnesium chelatase activity 转移酶活性 Transferase activity
2个氢原子吡啶二羧还原酶活性 Dihydrodipicolinate reductase activity VDP-糖基转移酶活性 VDP-glycosyltansferase activity
蛋白载体活性 Protein carner activity ATP酶活性 ATPase activity
核酸酶活性 Nuclease activity 转录催化剂 Transeriptional activator activity
辅酶结合 Coenzyme binding 糖结合 Sugar binding
硫醇-二硫化物交换中间体 Thiol-disulfide exchange intermediate 蛋白质转运活性 Protein transporter activity
苯丙氨酸-tRNA连接酶活性 Phenylalanine-tRNA ligase activity 异构酶活性 Isomerase activity
核酮糖-二磷酸扑羧化酶活性 Ribulose-bisphosphate carboxylase
activity
转移酶活性 Iransferase activity
核糖核酸酶活性 Ribonuclease activity

脂肪酸合成相关, 其中丙酮酸激酶、酰基传递/酰基
ACP 硫脂酶、Δ9 硬脂酰-乙酰载体蛋白去饱和酶
(ADS1)上调、ω-3脂肪酸减饱和酶(fad3)下调是形成
油菜高油酸的重要基因。
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